本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于核酸適配體檢測汞離子的生物傳感器，還涉及其制備方法。

背景技術(shù)：

由于一些重金屬離子的存在對水環(huán)境以及人類的健康有著不利的影響，對水生生態(tài)系統(tǒng)中的重金屬離子的監(jiān)測開始受到人們的廣泛重視。汞離子是有毒重金屬污染物，廣泛存在于水，土壤甚至食物中。汞離子可以損傷大腦，心臟，胃，腸和腎臟。微量的汞可以通過食物鏈累積在人體內(nèi)，造成慢性汞中毒。

目前報道的汞離子的檢測方法包括原子發(fā)射光譜法、原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)量光譜法，電化學(xué)方法等，這些方法往往存在儀器昂貴、分析周期長、樣品預(yù)處理復(fù)雜、檢測費(fèi)用昂貴等問題，對于汞離子檢測的方便、快捷、靈敏度等方面的要求已難以適應(yīng)。因此，目前急需建立一種快速，準(zhǔn)確，靈敏且高特異性的檢測方法來檢測汞離子的殘留。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中檢測汞離子的方法特異性和靈敏度都比較低、成本高、檢測周期長的問題，本發(fā)明提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基于鏈置換以及納米金檢測汞離子的比色生物傳感器。同時，還涉及其制備方法。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

本發(fā)明中一共用到了4條DNA鏈，其序列分別是：

Probe1： 5’-GGTCACGCTTTCTTCTTTCTTTC-3’（SEQ ID NO:1）；

Probe2： 5’-GAAAGCGTGACACAG-3’ (SEQ ID NO:2）；

Probe3： 5’-GTTTGTTTGTTGTTAGCGTGACGGTC-3’ (SEQ ID NO:3）；

Probe4： 5’-SH-TTTCACGCTTTC-3’ (SEQ ID NO:4）。

其中Probe1的斜體部分是Probe2斜體部分的互補(bǔ)序列，在汞離子存在的情況下，Probe3的橫線部分會與Probe1的橫線部分形成“T-Hg²⁺-T”結(jié)構(gòu)，接著引發(fā)Probe3的斜體部分與Probe1斜體部分進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，釋放Probe2，完成鏈置換過程。同時核酸外切酶Ⅲ水解雙鏈，釋放Probe3繼續(xù)重復(fù)上述過程，實(shí)現(xiàn)信號放大。Probe4的5’端修飾-SH，通過Au-S共價鍵將Probe4修飾到納米金表面，由于Probe4的斜體部分與Probe2的斜體部分進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，在酶的作用下水解Probe4，釋放Probe2，將金納米粒子間的距離拉近，使得金納米粒子聚沉。釋放的Probe2又可繼續(xù)同Probe4雜交實(shí)現(xiàn)第二步循環(huán)信號放大。通過測量納米金溶液的吸光度來定量檢測汞離子。

本發(fā)明中汞離子的檢測是在均相溶液中實(shí)現(xiàn)的，通過鏈置換的方式來實(shí)現(xiàn)信號的放大，從而實(shí)現(xiàn)汞離子的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。

均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：Probe1與Probe2進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對。當(dāng)有汞離子存在時，由于Probe1與Probe3中的堿基T與目標(biāo)物之間形成“T-Hg²⁺-T”的特異性復(fù)合結(jié)構(gòu)，引發(fā)兩條DNA鏈的剩余部分也開始進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對，從而置換出Probe2，同時核酸外切酶Ⅲ水解雙鏈，釋放Probe3繼續(xù)重復(fù)上述過程，實(shí)現(xiàn)信號放大。

在均相反應(yīng)中，反應(yīng)條件為37℃，反應(yīng)時間是30min。

所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）進(jìn)行納米金粒子的制備；

（2）將Probe4（含-SH）修飾到納米金粒子表面；

（3）將標(biāo)記的納米金溶液與均相反應(yīng)溶液混合。

所述的制備方法，優(yōu)選納米金粒子的制備操作步驟如下：

① 安裝好所需儀器，向三口燒瓶中加入200ml超純水（注意不要讓三口燒瓶中落入灰塵）；

② 取500uL（0.04g/ml）HAuCl₄于單個包裝的離心管中，用移液槍取500ul于 200ml超純水中，攪拌加熱，攪拌速度450轉(zhuǎn)左右，至煮沸；

