本發(fā)明涉及免疫磁珠的制備領(lǐng)域，具體地說是一種用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠及其制備方法。

背景技術(shù)：

血液本身是一個(gè)由血漿和血細(xì)胞組成的復(fù)雜環(huán)境，其中血細(xì)胞包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板細(xì)胞。人體內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)和種類的百分比是相對(duì)穩(wěn)定的，正常人每毫升血液里白細(xì)胞有(3.5～9.5)×10⁶個(gè)，主要有：嗜中性粒細(xì)胞50～70％，嗜酸性粒細(xì)胞1～4％，嗜堿性粒細(xì)胞0～1％，淋巴細(xì)胞20～40％，單核細(xì)胞為l～7％。CD45抗原是一類分子量較大的跨膜蛋白，廣泛存在于包括淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在內(nèi)的白細(xì)胞表面，可以作為白細(xì)胞主要的免疫生物標(biāo)識(shí)物。并且，CD15抗原存在于粒細(xì)胞表面，CD14抗原存在于單核細(xì)胞表面，也可以作為白細(xì)胞的免疫生物標(biāo)識(shí)物之一。

免疫磁珠分選法(Immunomagnetic separation，IMS)是近年來興起的一種用于細(xì)胞分選的方法，它是在磁珠表面包被具免疫反應(yīng)性的抗體進(jìn)行抗原-抗體反應(yīng)，在細(xì)胞表面形成“抗原-抗體-磁珠”免疫復(fù)合物。這些結(jié)合了磁珠的細(xì)胞一旦置于強(qiáng)大的磁場(chǎng)下，就會(huì)定向移動(dòng)，使免疫復(fù)合物與其他未被結(jié)合的細(xì)胞分群。當(dāng)具超順磁性的磁珠脫離磁場(chǎng)后，磁性立即消失，從而達(dá)到陽性或陰性選擇特定細(xì)胞的目的。

將免疫磁珠分選法應(yīng)用于細(xì)胞的分選是本領(lǐng)域近年來興起的技術(shù)。但是利用免疫磁珠分選法從血液復(fù)雜的環(huán)境中分選出特定細(xì)胞，需要免疫磁珠具有特異性的免疫生物標(biāo)志物，而且穩(wěn)定性、分散性好，不能團(tuán)聚。同時(shí)，免疫磁珠的粒徑不能過大，過大會(huì)壓迫細(xì)胞；免疫磁珠的粒徑也不能過小，粒徑過小磁響應(yīng)性也小，容易無法達(dá)到細(xì)胞分選的效果。然而，由于該復(fù)雜性，從血液中正向分選出需要的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和分析，現(xiàn)有的生物標(biāo)志物往往難以達(dá)到敏感性的要求。例如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，在外周血中的濃度非常低，通常在約10⁹個(gè)血細(xì)胞中僅有數(shù)個(gè)CTC，大約每10⁵～10⁷個(gè)單核細(xì)胞中才有幾個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞。為了能夠提高稀有細(xì)胞的捕獲率，現(xiàn)有技術(shù)中在采用正向分選捕獲CTC等稀有細(xì)胞之前，往往先經(jīng)過反向分選，去除血液中的不相關(guān)細(xì)胞，然后再進(jìn)行正向分選稀有細(xì)胞。例如在血液中捕獲和富集CTC細(xì)胞的方法是利用CD45免疫磁珠結(jié)合表達(dá)CD45抗原的白細(xì)胞，進(jìn)行磁分離去除白細(xì)胞，此法可將去除大部分表達(dá)CD45的淋巴細(xì)胞，并將全部類型的CTCs富集分選出來。但是剩余的白細(xì)胞包括粒細(xì)胞(CD15抗原)和單核細(xì)胞(CD14抗原)還存在，剩余的細(xì)胞中僅能獲得0.01％～1％的CTCs。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供一種用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠及其制備方法，本發(fā)明的用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠粒徑小，磁響應(yīng)性好，用于白細(xì)胞捕獲，捕獲效率高，富集時(shí)間短，可以去除血液中大量的白細(xì)胞，同時(shí)制備過程簡(jiǎn)單，成本低。

