本發(fā)明涉及生物檢測領域，特別是一種卡式蛋白芯片及其應用。

背景技術：

蛋白芯片技術作為近年來發(fā)展起來的一種多指標并行檢測的新興技術，具有高通量，高信息量的特點，在科研和臨床診斷領域具有廣泛的應用前景。但是，由于技術上、成本上的因素，限制了其實際應用，尤其是在臨床診斷領域還沒有得到應有的推廣。目前，低成本、不用復雜昂貴設備、靈敏準確、能迅速作一次多元檢測、操作簡便適用于快速床邊檢測（POCT）的低密度蛋白芯片是蛋白芯片領域的一個重要的研究和發(fā)展方向。

近20年來，以側(cè)向流免疫層析技術、滲濾法、斑點法為代表，研發(fā)生產(chǎn)用于疾病監(jiān)測和診斷的免疫檢測試劑已經(jīng)廣泛應用于快速床邊檢測（POCT），隨著酶顯色、膠體金、膠體硒、熒光微球、化學發(fā)光、量子點和其他更靈敏的標記技術的發(fā)展，快速檢測領域標記技術呈現(xiàn)多樣化趨勢；由于這些技術的成熟應用及其在快速檢測方面應用的優(yōu)勢以及實用性，它們也同樣被應用于蛋白芯片的研究和開發(fā)。

目前，這類型以免疫層析技術、滲濾法、斑點法技術為基礎，以POCT應用為目標的蛋白芯片產(chǎn)品在技術及應用上已經(jīng)有了較大進展，但仍存在有以下缺點：（1）產(chǎn)品質(zhì)量比較容易產(chǎn)生波動，不易進行質(zhì)量控制；（2）同一個產(chǎn)品檢測以單一目標為主，最多同時檢測2-3個指標，多目標檢測容易產(chǎn)生相互干擾；（3）所進行的實驗基本只能進行定性，不能進行定量實驗；（4）對于多目標體系，生產(chǎn)工藝及反應體系調(diào)整難度大。而傳統(tǒng)的載玻片、硅片等作為芯片片基類型的蛋白芯片又存在操作復雜或生產(chǎn)要求高、成本高等因素在應用上受到很多限制。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種卡式蛋白芯片及其應用，基于這種卡式結(jié)構和反應液體垂直方向由下向上的反向擴散導流層析設計，可以設計出多種檢測模式和加樣模式，滿足對不同類型檢測的需求，同時該設計具有快速檢測的特性和可以同時進行多指標檢測的特性，適用于床邊多指標快速檢測（POCT）。

為實現(xiàn)上述技術目的，達到上述技術效果，本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片，包括了外殼殼體、加樣口、結(jié)果判讀窗口、功能墊、反應膜、多孔材料和吸收墊，外殼殼體表面開設有加樣口和結(jié)果判讀窗口，功能墊設置于加樣口下方并與外殼殼體底部的多孔材料相連，反應膜下側(cè)面與多孔材料相互貼合，結(jié)果判讀窗口下方嵌入設置有吸收墊，吸收墊設置于反應膜兩側(cè)或環(huán)繞于四周周側(cè)。

