本發(fā)明涉及一種二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑即R-琥珀酸曲格列汀光學(xué)純度的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：琥珀酸曲格列?。═relagliptinSuccinate）是一種二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑，其化學(xué)名為2-〔〔6-〔(3R)-3-氨基-1-哌啶基〕-3,4-二氫-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基〕甲基〕-4-氟苯甲腈琥珀酸鹽。其主要成分為曲格列汀。該化合物結(jié)構(gòu)中有一個(gè)手性中心，但真正具有藥理作用的為R構(gòu)型，其結(jié)構(gòu)式見式1：式1：琥珀酸曲格列汀結(jié)構(gòu)式琥珀酸曲格列汀是由日本武田制藥開發(fā)的二肽基肽酶-Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑，通過選擇性、持續(xù)性抑制DPP-Ⅳ，從而控制血糖水平。腸促胰島素（GLP-Ⅰ）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）在血糖調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，而DPP-Ⅳ是能夠引發(fā)腸促胰島素（GLP-Ⅰ）和葡萄糖依賴性促胰島素多肽（GIP）的失活。通過抑制DPP-Ⅳ，就能夠增加血糖水平依賴性胰島素分泌，從而達(dá)到控制血糖的目的。琥珀酸曲格列汀是可通過提高機(jī)體自身能力控制血糖水平的新型的Ⅱ型糖尿病藥物，用作單藥，每周服用一次。其作用機(jī)制獨(dú)特，具有不產(chǎn)生低血糖、不引起體重增加，以及副作用小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，引起胃腸道不良反應(yīng)的發(fā)生率也很低。2015年3月獲得日本厚生勞動(dòng)?。∕HLW）的上市批準(zhǔn)，主要用于治療Ⅱ型糖尿病，耐受性良好。R-琥珀酸曲格列汀的合成是以3-甲基-6-氯尿嘧啶與2-氰基-5-氟溴芐反應(yīng)生成2-〔(6-氯-3,4-二氫-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基)甲基〕-4-氟苯甲腈，2-〔(6-氯-3,4-二氫-3-甲基-2,4-二氧代-1(2H)-嘧啶基)甲基〕-4-氟苯甲腈再與R-3-氨基哌啶雙鹽酸鹽反應(yīng)生成R-曲格列汀，R-曲格列汀再與琥珀酸成鹽得到的R-琥珀酸曲格列汀。隨著手性液相分離技術(shù)的發(fā)展，高效液相色譜法已經(jīng)成為能夠準(zhǔn)確檢測(cè)物質(zhì)光學(xué)純度的可靠的方法。但是R-琥珀酸曲格列汀的手性分離方法至今尚未見報(bào)道。究其原因，一是對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)的色譜行為與主藥行為比較相似，必須選用特定的手性填料才能將二者徹底分離，需要進(jìn)行大量的手性柱篩選實(shí)驗(yàn)；二是由于其手性中心能夠與手性色譜柱填料產(chǎn)生氫鍵、偶極-偶極或空間作用的作用力較小，常規(guī)手性色譜柱的分離效能較低，無法實(shí)現(xiàn)有效的分離。為了有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量，迫切的需要一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。本發(fā)明的目的：為了解決分離效能較低這一問題，我們開發(fā)了采用添加二乙胺的流動(dòng)相的手性色譜法測(cè)定R-琥珀酸曲格列汀汀光學(xué)純度的方法。該方法是利用在流動(dòng)相中添加二乙胺，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，穩(wěn)定手性填料的空間構(gòu)型，改變了手性填料對(duì)R-琥珀酸曲格列汀與S-琥珀酸曲格列汀的鍵合作用，從而提高了R-琥珀酸曲格列汀與S-琥珀酸曲格列汀之間的分離效能，實(shí)現(xiàn)了用手性色譜法進(jìn)行光學(xué)純度的測(cè)定，首次創(chuàng)新性地解決了R-琥珀酸曲格列汀光學(xué)純度測(cè)定這一技術(shù)難題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：目前，琥珀酸曲格列汀按式2所示流程制備。式2琥珀酸曲格列汀的工藝流程本發(fā)明的技術(shù)方案：一種R-琥珀酸曲格列汀光學(xué)純度的測(cè)定方法，其特征在于，色譜條件：色譜系統(tǒng)為高效液相色譜儀，色譜柱填料為直鏈淀粉-三（3,5-二甲苯基氨基甲酸酯），即AD-H手性色譜柱（250mm×4.6mm,5μm）；流動(dòng)相A為正己烷，流動(dòng)相B為二乙胺的乙醇溶液，且所述的正己烷與0.1%二乙胺的乙醇溶液的體積比為55:45~65:35，二乙胺的濃度為0.05%~0.15%，流動(dòng)相在0.8~1.2mL·min-1，檢測(cè)波長：278nm。本發(fā)明技術(shù)方案中二乙胺的乙醇溶液中，二乙胺的作用是改性劑，通常加在正相的流動(dòng)相中，主要的作用是調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，穩(wěn)定手性填料的空間構(gòu)型，改變手性填料對(duì)R，S對(duì)映異構(gòu)體的鍵合作用。所述流動(dòng)相中二乙胺的乙醇溶液中，二乙胺的濃度為0.1%。所述流動(dòng)相中正己烷與0.1%二乙胺的乙醇溶液的體積比是60:40。