③ 在攪拌的條件下，取3ml 1%的檸檬酸三鈉溶液快速加入溶液中，幾分鐘內(nèi)，溶液顏色由淺黃色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱15min后，撤去熱源，慢慢冷卻至室溫，至于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

④ 取60ul金納米顆粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2600紫外可見分光光度計對其進(jìn)行光吸收波譜掃描，根據(jù)波長在530nm處的摩爾消光系數(shù)3.0×10⁹M^-1cm^-1計算出金納米顆粒溶液的濃度約為0.3nM。

所述的制備方法，優(yōu)選將Probe4（含-SH）修飾到金納米粒子表面的具體操作步驟如下：

① 取1 mL納米金溶液于離心管中，離心10 min，同時離心兩管備用。離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300 μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口。

② 室溫放置30 min后，加入150 μL濃度為30 μM的修飾了-SH的底物探針（Probe4），混合均勻后，4 ℃下放置24 h。

③ 分多次緩慢加入50 μL PB緩沖液，加入磁子（前一天用王水浸泡）攪拌10 min后，繼續(xù)加入27 μL PBS緩沖液。取出磁子，4 ℃放置48 h。

④ 將標(biāo)記好的納米金溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入滅菌水至1 mL，離心10 min，去除上清液。再加入1 mL滅菌水離心，此過程重復(fù)兩次（為了洗脫未標(biāo)記上的DNA鏈）。

該發(fā)明的檢測方式是納米金比色檢測，利用水解DNA鏈將金納米粒子間距離拉近，使其產(chǎn)生聚沉，從而產(chǎn)生顏色的變化。在檢測之前，先通過Au-S鍵將Probe4修飾到金納米粒子表面。然后將反應(yīng)后的均相溶液與標(biāo)有Probe4的納米金粒子混合，在37℃孵育1h完成酶的水解過程。最后，通過檢測溶液的紫外吸收光譜進(jìn)行目標(biāo)物的檢測。

本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，利用“T-Hg²⁺-T”的錯配結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)鏈置換等溫放大特性構(gòu)建了適體生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)汞離子現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實(shí)現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的定量檢測。

所述的制備方法，優(yōu)選將標(biāo)記的納米金溶液與均相反應(yīng)溶液混合，37℃水浴下反應(yīng)1h。

本發(fā)明的有益效果：

1、利用了核酸適配體的特異型識別，利用“T-Hg²⁺-T”的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物汞離子的高特異性檢測；

2、利用鏈置換循環(huán)放大功能，實(shí)現(xiàn)了Probe2和Probe3的循環(huán)利用，放大了檢測信號，提高了檢測的靈敏度，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物汞離子的超靈敏性檢測；

3、該傳感器的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快；

4、由于使用納米金比色法，其檢測方法操作簡便、檢測周期短、易攜帶；

5、檢測原理的主要過程均是在均相中實(shí)現(xiàn)的，提高了反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快速，簡單，靈敏的檢測；

6、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，納米金比色的重復(fù)性好，適用于食品安全及水體中汞離子的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實(shí)際應(yīng)用；

7、制作該生物傳感器的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價廉的要求。

附圖說明

圖1為該實(shí)驗(yàn)的原理圖；

圖2為實(shí)施例1 Probe1濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖3為實(shí)施例2 Probe2濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖4為實(shí)施例3 Probe3濃度優(yōu)化檢測結(jié)果圖；