在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠，所述用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠至少包括CD45免疫磁珠，還可以包括或不包括CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠中的一種或兩種，其中，CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠為CD45抗體、CD14抗體和CD15抗體分別與磁性微球偶聯(lián)得到的免疫磁珠；所述CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠的結(jié)構(gòu)式為：A-NH-N＝CH-B，其中A表示磁性微球，B表示抗體，或者A表示抗體，B表示磁性微球。

可以選擇的加入CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠，用于捕獲和富集剩余未捕獲完全的粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述磁性微球?yàn)楹藲そY(jié)構(gòu)的無機(jī)或有機(jī)高分子包裹的磁性微球。比如二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵、或者葡聚糖包裹的磁性四氧化三鐵等。最優(yōu)選的，所述磁性微球部分為二氧化硅包裹的磁性四氧化三鐵。

優(yōu)選的，所述用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠的粒徑為200～300nm。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備上述用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠的方法，其步驟包括：

s1.磁性納米簇的制備；

s2.氨基修飾的磁性微球的制備；

s3.肼基修飾的A部分的制備；

s4.醛基修飾的B部分的制備；

s5.免疫磁珠的制備：將步驟s3所述肼基修飾的A部分與步驟s4所述醛基修飾的B部分混合，在4～25℃下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)2～24小時(shí)，得到所述免疫磁珠。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，對(duì)氨基修飾的磁性微球進(jìn)行醛基修飾，并且對(duì)抗體進(jìn)行肼基修飾。或者對(duì)氨基修飾的磁性微球進(jìn)行肼基修飾，并且對(duì)抗體進(jìn)行醛基修飾，均可以實(shí)現(xiàn)上述結(jié)構(gòu)的免疫磁珠。

進(jìn)一步的，所述步驟s3中的肼基修飾的A部分是通過：將氨基修飾的磁性微球或抗體用摩爾當(dāng)量為10～50倍的SANH進(jìn)行肼基修飾后得到的。最優(yōu)選的，SANH的摩爾當(dāng)量為氨基修飾的磁性微球或抗體的25倍。所述SANH為對(duì)-丙腙基吡啶甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(CAS：362522-50-7)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為肼基。所述SANH一般溶解在DMF溶液中進(jìn)行反應(yīng)，濃度可以根據(jù)磁性微球或抗體的濃度進(jìn)行調(diào)整，不影響反應(yīng)結(jié)果。該反應(yīng)過程可以在15～25℃室溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對(duì)磁性微球的修飾反應(yīng)時(shí)間16～24h，對(duì)抗體的修飾反應(yīng)時(shí)間2～4h。

進(jìn)一步的，所述步驟s4中的醛基修飾的B部分是通過：將氨基修飾的磁性微球或抗體用摩爾當(dāng)量為5～20倍的SFB進(jìn)行醛基修飾后得到的。最優(yōu)選的，SFB的摩爾當(dāng)量為氨基修飾的磁性微球或抗體的10倍。所述SFB為4-甲酰苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯(CAS：60444-78-2)，在室溫條件下可以溫和的將氨基轉(zhuǎn)換為醛基。所述SFB一般溶解在DMF溶液中進(jìn)行反應(yīng)，濃度可以根據(jù)磁性微球或抗體的濃度進(jìn)行調(diào)整，不影響反應(yīng)結(jié)果。該反應(yīng)過程可以在15～25℃室溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)判斷，本發(fā)明一般采用對(duì)磁性微球的修飾反應(yīng)時(shí)間16～24h，對(duì)抗體的修飾反應(yīng)時(shí)間2～4h。

所述步驟s1中的磁性納米簇是通過水熱法、溶劑熱法或共沉淀法制備得到，也可以采用市售商品。制備磁性納米簇的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，得到的產(chǎn)品只需要滿足具有良好的磁性，并且可以與無機(jī)或有機(jī)高分子形成核殼結(jié)構(gòu)即可。

