本發(fā)明涉及體外檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

腫瘤已對人類生存構(gòu)成了嚴重的威脅，對人類的健康及生活質(zhì)量造成巨大損傷。治療腫瘤的關(guān)鍵在于及時發(fā)現(xiàn)，及早治療以及治療后復查。糖類抗原是臨床上應(yīng)用廣泛的一類腫瘤標志物，它包括糖蛋白與脂糖，常表現(xiàn)為粘蛋白形式。其抗原決定簇可定位在糖鏈上或者在蛋白核上。根據(jù)糖基表位的不同和抗原表位大小的差異，一般可分為CA50、CA125、CA153、CA199、CA242、CA724，人體本來糖類抗原含量是非常微量的，甚至沒有，但是當惡性腫瘤發(fā)生時可能會誘發(fā)機體分泌高濃度的糖類抗原，因此糖類抗原可為腫瘤的前期篩查、臨床診斷、療效監(jiān)控、癌細胞轉(zhuǎn)移以及術(shù)后復查提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

目前臨床檢測糖類抗原724(CA724)的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學發(fā)光法，但這些方法都存在著一些不足之處。

傳統(tǒng)的糖類抗原724(CA724)的檢測方法主要采用酶聯(lián)免疫吸附法，然而，受限于酶聯(lián)免疫的特點，傳統(tǒng)的糖類抗原724的檢測方法在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染，并且由于檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測精度較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種檢測靈敏度較高的糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。

一種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體。

在一個實施例中，所述糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中，所述糖類抗原724單克隆抗體與所述羧基化的磁微粒的質(zhì)量比為1：25～35。

在一個實施例中，所述化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體中，所述糖類抗原724單克隆抗體與所述化學發(fā)光標記物的質(zhì)量比為50：1～10。

在一個實施例中，所述羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

在一個實施例中，所述化學發(fā)光標記物為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。

在一個實施例中，還包括化學發(fā)光底物液，所述化學發(fā)光底物液包括A液和B液。

在一個實施例中，所述A液為H₂O₂溶液，所述B液為NaOH溶液。

在一個實施例中，還包括糖類抗原724定標品。

在一個實施例中，所述糖類抗原724定標品為濃度分別為0U/mL、5U/mL、20U/mL、50U/mL、150U/mL和300U/mL的糖類抗原724的溶液。

一種上述的糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入糖類抗原724單克隆抗體，室溫下混懸2h～10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒；以及

取糖類抗原724單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學發(fā)光標記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)1h～2h后除雜，得到化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體。

這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成糖類抗原724的檢測。這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實驗，其檢測靈敏度達到0.2U/mL，相對于傳統(tǒng)的糖類抗原724的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

附圖說明

圖1為一實施方式的糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法的制備流程示意圖；

圖2為實施例3得到的糖類抗原724標準曲線圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

一實施方式的糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，包括：糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體。

優(yōu)選的，糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中，糖類抗原724單克隆抗體與羧基化的磁微粒的質(zhì)量比為1：25～35。

優(yōu)選的，化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體中，糖類抗原724單克隆抗體與化學發(fā)光標記物的質(zhì)量比為50：1～10。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

化學發(fā)光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學發(fā)光標記物優(yōu)選為吖啶酯。

在其他的實施例中，上述糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括化學發(fā)光底物液。

化學發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

在其他的實施例中，上述糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒還包括糖類抗原724定標品。

糖類抗原724定標品為濃度分別為0U/mL、5U/mL、20U/mL、50U/mL、150U/mL和300U/mL的糖類抗原724的溶液。

具體的，糖類抗原724定標品可以采用標準品緩沖液將糖類抗原724配制成濃度分別為0U/mL、5U/mL、20U/mL、50U/mL、150U/mL和300U/mL的糖類抗原724的溶液。

這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒用于糖類抗原724檢測時，利用全自動化學發(fā)光免疫分析儀對糖類抗原724定標品進行檢測，繪制標準曲線，內(nèi)置于電腦軟件；接著測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度；最后對糖類抗原724全自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進行性能(靈敏度、線性、精密度、干擾性)的評價。

這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒能夠以全自動化學發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，完成糖類抗原724的檢測這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒，經(jīng)過實驗，其檢測靈敏度達到0.2U/mL，相對于傳統(tǒng)的糖類抗原724的檢測方法靈敏度至少提高了10倍，這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測精度較高。

此外，這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒還具有以下優(yōu)點：

1、選擇吖啶酯作為標記材料，并應(yīng)用于化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；

2、選用吖啶酯的化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達到0.2U/mL～300U/mL，而傳統(tǒng)的糖類抗原724的檢測方法的檢線性范圍為2U/mL～100U/mL；

3、吖啶酯化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復性高，批內(nèi)及批間差均在5％以內(nèi)，這是其它化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達到的；

4、化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標準曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；

5、化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)可以實現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。

結(jié)合圖1，上述糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

取羧基化的磁微粒的懸浮液，磁分離去上清后用MES緩沖液重懸，接著加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接著加入糖類抗原724單克隆抗體，室溫下混懸2h～10h，磁分離去除上清后用Tris緩沖液重懸，得到糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒；以及

取糖類抗原724單克隆抗體，加入碳酸鹽緩沖液后混勻，然后加入化學發(fā)光標記物后混勻，室溫下避光反應(yīng)1h～2h后除雜，得到化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體。