圖5為實(shí)施例4傳感器檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

（1）進(jìn)行納米金粒子的制備；

（2）將Probe4修飾到納米金粒子表面；

（3）將標(biāo)記的納米金溶液與均相反應(yīng)溶液混合。

所述的制備方法，優(yōu)選納米金粒子的制備操作步驟如下：

①安裝好所需儀器，向三口燒瓶中加入200ml超純水（注意不要讓三口燒瓶中落入灰塵）；

②取500uL（0.04g/ml）HAuCl₄于單個包裝的離心管中，用移液槍取500ul與200ml超純水中，攪拌加熱，攪拌速度450轉(zhuǎn)左右，至煮沸；

③在攪拌的條件下，取3ml 1%的檸檬酸三鈉溶液快速加入溶液中，幾分鐘內(nèi)，溶液顏色由淺黃色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)加熱15min后，撤去熱源，慢慢冷卻至室溫，至于4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

④取60ul金納米顆粒溶液于微量比色皿中，使用UV-2600紫外可見分光光度計對其進(jìn)行光吸收波譜掃描，根據(jù)波長在530nm處的摩爾消光系數(shù)3.0×10⁹M^-1cm^-1計算出金納米顆粒溶液的濃度約為0.3nM。

所述的制備方法，優(yōu)選將Probe4（含-SH）修飾到金納米粒子表面的具體操作步驟如下：

① 取1 mL納米金溶液于離心管中，離心10 min，同時離心兩管備用。離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300 μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口；

② 室溫放置30 min后，加入150 μL濃度為30 μM的修飾了-SH的底物探針（Probe4），混合均勻后，4 ℃下放置24 h；

③ 分多次緩慢加入50 μL PB緩沖液，加入磁子（前一天用王水浸泡）攪拌10 min后，繼續(xù)加入27 μL PBS緩沖液。取出磁子，4 ℃放置48 h；

④ 將標(biāo)記好的納米金溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入滅菌水至1 mL，離心10 min，去除上清液。再加入1 mL滅菌水離心，此過程重復(fù)兩次（為了洗脫未標(biāo)記上的DNA鏈）。

該發(fā)明的檢測方式是納米金比色檢測，利用水解DNA鏈將金納米粒子間距離拉近，使其產(chǎn)生聚沉，從而產(chǎn)生顏色的變化。在檢測之前，先通過Au-S鍵將Probe4修飾到金納米粒子表面。然后將反應(yīng)后的均相溶液與標(biāo)有Probe4的納米金粒子混合，然后在37℃水浴1 h完成鏈置換的循環(huán)放大過程。最后，通過檢測溶液的紫外吸收光譜進(jìn)行目標(biāo)物的檢測。

本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識別，利用“T-Hg²⁺-T”的錯配結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)鏈置換等溫放大特性構(gòu)建了適體生物傳感器。該傳感器具有檢測速度快，檢測限低，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)汞離子現(xiàn)有檢測方法的缺陷與不足，實(shí)現(xiàn)對其快速，準(zhǔn)確的定量檢測。

所述的制備方法，優(yōu)選將標(biāo)記的納米金溶液與均相反應(yīng)溶液混合，37℃水浴下反應(yīng)1h。

實(shí)施例1

將Probe4修飾到金納米粒子表面的步驟如下：

a、 取1 mL納米金溶液于離心管中，離心10 min，同時離心兩管備用。離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300 μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口；

b、 室溫放置30 min后，加入150 μL濃度為30 μM的修飾了-SH的底物探針（Probe4），混合均勻后，4 ℃下放置24 h；

c、 分多次緩慢加入50 μL PB緩沖液，加入磁子（前一天用王水浸泡）攪拌10 min后，繼續(xù)加入27 μL PBS緩沖液。取出磁子，4 ℃放置48 h；

d、 將標(biāo)記好的納米金溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入滅菌水至1 mL，離心10 min，去除上清液。再加入1 mL滅菌水離心，此過程重復(fù)兩次（為了洗脫未標(biāo)記上的DNA鏈）。