作為優(yōu)選的，所述步驟s1中的磁性納米簇是通過如下方法制備得到：

1)在空氣中，向二價(jià)鐵鹽的水溶液中加入氨水，然后攪拌使溶液變成黑色，得到黑色Fe₃O₄顆粒；

2)向步驟1)中加入油酸，混合均勻后轉(zhuǎn)移至密閉的反應(yīng)釜中，在60～130℃下加熱反應(yīng)3～5小時(shí)，即可得到所述磁性納米簇。

進(jìn)一步的，所述步驟s2中的氨基修飾的磁性微球?yàn)楹藲そY(jié)構(gòu)的二氧化硅包裹的磁性微球，效果更加優(yōu)于直接在磁性納米簇粒子表面進(jìn)行氨基修飾得到的磁性微球，可以采用市售商品或者按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)方法制備，均不影響本發(fā)明的結(jié)果。可以使納米簇聚集在二氧化硅內(nèi)部，形成核殼結(jié)構(gòu)，增大粒徑，并且增加磁性和穩(wěn)定性即可。優(yōu)選的，本發(fā)明采用如下方法制備氨基修飾的二氧化硅包裹的磁性微球：向含有磁性納米簇的溶液中加入氨水、硅烷化試劑和氨基硅烷偶聯(lián)劑，反應(yīng)1～3天后得到氨基修飾的磁性微球部分；所述磁性納米簇、氨水、硅烷化試劑、氨基硅烷偶聯(lián)劑加入的質(zhì)量比為：1:(12.5～40):(2～8):(0.5～3)。其中氨水的質(zhì)量百分濃度為25～28％。其中，硅烷化試劑可以為正硅酸四乙酯(CAS：562-90-3)，氨基硅烷偶聯(lián)劑可以為(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(CAS：919-30-2)。本領(lǐng)域技術(shù)人員在選擇其他的硅烷化試劑與氨基硅烷偶聯(lián)劑時(shí)，可以對(duì)反應(yīng)原料的比例進(jìn)行調(diào)整，均不超出本發(fā)明的保護(hù)范圍。

優(yōu)選的，所述步驟s5中，磁性微球和抗體的質(zhì)量比為1：(0.01～1)。抗體與磁性微球的質(zhì)量比越高越有利于磁性微球表面偶聯(lián)抗體，但是考慮到抗體的成本因素，本發(fā)明采用磁性微球和抗體的質(zhì)量比為1：(0.01～0.2)。

在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用于捕獲白細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒中含有上述的用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠，所述用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠為CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠混合得到。由于不同的白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中含量不相同，因此CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠、CD15免疫磁珠混合的比例可以根據(jù)淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中含量不同進(jìn)行選擇，本發(fā)明采用5:1:5。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)將本發(fā)明的免疫磁珠用于捕獲白細(xì)胞，不僅特異性、敏感性好，而且磁響應(yīng)迅速、富集時(shí)間短，捕獲效率高，可以用來捕獲血液中絕大多數(shù)的白細(xì)胞，有利于富集CTC等稀有細(xì)胞，并且避免了捕獲的白細(xì)胞損傷，白細(xì)胞可以用于進(jìn)一步的分析。

(2)本發(fā)明的免疫磁珠，其磁性微球部分和抗體部分通過腙鍵結(jié)構(gòu)相連，得到的免疫磁珠在弱堿性條件下(血液中)性質(zhì)穩(wěn)定，同時(shí)粒徑小，磁響應(yīng)性好，分散性好。

(3)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，氨基、醛基和肼基修飾的過程均可以在室溫下進(jìn)行，不容易造成抗體的變質(zhì)、降解等，同時(shí)避免了使用還原劑，使抗體可以在低溫下與細(xì)胞孵育，保持抗體和細(xì)胞的生物活性。

(4)本發(fā)明原料簡(jiǎn)單易得，成本低，工藝步驟簡(jiǎn)單，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明CD45免疫磁珠1的光學(xué)顯微鏡下形貌圖；

圖2為本發(fā)明CD45免疫磁珠1的熒光顯微鏡下形貌圖；

圖3為本發(fā)明CD45免疫磁珠1捕獲白細(xì)胞的結(jié)果圖；

圖4為市售CD45免疫磁珠捕獲白細(xì)胞的結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明CD45免疫磁珠1捕獲KB細(xì)胞的結(jié)果圖；