其中，功能墊由加樣過濾墊和多層標記物墊中的一種或多種疊合組成，加樣過濾墊為玻璃纖維，標記物墊為含有示蹤標記物標記的抗原或抗體的玻璃纖維或無紡布。

優(yōu)選的，加樣過濾墊內(nèi)包埋固定有干擾消除劑，干擾消除劑為抗紅細胞抗體或抗IgM抗體，示蹤標記物為熒光微球、量子點、膠體金或酶中的一種。

其中，反應膜為具有上下通孔的膜材料，多孔材料為玻璃纖維、無紡布或尼龍膜中的一種，吸收墊為純棉絨漿濾紙、海綿或高分子吸水紙的一種。

優(yōu)選的，純棉絨漿濾紙克重為270g/m³，吸水量大于950g/m³。

優(yōu)選的，功能墊中還包括輔助反應墊，輔助反應墊為包埋固定有金屬鹽、蛋白質(zhì)或表面活性劑的玻璃纖維或無紡布。

本發(fā)明還公開了一種卡式蛋白芯片的應用，上述的卡式蛋白芯片，應用步驟如下：

a.在反應膜上按照預設的位置分別固定所需檢測抗原或抗體，形成相應的檢測陣列；

b.從加樣口加入待測樣本或待測樣本和稀釋液；

c.待測樣本或待測樣本和稀釋液通過功能墊，并經(jīng)多孔材料向上擴散層析，到達反應膜表面，在反應膜上與檢測陣列發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合；

d.等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應結(jié)束后，通過肉眼或檢測讀數(shù)儀進行檢測結(jié)果讀取。

優(yōu)選的，步驟d還包括：等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應結(jié)束后，從結(jié)果判讀窗口加入示蹤標記反應液，待檢測點形成標記免疫復合物后，通過肉眼或檢測讀數(shù)儀進行檢測結(jié)果讀取。

優(yōu)選的，步驟d還包括：在進行檢測結(jié)果讀取之前，加入洗滌液洗去未結(jié)合在待測點上的反應物。

其中，示蹤標記反應液為熒光微球、量子點、膠體金或酶標記物標記的抗原或抗體溶液。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1.與傳統(tǒng)的側(cè)向流免疫層析蛋白芯片技術相比，該方法的主要特點是多孔性介質(zhì)在蛋白芯片反應膜的正下方，反應膜下側(cè)面與多孔材料相互貼合，反應膜上的蛋白芯片點樣位點全部都在多孔性介質(zhì)的貼合范圍內(nèi)，待測樣本和反應試劑在多孔性介質(zhì)中垂直方向由下向上的反向擴散導流層析，最終均一地到達反應膜，各反應點之間并不會產(chǎn)生相互干擾，并在檢測點上進行免疫反應，降低了因側(cè)向流免疫層析芯片前后反應區(qū)的不均一性,后反應區(qū)會受到前反應區(qū)干擾等因素引起的精密度變差以及漏診概率，更好的符合多指標同時定性、定量準確檢測的需求。

2.與傳統(tǒng)的玻片作為載體的蛋白芯片技術相比，本發(fā)明可以克服載玻片法蛋白芯片操作相對復雜的缺點，操作更加簡單，不需要儀器，最簡化的只要一次加樣就可以完成檢測，更加適用于床邊快速檢測。

3.與滲濾法蛋白芯片相比，可以預先將蛋白探針標記物、抗干擾輔助成分、全血過濾組分等內(nèi)容放置于反應結(jié)構體系內(nèi)，簡化使用者在操作過程中的操作步驟。

4.經(jīng)過合理設計的卡式蛋白芯片對于標記物、添加物和底物的加樣方式也可靈活選擇，除了通過加樣口加入樣本外，通過對功能墊進行設計，增設過濾墊、多層標記物墊和輔助反應墊擴展檢測類型，也可以通過結(jié)果判讀窗口進行檢測劑添加，有利于反應體系的調(diào)整，使反應體系能更容易避開不同反應物之間的干擾達到最優(yōu)狀態(tài)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明卡式蛋白芯片的斷面圖。

圖2為本發(fā)明卡式蛋白芯片的俯視圖。

圖3為本發(fā)明卡式蛋白芯片中功能墊6的局部示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例3中使用蛋白芯片的斷面圖。

圖5為本發(fā)明實施例4中使用蛋白芯片的斷面圖。

主要部件符號說明：

1：外殼殼體，2：吸收墊，3：反應膜，4：多孔材料，5：加樣口，6：功能墊，7：結(jié)果判讀窗口，61：加樣過濾墊，62：標記物墊，63：輔助反應墊，621：上層標記物墊，622：下層標記物墊。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