本發(fā)明的光學(xué)純度的檢測(cè)方法，其特征在于，含有以下步驟：取R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品、S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品各適量，分別置于25ml量瓶中，分別加無水乙醇溶解并定量稀釋制成各約為0.5mg·ml-1的溶液，作為R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品貯備液；（1）R,S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品溶液：精密量取上述貯備液各0.25ml，置同一100ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得，作為系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)溶液；（2）S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品溶液：精密量取上述S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品貯備液0.25ml，置于100ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得，作為S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品定位溶液；（3）R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品溶液：精密量取上述R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品貯備液0.25ml，置于100ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得，作為R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品定位溶液；（4）R-琥珀酸曲格列汀供試品溶液：精密稱取R-琥珀酸曲格列汀供試品適量，加無水乙醇定量稀釋制成每1ml約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液；（5）精密量取供試品溶液0.5ml，置200ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液；（6）取對(duì)照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～20%。精密量取供試品溶液與對(duì)照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍，按峰面積歸一化法計(jì)算光學(xué)純度；色譜條件：以CHIRALPAKAD-H手性柱為色譜柱；以正己烷-無水乙醇（60：40）（含0.1%二乙胺）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為278nm；柱溫為25℃；流速為每分鐘1.0mL，進(jìn)樣量20μL。首先分別對(duì)R,S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品溶液與S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品溶液進(jìn)樣，進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性分析，再對(duì)R-琥珀酸曲格列汀供試品溶液進(jìn)行光學(xué)純度測(cè)定，按面積歸一化法計(jì)算樣品的光學(xué)純度。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：R,S-琥珀酸曲格列汀達(dá)到了基線分離，分離度大于2.0，見說明書附圖3，與R-琥珀酸曲格列汀、S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品色譜圖（說明書附圖4與5）對(duì)比，確定RT=14.113為S構(gòu)型，RT=15.773為R構(gòu)型。本發(fā)明的有益成果：1在流動(dòng)相中添加二乙胺，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，穩(wěn)定手性填料的空間構(gòu)型，改變手性填料對(duì)R，S-琥珀酸曲格列汀的鍵合作用，從而提高了分離效能。2被分析物中R，S-曲格列汀之間達(dá)到基線分離，可操作性強(qiáng)，分析方法專屬性、靈敏度與準(zhǔn)確度高，能為保證藥品的安全、有效、質(zhì)量可控提供強(qiáng)有力的依據(jù)。3主峰峰型良好，主峰前后雜質(zhì)峰與主峰分離度良好，色譜條件的系統(tǒng)適應(yīng)性良好。4該方法的平均回收率為101.52%，RSD為1.75%，完全滿足要求。本發(fā)明技術(shù)方案中，所述R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品與S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品的確認(rèn)：色譜條件：色譜系統(tǒng)為高效液相色譜儀，色譜柱填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠（250mm×4.6mm,5μm），流速：1.0ml·min-1，柱溫：35℃，檢測(cè)波長：278nm，進(jìn)樣量20μL，流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.01mol·L-1的磷酸二氫鉀（用飽和氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至6.2）-乙腈（90:10）為流動(dòng)相B，按下表程序進(jìn)行梯度洗脫；-1-1時(shí)間(分鐘)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B（%）019930208055851555.519960199純度測(cè)定：分別精密稱取R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品與S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品適量，加乙腈定量稀釋制成每1ml約含0.5mg的溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，按峰面積歸一化法計(jì)算純度，純度應(yīng)大于99.0%；附圖說明：圖1：RS-琥珀酸曲格列汀純度測(cè)定色譜圖。