圖6為市售CD45免疫磁珠和本發(fā)明CD45免疫磁珠吸附前后的細(xì)胞分布圖；

圖7為CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠、CD15免疫磁珠吸附前后的細(xì)胞分布圖。

具體實(shí)施方式

以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明：下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

本發(fā)明對(duì)比用市售CD45免疫磁珠為購自thermofisher公司的CD45免疫磁珠，貨號(hào)為11153D。

實(shí)施例1用于去除白細(xì)胞的免疫磁珠的制備

(1)磁性納米簇的制備：

a.在空氣中，將7g FeCl₂·4H₂O加入到50mL去離子水中，得到濃度為0.14g/mL的FeCl₂水溶液。向50mL FeCl₂水溶液中加入氨水30mL，攪拌20min后，顏色逐漸變?yōu)闇\綠色，再變深綠色，最后變?yōu)楹谏?/p>

b.向步驟a中加入1.1g油酸，混合均勻后將混合液置于密閉的反應(yīng)釜中，在110℃下加熱反應(yīng)4小時(shí)，然后用去離子水和乙醇交替洗滌各一次，磁分離后分散在正己烷中，即可得到黑色的磁性納米簇Fe₃O₄ 1。

(2)氨基修飾的磁性微球的制備：向10mg磁性納米簇Fe₃O₄ 1的溶液中加入125mg氨水、30mg正硅酸四乙酯和30mg(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，反應(yīng)1天后進(jìn)行磁分離，并且用乙醇和水交替洗滌各兩次，并用0.1M的pH 7～8的磷酸緩沖液分散后得到濃度為5mmol/L的氨基修飾的磁性微球1。

(3)肼基修飾的CD45抗體的制備：將5μL SANH的DMF溶液(濃度為5mmol/L)加入到100μL CD45抗體溶液(濃度為10μmol/L)中，在室溫反應(yīng)2h后，用超濾柱純化得到肼基修飾的CD45抗體(簡(jiǎn)寫為CD45-SANH)1。

檢測(cè)CD45-SANH的濃度：通過BCA法計(jì)算修飾后的CD45-SANH的濃度為1.80mg/mL。

檢測(cè)肼基修飾率：用定量的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液檢測(cè)肼基修飾率。取純化后的CD45-SANH加入到的2-甲酰苯磺酰鈉鹽溶液中，渦旋混勻后于37℃反應(yīng)1h，Nanodrop檢測(cè)348nm處的吸光值為0.16。通過348nm處的吸光值和CD45-SANH的濃度計(jì)算出CD45-SANH的肼基修飾率為6.2。

(4)醛基修飾的磁性微球的制備：將5μL的氨基修飾的磁性微球1加入到SFB的DMF溶液(濃度為5mmol/L)50μL中，在室溫反應(yīng)20h后，進(jìn)行磁分離純化，得到醛基修飾的磁性微球1。

(5)免疫磁珠的制備：將1mg步驟(4)中的醛基修飾的磁性微球與0.01mg步驟(3)中的肼基修飾的CD45抗體混合，在25℃下pH值為6.0的PBS緩沖液中混合2小時(shí)后，進(jìn)行磁分離得到CD45抗體偶聯(lián)磁性微球的CD45免疫磁珠。計(jì)算得到每毫克CD45免疫磁珠1上，包被抗體率為85％(消耗的抗體量與加入的抗體總量的比例)。

對(duì)上述CD45免疫磁珠1進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)，得到的光學(xué)顯微鏡下形貌圖如圖1所示，熒光顯微鏡下形貌圖如圖2所示。通過圖1和圖2可以看出，本發(fā)明的CD45免疫磁珠1上，免疫磁珠上都偶聯(lián)有標(biāo)記熒光的CD45，偶聯(lián)效率高。

按照上述步驟(1)～(5)制備得到CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠。將CD14免疫磁珠、CD15免疫磁珠和CD45免疫磁珠按照質(zhì)量比1:5:5混合得到用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠。

實(shí)施例2用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠的特異性檢測(cè)