MES(2-(N-嗎啡啉)乙磺酸)緩沖液的濃度為0.02M，pH為5.5。

Tris緩沖液的濃度為0.1M并且含有2％BSA，pH為8.0。

EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺)水溶液的濃度為10mg/mL～20mg/mL，EDC與羧基化的磁微粒的質(zhì)量比為0.05：0.1～1。

優(yōu)選的，糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒中，糖類抗原724單克隆抗體與羧基化的磁微粒的質(zhì)量比為1：25～35。

優(yōu)選的，羧基化的磁微粒的粒徑為0.05μm～1μm。

化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體碳酸鹽緩沖液濃度為0.1M，pH為9.0～9.5，

除雜的操作為離心脫鹽柱脫鹽，具體操作為：先分別用純凈水及TBS緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)處理離心脫鹽柱，最后加入得到的糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集離心管中的液體。

優(yōu)選的，化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體中，糖類抗原724單克隆抗體與化學發(fā)光標記物的質(zhì)量比為50：1～10。

化學發(fā)光標記物可以為魯米諾、異魯米諾、三聯(lián)吡啶釕或吖啶酯。其中，化學發(fā)光標記物優(yōu)選為吖啶酯。

得到的糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒和化學發(fā)光標記物標記的糖類抗原724單克隆抗體組合即可得到上述糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒。

這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒在使用時，還需要化學發(fā)光底物液和糖類抗原724定標品。

化學發(fā)光底物液和糖類抗原724定標品可以自行配制得到。

化學發(fā)光底物液包括A液和B液。A液可以為H₂O₂溶液，B液可以為NaOH溶液。

本實施例中，A液為濃度為0.1mol/L的H₂O₂溶液，B液為濃度為0.25mol/L的NaOH溶液。

具體的，糖類抗原724定標品可以采用標準品緩沖液將糖類抗原724配制成濃度分別為0U/mL、5U/mL、20U/mL、50U/mL、150U/mL和300U/mL的糖類抗原724的溶液。

這種糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備方法簡單方便，制得的糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的檢測靈敏度較高，具有良好的應(yīng)用前景。

以下為具體實施例。

實施例1：糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的制備

(1)糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒的制備：

取含有50mg粒徑為0.05μm～1μm的羧基化的磁微粒(MagnaBind^TM，貨號21353)懸浮液，磁分離去上清，用0.02M，pH為5.5MES緩沖液重懸，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg糖類抗原724單克隆抗體(biorbyt，貨號orb48780)，室溫下混懸6h，磁分離，去除上清，用含2％BSA的0.1M，pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(2)抑制素單克隆抗體標記的吖啶酯的制備：

取50μL濃度為25mg/mL的糖類抗原724單克隆抗體，加入150μL濃度為0.1M、pH為9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1.5μL濃度為5mg/mL的吖啶酯溶液混勻，室溫下避光反應(yīng)，1.5h后取出，用2mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進行處理，最后加入得到的抑制素單克隆抗體標記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到抑制素單克隆抗體標記的吖啶酯，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(3)糖類抗原724定標品的制備：

用標準品緩沖液(40mM Tris-HCl，0.5％BSA，1％NaCl，pH 8.0)將糖類抗原724配置成濃度為0U/mL、5U/mL、20U/mL、50U/mL、150U/mL和300U/mL，每瓶0.5mL分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測方法

以全自動化學發(fā)光免疫分析儀(YHLO，貨號iFlash3000)為檢測工具，方法學模式為雙抗體夾心法，即儀器依次加入50μL的樣品、50μL的糖類抗原724單克隆抗體包被的羧基化的磁微粒以及50μL的糖類抗原724處理液，反應(yīng)20min后，再加50μL的糖類抗原724包被的吖啶酯，反應(yīng)20min后，進行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入發(fā)光底物A液(H₂O₂)及B液(NaOH)進行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光值。

實施例3：糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價

采用實施例2中的方法對糖類抗原724定標品進行檢測，得到繪制標準曲線如圖2所示。

接著對接著測試實際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計算樣本濃度。

靈敏度的檢測：

參照CLSI EP17-A文件推薦實驗方案，計算糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為0.2U/mL。

線性的檢測：

對濃度為0U/mL、5U/mL、20U/mL、50U/mL、150U/mL和300U/mL標準品做線性分析，計算線性相關(guān)系數(shù)，r＝0.9996，另外，該試劑盒對糖類抗原724樣品檢測的線性范圍為0.2U/mL～300U/mL。

精密度測定：

取濃度為50U/mL及100U/mL兩個糖類抗原724樣品，每個樣本每個濃度各做3個平行，用三批試劑盒進行檢測，計算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5％。

干擾性實驗：

取混合血清分別添加干擾物包括：結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加質(zhì)量比按照1：20進行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計算二者之間的偏差，以±10％為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達到NCCLS的文件標準，可用于臨床實驗室糖類抗原724狀況的準確評估。

實施例4、糖類抗原724化學發(fā)光免疫檢測試劑盒的對比實驗

分別用化學發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度為0U/mL、5U/mL、20U/mL、50U/mL、150U/mL和300U/mL的糖類抗原724樣品做檢測，兩種方法檢測靈敏度相比，數(shù)據(jù)如下表所示：

由上表可以看出，化學發(fā)光檢測方法的靈敏度較酶聯(lián)免疫吸附法提高了約10倍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。