圖2：RS-琥珀酸曲格列汀色譜峰光譜圖。圖3：RS-琥珀酸曲格列汀光學(xué)純度測(cè)定色譜圖。圖4：S-琥珀酸曲格列汀光學(xué)純度測(cè)定色譜圖。圖5：R-琥珀酸曲格列汀光學(xué)純度測(cè)定色譜圖。圖6：R-琥珀酸曲格列汀樣品（PTG141202批次供試品）光學(xué)純度測(cè)定色譜圖。圖注：EP/JP表示歐洲藥典和日本藥典高效液相色譜法分離度計(jì)算方法。具體實(shí)施方式：一下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1R-琥珀酸曲格列汀樣品的光學(xué)純度的測(cè)定儀器與試劑：高效液相色譜儀（日本日立公司；賽默飛世爾科技有限公司）；AD-H手性色譜柱（250mm×4.6mm,5μm；大賽璐藥物手性技術(shù)有限公司）；恒溫水浴鍋（江蘇金壇科興儀器廠）；BT-25S電子天平（瑞士，梅特勒公司）。DL-1000D超聲儀（上海之信儀器有限公司）。正己烷（色譜純，天津市彪士奇科技有限公司）；無水乙醇（色譜純，天津市彪士奇科技有限公司）；二乙胺（分析純，天津廣成化學(xué)試劑有限公司）；R-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品（純度≧99.9%，迪沙藥業(yè)集團(tuán)藥物研究院）；S-琥珀酸曲格列汀對(duì)照品（純度≧99.0%，迪沙藥業(yè)集團(tuán)藥物研究院）；R-琥珀酸曲格列汀樣品（PTG141202批次，純度≧99.0%，迪沙藥業(yè)集團(tuán)藥物研究院）。我們通過大量實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了流動(dòng)相色譜條件的篩選：1.1流動(dòng)相的選擇琥珀酸曲格列汀為極性較大的化合物，故選擇正己烷-無水乙醇體系為流動(dòng)相。流動(dòng)相的配比考察發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加正己烷的比例有利于提高分離度，但是正己烷比例較大會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間過長，不利于分析檢測(cè)。流動(dòng)相中添加二乙胺，會(huì)使主峰峰型趨于尖峰，柱效增加，理論板數(shù)達(dá)到要求。通過對(duì)二乙胺添加量（0.05%、0.1%、0.15%）的系統(tǒng)優(yōu)化顯示，1.0%的添加量使分離效能最佳，因而選擇0.1%的二乙胺。流速考察中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)慕档土魉僖材軌蛱岣叻蛛x效能，但是會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間過長，造成不必要的浪費(fèi)。通過對(duì)流速（0.8mL·min-1、1.0mL·min-1、1.2mL·min-1）的系統(tǒng)優(yōu)化顯示，1.0mL·min-1的流速條件使分離效能最佳，因而流速選擇1.0mL·min-1。1.2紫外波長的選擇：琥珀酸曲格列汀在流動(dòng)相中的最大紫外吸收波長為278nm。由于琥珀酸曲格列汀與其對(duì)映異構(gòu)體的理化性質(zhì)基本一致，最大紫外吸收波長也是在278nm，因而選擇278nm作為對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)波長。1.3樣品濃度的選擇：比較濃度分別為0.3mg·mL-1、0.5mg·mL-1、1.0mg·mL-1的樣品的色譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.3mg·mL-1的樣品峰高較低，含量較小的對(duì)映異構(gòu)體未檢出；1.0mg·mL-1的樣品濃度太大，色譜柱有過載的跡象；0.5mg·mL-1濃度的樣品在峰高及峰面積方面均能滿足要求，因此確定0.5mg·mL-1為檢出樣品的濃度。1.4耐用性：通過對(duì)流動(dòng)相比例、流速與柱溫的變化對(duì)方法進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇比例在45%-35%之間、流速在0.8-1.2mL·min-1之間發(fā)生微小變化時(shí)，對(duì)分離效能沒有影響，對(duì)映異構(gòu)體均能檢出，且其含量沒有顯著變化。室溫在17~23℃之間變動(dòng)時(shí)，對(duì)保留時(shí)間略有影響，對(duì)分離效能沒有影響。按技術(shù)方案所述檢測(cè)方法檢測(cè)R-琥珀酸曲格列汀的光學(xué)純度。樣品測(cè)定（PTG141202批次供試品）精密稱取PTG141202批次供試品適量，加無水乙醇定量稀釋制成每1ml約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液0.5ml，置200ml量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液；取對(duì)照溶液20μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～20%。精密量取供試品溶液與對(duì)照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍，按峰面積歸一化法計(jì)算光學(xué)純度（見附圖6）；上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3