均相溶液中反應(yīng)過程的主要步驟如下：

a、 將不同濃度的Probe1（終濃度分別為4μM，6μM，8μM，10μM，12μM，14μM），Probe2（10μM），Probe3（1.0μM），核酸外切酶Ⅲ400U，5*PBS（8μL）和待測物（Hg²⁺）加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min；

b、將反應(yīng)好的溶液從水浴鍋中取出，再加入標(biāo)記好的納米金溶液（20μL）, 放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h；

c、 1 h后，從水浴鍋中取出混合溶液。觀察顏色變化，并且用紫外可見分光光度計測定混合溶液的吸收值，據(jù)此檢測目標(biāo)物。

上述過程中用到的溶液的制備方法：

5*PBS緩沖液是由以下方法配制：Na₂HPO₄ (100mM)，NaH₂PO₄ (100mM)，NaCl (700 mM)，MgCl₂ (5 mM)，最終溶液的pH值為7.4。

配置的5*PBS緩沖液與所用超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將5*PBS和超純水分別放置在不同的錐形瓶中，然后用錫箔紙和報紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120 ℃的溫度下滅菌20 min。

結(jié)果見圖2，從圖中可以看出，檢測到的紫外吸收峰值隨著Probe1的濃度在4-10 μM區(qū)間內(nèi)增大而減小，當(dāng)濃度超過10μM后，吸收峰值趨于穩(wěn)定。所以Probe1的最佳終濃度為10μM。

實(shí)施例2

將Probe4修飾到金納米粒子表面的步驟如下：

a、 取1 mL納米金溶液于離心管中，離心10 min，同時離心兩管備用。離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300 μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口；

b、 室溫放置30 min后，加入150 μL濃度為30 μM的修飾了-SH的底物探針（Probe4），混合均勻后，4 ℃下放置24 h；

c、 分多次緩慢加入50 μL PB緩沖液，加入磁子（前一天用王水浸泡）攪拌10 min后，繼續(xù)加入27 μL PBS緩沖液。取出磁子，4 ℃放置48 h；

d、 將標(biāo)記好的納米金溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入滅菌水至1 mL，離心10 min，去除上清液。再加入1 mL滅菌水離心，此過程重復(fù)兩次（為了洗脫未標(biāo)記上的DNA鏈）。

均相溶液中反應(yīng)過程的主要步驟如下：

a、將不同濃度的Probe2（終濃度分別為4μM，6μM，8μM，10μM，12μM，14μM），Probe1（10μM），Probe3（1.0μM），核酸外切酶Ⅲ400U，5*PBS（8μL）和待測物（Hg²⁺）加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min；

b、將反應(yīng)好的溶液從水浴鍋中取出，再加入標(biāo)記好的納米金溶液（20μL），放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h；

c、1 h后，從水浴鍋中取出混合溶液。觀察顏色變化，并且用紫外可見分光光度計測定混合溶液的吸收值，據(jù)此檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，檢測到的紫外吸收峰值隨著Probe2的濃度在4-10 μM區(qū)間內(nèi)增大而減小，當(dāng)濃度超過10 μM后，吸收峰值趨于穩(wěn)定。所以Probe2的最佳終濃度為10μM。

實(shí)施例3

將Probe4修飾到金納米粒子表面的步驟如下：

a、 取1 mL納米金溶液于離心管中，離心10 min，同時離心兩管備用。離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300 μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口；

b、 室溫放置30 min后，加入150 μL濃度為30 μM的修飾了-SH的底物探針（Probe4），混合均勻后，4 ℃下放置24 h；

c、 分多次緩慢加入50 μL PB緩沖液，加入磁子（前一天用王水浸泡）攪拌10 min后，繼續(xù)加入27 μL PBS緩沖液。取出磁子，4 ℃放置48 h；

d、 將標(biāo)記好的納米金溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入滅菌水至1 mL，離心10 min，去除上清液。再加入1 mL滅菌水離心，此過程重復(fù)兩次（為了洗脫未標(biāo)記上的DNA鏈）。