實施例1

如圖1-3所示，本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片，包括了外殼殼體1、吸收墊2、反應膜3、多孔材料4、加樣口5、功能墊6和結(jié)果判讀窗口7。

結(jié)構設計：

外殼殼體1表面開設有加樣口5和結(jié)果判讀窗口7，功能墊6設置于加樣口5下方并與外殼殼體1底部的多孔材料4相連，結(jié)果判讀窗口7下方嵌入設置有吸收墊2，吸收墊2設置于反應膜3的兩側(cè)或環(huán)繞于四周周側(cè)，反應膜3下側(cè)面與多孔材料4相互貼合。

功能墊6由加樣過濾墊61、多層標記物墊62和輔助反應墊63中的一種或多種疊合組成，加樣過濾墊61為選擇性包埋固定有干擾消除劑的玻璃纖維，干擾消除劑包括了抗紅細胞抗體、抗IgM抗體，標記物墊62為含有示蹤標記物標記的抗原或抗體的玻璃纖維或無紡布，示蹤標記物為熒光微球、量子點、膠體金或酶中的一種，輔助反應墊63為包埋固定有金屬鹽、蛋白質(zhì)或表面活性劑的玻璃纖維或無紡布。

反應膜3為具有上下通孔的膜材料，多孔材料4為玻璃纖維、無紡布或尼龍膜中的一種，吸收墊2為純棉絨漿濾紙、海綿或高分子吸水紙的一種。

其中，純棉絨漿濾紙規(guī)格為克重270g/m³，吸水量大于950g/m³。

使用方法：

a.在反應膜3上按照預設的位置分別固定所需檢測抗原或抗體，形成相應的的檢測陣列；

b.從加樣口5加入待測樣本或待測樣本和稀釋液；

c.等待待測樣本或待測樣本和稀釋液通過功能墊6，經(jīng)多孔材料4向上反向擴散、導流層析與反應膜3上載有的檢測陣列發(fā)生抗原-抗體特異性結(jié)合；

d.等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應結(jié)束后，選擇性從結(jié)果判讀窗口7加入洗滌液；通過肉眼或檢測讀數(shù)儀進行檢測結(jié)果讀取。

實施例2

本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片及其在血液篩查4項檢測中的應用，檢測對象為乙肝表面抗原HBsAg、人類免疫缺陷病毒抗體HIV-Ab、丙型肝炎抗體HCV-Ab、梅毒螺旋體抗體TP-Ab。

在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構如實施例1所述，功能墊6包括了加樣過濾墊61和標記物墊62，兩者材質(zhì)均為玻璃纖維，標記物墊62中包含有標記了熒光微球的表面抗體HBsAb1*、標記了熒光微球的重組人類免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag1*、標記了熒光微球的重組丙型肝炎抗原HCV-Ag1*、標記了熒光微球的重組梅毒螺旋體抗原TP-Ag1*四種膠體金結(jié)合物；多孔材料4為玻璃纖維，反應膜3為不帶襯底的硝酸纖維素膜，以陣列形式固定乙肝表面抗體HBsAb2，重組人類免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag2、重組丙型肝炎抗原HCV-Ag2、重組梅毒螺旋體抗原TP-Ag2；

具體使用方法如下：

b.從加樣口5加入120μL病人血清待測樣本；

c.室溫下反應20分鐘，待測樣本中的反應物質(zhì)由功能墊6順次通過加樣過濾墊61和標記物墊62，血清樣本中可能存在的反應物質(zhì)HBsAg或HIV-Ab或HCV-Ab或TP-Ab與標記物墊62中相應的熒光微球標記的抗原或抗體形成熒光微球標記的第一步免疫復合物HBsAg～HBsAb1*或HIV-Ab～HIV-Ag1*或HCV-Ab～HCV-Ag1*或TP-Ab～TP-Ag1*，熒光微球標記的第一步免疫復合物隨溶液經(jīng)多孔材料4向上擴散，均勻地擴散、層析到達反應膜3表面，在反應膜3的相應檢測點進行免疫反應，形成第二步固定化的熒光微球免疫復合物HBsAb2～HBsAg～HBsAb1*或HIV-Ag2～HIV-Ab～HIV-Ag1*或HCV-Ag2～HCV-Ab～HCV-Ag1*或TP-Ag2～TP-Ab～TP-Ag1*；