采集健康志愿者血樣，通過人淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(PBMCs)提取，將PBMCs制成四組濃度為1×10⁶/mL的細(xì)胞懸液，在兩組中分別加入0.5mg和5mg實(shí)施例1中的CD45免疫磁珠后，在4℃下孵育30分鐘，在1分鐘內(nèi)進(jìn)行磁分選并洗滌。對(duì)另外兩組中分別加入0.5mg和5mg市售的CD45免疫磁珠，按照同樣的方法孵育。

收集人口腔表皮樣癌細(xì)胞KB細(xì)胞(來源中國科學(xué)院細(xì)胞庫購買)，同樣制成濃度為1×10⁶/mL的細(xì)胞懸液，加入5mg實(shí)施例1中的用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠后，在4℃下孵育30分鐘，作為陰性對(duì)照。

對(duì)孵育后的磁珠進(jìn)行重懸，然后進(jìn)行顯微鏡檢測(cè)。本發(fā)明CD45免疫磁珠結(jié)果如圖3所示，孵育30分鐘后，PBMCs細(xì)胞表面聚集有很多用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠，吹打不散，當(dāng)免疫磁珠加入量為過飽和5mg時(shí)，捕獲率達(dá)到99.7％，當(dāng)免疫磁珠加入量為0.5mg時(shí)，捕獲率為96％。市售的CD45免疫磁珠結(jié)果如圖4所示，市售的CD45免疫磁珠尺寸較大，快接近白細(xì)胞大小，當(dāng)免疫磁珠加入量為過飽和5mg時(shí)，捕獲率僅有98.9％，當(dāng)免疫磁珠加入量為0.5mg時(shí)，捕獲率為86％。而KB細(xì)胞則基本不與本發(fā)明用于捕獲白細(xì)胞的免疫磁珠結(jié)合，呈分散狀，如圖5所示。

實(shí)施例3用于捕獲不同類型白細(xì)胞的免疫磁珠的特異性檢測(cè)

采集健康志愿者血樣，通過人淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行外周血單核細(xì)胞(PBMCs，含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)提取，將PBMCs制成濃度為1×10⁶/mL的細(xì)胞懸液，分別加入實(shí)施例1中的CD45、CD15、CD14免疫磁珠后，在4℃下孵育30分鐘，在1分鐘內(nèi)進(jìn)行磁分選并洗滌。

采集健康志愿者血樣，通過紅細(xì)胞裂解液提取總白細(xì)胞(含粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞占20～40％，粒細(xì)胞占50～70％，單核細(xì)占1～7％)，將PBMCs制成濃度為1×10⁶/mL的細(xì)胞懸液，分別加入實(shí)施例1中的CD45、CD15、CD14免疫磁珠后，在4℃下孵育30分鐘，在1分鐘內(nèi)進(jìn)行磁分選并洗滌。

收集KB細(xì)胞，同樣制成濃度為1×10⁶/mL的細(xì)胞懸液，加入實(shí)施例1中的CD45免疫磁珠后，在4℃下孵育30分鐘，作為陰性對(duì)照。

如圖6所示，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測(cè)CD45免疫磁珠吸附細(xì)胞前后的分布圖可以直觀的看到，免疫磁珠去掉的是哪種尺寸的細(xì)胞。圖6中a圖為實(shí)施例2、3中的人淋巴細(xì)胞分離液提取PBMCs(含淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)的分布圖，可以看出主要為6～8微米的淋巴細(xì)胞峰以及含量較少的單核細(xì)胞。b圖是裸磁珠(不偶聯(lián)抗體)吸附后的分布圖，可以看出b圖與a圖相同，說明裸磁珠不能夠去除PBMCs細(xì)胞。c圖和d圖分別為市售CD45免疫磁珠和本發(fā)明實(shí)施例1的CD45免疫磁珠吸附PBMCs后的分布圖，可以看出市售CD45免疫磁珠和本發(fā)明實(shí)施例1的CD45免疫磁珠都可以去掉6～8微米的淋巴細(xì)胞峰。圖6中e圖為KB細(xì)胞分布圖，KB細(xì)胞尺寸分布在11～18微米。f圖和g圖分別為市售CD45免疫磁珠和本發(fā)明實(shí)施例1的CD45免疫磁珠吸附KB細(xì)胞后的分布圖，從f圖可以看出市售CD45免疫磁珠吸附KB細(xì)胞后，KB細(xì)胞的尺寸分布發(fā)生偏移，可能是由于市售CD45免疫磁珠尺寸大，對(duì)KB細(xì)胞產(chǎn)生一定非特異性吸附，對(duì)KB細(xì)胞造成一定損傷，有碎片存在導(dǎo)致KB細(xì)胞的尺寸向左偏移。而本發(fā)明的CD45免疫磁珠不對(duì)KB細(xì)胞造成影響。