均相溶液中反應(yīng)過程的主要步驟如下：

a、將不同濃度的Probe3（終濃度分別為0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Probe1（10μM），Probe2（10μM），核酸外切酶Ⅲ400U，5*PBS（8μL）和待測物（Hg²⁺）加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min；

b、將反應(yīng)好的溶液從水浴鍋中取出，再加入標(biāo)記好的納米金溶液（20μL），放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h；

c、1 h后，從水浴鍋中取出混合溶液。觀察顏色變化，并且用紫外可見分光光度計測定混合溶液的吸收值，據(jù)此檢測目標(biāo)物。

結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，檢測到的紫外吸收峰值隨著Probe3的濃度在0.4-1.0 μM區(qū)間內(nèi)增大而減小，當(dāng)濃度超過1.0 μM后，吸收峰值趨于穩(wěn)定。所以，Probe3的最佳終濃度為1.0 μM。

實(shí)施例4

一種本發(fā)明所述基于鏈置換的納米金比色法檢測汞離子的生物傳感器的制備方法：

將Probe4修飾到金納米粒子表面的步驟如下：

a、 取1 mL納米金溶液于離心管中，離心10 min，同時離心兩管備用。離心至上清液無色透明，去除上清液，加入300 μL滅菌水使納米金溶液濃縮至3 nM。移入1 mL玻璃瓶中，用錫箔紙封口；

b、 室溫放置30 min后，加入150 μL濃度為30 μM的修飾了-SH的底物探針（Probe4），混合均勻后，4 ℃下放置24 h；

c、 分多次緩慢加入50 μL PB緩沖液，加入磁子（前一天用王水浸泡）攪拌10 min后，繼續(xù)加入27 μL PBS緩沖液。取出磁子，4 ℃放置48 h；

d、 將標(biāo)記好的納米金溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入滅菌水至1 mL，離心10 min，去除上清液。再加入1 mL滅菌水離心，此過程重復(fù)兩次（為了洗脫未標(biāo)記上的DNA鏈）。

至此金納米粒子的修飾完成，下面介紹一下均相溶液中發(fā)生的反應(yīng)，均相反應(yīng)中的主要步驟：

a、將10μL Probe1（10μM），10μL Probe2（10μM），10μL Probe3（1.0μM），5μL核酸外切酶Ⅲ400U，5*PBS（8μL）和10μL不同濃度的待測物Hg²⁺（終濃度為0 nM，1 nM，5 nM，10 nM，50 nM，100 nM，500 nM，1 μM，5 μM）加入離心管中，震蕩30s，放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)30 min；

b、將反應(yīng)好的溶液從水浴鍋中取出，再加入標(biāo)記好的納米金溶液（20μL）, 放入37℃的水浴鍋中反應(yīng)1 h；

c、1 h后，從水浴鍋中取出混合溶液。觀察顏色變化，并且用紫外可見分光光度計測定混合溶液的吸收值，據(jù)此檢測目標(biāo)物。

檢測結(jié)果如圖5所示，圖中我們可以看到，在汞離子的濃度在1nM 到5 μM時，汞離子濃度的對數(shù)與紫外吸收峰值的大小成正比關(guān)系，擬合曲線：A = 0.394*logC -0.046（A是紫外吸收峰值，C是汞離子的濃度），同時，我們在1 nM的濃度基礎(chǔ)上繼續(xù)向更低的濃度檢測，經(jīng)檢測當(dāng)濃度低于1 nM時，紫外吸收峰值與濃度的關(guān)系恰好不再符合擬合曲線規(guī)律，即圖中的吸收峰值的最高點(diǎn)因此可得到該方法的檢測下限為1 nM。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110>濟(jì)南大學(xué)

<120>一種檢測汞離子的比色傳感器及其制備方法

<160>2

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>引物

<400>1

GGT CAC GCT TTC TTC TTT CTT TC 23

<210>2

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(15)

<223>引物

<400>2

GAA AGC GTG ACA CAG 15

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400> 3

GTT TGT TTG TTG TTA GCG TGA CGG TC 26

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(12)

<223>引物

<400> 4

TTT CAC GCT TTC 12