d.等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應結(jié)束后，未結(jié)合的血清樣本以及未結(jié)合的熒光微球結(jié)合物通過反應膜3的側(cè)向?qū)游?被吸收墊2吸收，通過肉眼判讀結(jié)果，也可以采用配套的蛋白芯片熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

實施例3

如圖4所示，為了提高檢測的效果，本實施例是在實施例2的基礎上進行了適當改進，在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構如實施例1所述，功能墊6包括了加樣過濾墊61和標記物墊62,其中標記物墊62包括了上層標記物墊621和下層標記物墊622，上層標記物墊621中包含有標記了熒光微球的表面抗體HBsAb1*、標記了熒光微球的重組人類免疫缺陷病毒抗原HIV-Ag1*，下層標記物墊622中包含有標記了熒光微球的重組丙型肝炎抗原HCV-Ag1*、標記了熒光微球的重組梅毒螺旋體抗原TP-Ag1-Au兩種熒光微球結(jié)合物，這樣的組合結(jié)構，減少了4種結(jié)合物在試劑制備時的相互干擾，提高了試劑的穩(wěn)定性和反應性。

在反應步驟d中，等待抗原-抗體特異性結(jié)合反應結(jié)束后，從結(jié)果判讀窗口7加入100μL洗滌液，未結(jié)合的血清樣本和熒光微球標記物以及洗滌液，通過反應膜3的側(cè)向?qū)游龊陀縿?被吸收墊2吸收；

通過肉眼判讀結(jié)果，效果比實施例2的結(jié)果更優(yōu)，信噪比更高，也可以采用配套的蛋白芯片膠體金讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

實施例4

如圖5所示，本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片及其在雙抗體夾心法檢測4種心腦血管疾病相關的蛋白標志物中的應用，檢測對象是D-Dimmer、BNP、S100B、LP-PLA2 4種心腦血管疾病相關標志物。

在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構如實施例1所述，其中功能墊6只包括有加樣過濾墊61，在加樣過濾墊61中，包埋固定了抗人紅細胞單抗，多孔材料4為玻璃纖維，反應膜3為尼龍膜，以陣列形式分別固定4種心腦血管疾病相關的蛋白標志物抗體。

具體使用方法如下：

b.從加樣口5加入80μL病人全血待測樣本，全血樣本中的紅細胞與加樣過濾墊61中固定的抗人紅細胞單抗形成紅細胞免疫復合物，被截留在加樣過濾墊61中，樣本中的血清進入多孔材料4中，全血樣本加樣結(jié)束后，從加樣口5再加入100μL 樣本稀釋液，樣本稀釋液與樣本一同進入多孔材料4中；

c.室溫下反應20分鐘，待測樣本中的心腦血管疾病相關的蛋白標志物由多孔材料4向上擴散、層析，均勻地擴散、層析到達反應膜3表面，在反應膜3的相應檢測點固定的抗體進行免疫反應，形成心腦血管疾病相關的蛋白標志物免疫復合物；

d.從結(jié)果判讀窗口7加入100μL標記有熒光微球的4項心腦血管疾病相關的蛋白標志物抗體溶液，在反應膜3上的相應抗體位形成熒光免疫復合物，再加入100μL磷酸鹽緩沖液PBST進行洗滌，未結(jié)合的血清樣本和熒光標記物以及洗滌液，通過反應膜3的側(cè)向?qū)游龊陀縿?被吸收墊2吸收，通過采用配套的蛋白芯片熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