如圖7所示，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器可以直觀的看到不同抗體(CD45、CD15、CD14)免疫磁珠吸附細(xì)胞前后的分布圖，可以確定不同抗體免疫磁珠去掉的是哪種類型白細(xì)胞。a圖是人淋巴細(xì)胞分離液提取PBMCs的分布圖，b圖是紅細(xì)胞裂解液提取總白細(xì)胞的分布圖，a圖的細(xì)胞主要包括6～8微米的淋巴細(xì)胞以及少數(shù)單核細(xì)胞。b圖的細(xì)胞主要包括9微米的粒細(xì)胞和6～8微米的淋巴細(xì)胞。c圖和d圖分別為用本發(fā)明CD45免疫磁珠分選a圖的PBMCs和b圖的總白細(xì)胞后的細(xì)胞分布圖，可以看出本發(fā)明CD45免疫磁珠主要結(jié)合6～8微米的淋巴細(xì)胞，不結(jié)合9微米處的粒細(xì)胞。e圖和f圖分別為用本發(fā)明CD14免疫磁珠分選a圖的PBMCs和b圖的總白細(xì)胞后的細(xì)胞分布圖，e圖可以看出CD14免疫磁珠不結(jié)合6～8微米的淋巴細(xì)胞，可以去掉少部分單核細(xì)胞，f圖可以看出CD14免疫磁珠也不結(jié)合9微米處的粒細(xì)胞。g圖和h圖分別是CD15免疫磁珠分選a圖的PBMCs和b圖的總白細(xì)胞后的細(xì)胞分布圖，g圖可以看出CD15免疫磁珠分離PBMCs前后峰譜和形狀基本一致，不結(jié)合6～8微米的淋巴細(xì)胞峰和少部分單核細(xì)胞，f圖可以看出CD15免疫磁珠不結(jié)合6～8微米的淋巴細(xì)胞峰，但是可以結(jié)合9微米處的粒細(xì)胞峰。因而可以得出結(jié)論，CD45免疫磁珠主要用于去除6～8微米的淋巴細(xì)胞，CD14免疫磁珠主要是去除白細(xì)胞中的單核細(xì)胞，CD15免疫磁珠主要是去除白細(xì)胞中的粒細(xì)胞。

實(shí)施例4癌癥病人的CTC細(xì)胞捕獲

取健康人和不同癌癥病人的外周血血液，對(duì)血液中的CTC進(jìn)行捕獲。要求受試者血常規(guī)白細(xì)胞值位于2×10⁶～1.2×10⁷個(gè)/mL之間，全血樣本未出現(xiàn)溶血或血塊凝結(jié)。并且受試者相關(guān)信息完整，樣本采集、保存方法規(guī)范，實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，具體步驟如下：取不同癌癥病人血液3ml，先對(duì)血液進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，然后加入本發(fā)明實(shí)施例1的CD45免疫磁珠、CD14免疫磁珠和CD15免疫磁珠，在4℃下孵育30分鐘，然后在1分鐘內(nèi)進(jìn)行磁分選，去除白細(xì)胞。對(duì)去除了白細(xì)胞的細(xì)胞懸液進(jìn)行抗體染色、并在載玻片上固定、然后進(jìn)行細(xì)胞核DAPI染色、封片后，用熒光顯微鏡鑒定。熒光顯微鏡顯示白細(xì)胞去除效果好，剩余的白細(xì)胞量不足2.4×10^-3個(gè)。

以上所述的實(shí)施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明實(shí)施例原理以及權(quán)利要求的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明實(shí)施例的保護(hù)范圍。