實施例5

在實施例2或?qū)嵤├?的基礎上進行改進，將熒光微球替換為辣根過氧化物酶，最后步驟加入顯色劑，也可以完成蛋白芯片的檢測。

實施例6

在實施例2或?qū)嵤├?的基礎上進行改進，將熒光微球替換為膠體金，也可以完成蛋白芯片的檢測。

實施例7

在實施例2的基礎上進行改進，功能墊6除了包括加樣過濾墊61和標記物墊62外，增加了輔助反應墊63，輔助反應墊63材質(zhì)為玻璃纖維，包埋固定有NaCl以及Tween-20，適當增加反應體系的離子強度以及表面活性劑濃度，提高了蛋白芯片檢測效果。

實施例8

本發(fā)明公開了一種卡式蛋白芯片及其在雙抗體夾心法檢測垂體腺瘤涉及激素的應用，檢測對象泌乳素(PRL)，生長激素(GH)，促甲狀腺素(TSH)，黃體生成素(LH)，卵泡促激素(FSH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)。

在該卡式蛋白芯片中，結(jié)構如實施例1所述，其中功能墊6包括了加樣過濾墊61和標記物墊62，其材質(zhì)是玻璃纖維，其中標記物墊62包括了上層標記物墊621和下層標記物墊622，在加樣過濾墊61中，包埋固定了抗人紅細胞單抗，上層標記物墊621中包含了量子點標記的PRL抗體和量子點標記的GH抗體，下層標記物墊622中包含了量子點標記的TSH抗體和量子點標記的LH抗體，多孔材料4為無紡布，反應膜3為尼龍膜，以陣列形式分別固定6種垂體腺瘤涉及激素的抗體。

具體使用方法如下：

b.從加樣口5加入80μL病人全血待測樣本，全血樣本中的紅細胞與加樣過濾墊61中固定的抗人紅細胞單抗形成紅細胞免疫復合物，被截留在加樣過濾墊61中，樣本中的血清順次通過標記物墊62進入多孔材料4中，同時，上層標記物墊621和下層標記物墊622中的量子點標記的PRL抗體、量子點標記的GH抗體、量子點標記的TSH抗體和量子點標記的LH抗體隨著血清也進入多孔材料4中，全血樣本加樣結(jié)束后，從加樣口5再加入100μL 樣本稀釋液，樣本稀釋液與樣本血清一同進入多孔材料4中；

c.室溫下反應20分鐘，待測樣本中的PRL、GH、TSH、LH與量子點標記的相應抗體形成免疫復合物由多孔材料4向上擴散，均勻地向上擴散、層析到達反應膜3表面，在反應膜3的相應檢測點與固定的抗體進行免疫反應，形成量子點標記的夾心免疫復合物，待測樣本中的FSH、ACTH向上擴散、層析到達反應膜3表面，在反應膜3的相應檢測點固定的抗體進行免疫反應，形成不帶量子點的免疫復合物；

d.從結(jié)果判讀窗口7加入100μL示蹤標記反應液，示蹤標記反應液中包含量子點標記的FSH抗體、量子點標記的ACTH抗體，在反應膜3上的相應抗體位形成量子點標記的夾心免疫復合物，再加入100μL磷酸鹽緩沖液PBST進行洗滌，未結(jié)合的血清樣本和量子點標記物以及洗滌液，通過反應膜3的側(cè)向?qū)游龊陀縿?被吸收墊2吸收；通過采用配套的蛋白芯片熒光讀數(shù)儀讀取結(jié)果。

在傳統(tǒng)免疫檢測中當PRL、GH、TSH、LH與FSH、ACTH同時檢測時，往往會出現(xiàn)其中某些激素檢測失真，經(jīng)大量分析后發(fā)現(xiàn)，檢測樣本中PRL、GH、TSH、LH所需要進行的反應條件相近，而FSH、ACTH的最優(yōu)反應條件與其他四項不同，進而產(chǎn)生相互干擾，本實施例通過分次添加標記物的方式可以減少多項檢測中出現(xiàn)的相互干擾，提高檢測的準確性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。