本發(fā)明涉及活細菌檢測，尤其是涉及一種基于光聲成像技術(shù)的活細菌檢測方法。

背景技術(shù)：

微生態(tài)是人類腸道系統(tǒng)的重要組成成分。而在人體腸道內(nèi)的微生物中絕大多數(shù)是數(shù)以百兆計的存活著的細菌。這些數(shù)目龐大的細菌大致可以分為三個大類：益生菌、致病菌和中性菌。菌群的穩(wěn)態(tài)，尤其是益生菌和致病菌的平衡，維系著人體的健康。益生菌主要包括：乳桿菌、酪酸梭菌、雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、放線菌、酵母菌等，而人體的致病菌主要包括：致病性大腸埃希菌、沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌、脆弱擬桿菌、耶爾森菌等。

宿主-微生物共生存在，每個人類個體的胃腸道中包含大約10¹³～10¹⁴個微生物體，平均約有600,000種微生物基因，不同菌屬間相對豐度存在一定的個體差異。腸道菌群的多樣性受遺傳、飲食、年齡、環(huán)境、區(qū)域差異和抗生素使用等因素的影響，當腸道細菌的多樣性下降會破壞菌群的穩(wěn)定性。消化道微生態(tài)與結(jié)直腸癌及大腸腺瘤癌變密切相關(guān)。結(jié)直腸癌、腺瘤性息肉病患者與健康人群的黏膜組織或者糞便中的腸道微生物構(gòu)成進行比較分析，發(fā)現(xiàn)微生物多樣性和優(yōu)勢菌群降低。腸道微生物使腸道黏膜促炎癥反應(yīng)信號傳導機制異常，導致腸道黏膜上皮損傷修復加劇，加之某些腸道微生物及其在代謝產(chǎn)物對腸道黏膜上皮細胞具有直接的細胞毒性作用，受損腸道黏膜上皮的不完全修復，最終導致結(jié)直腸腫瘤的形成和惡變。

隨著宏基因組學、高通量測序和生物信息學分析技術(shù)的不斷發(fā)展，人類對微生物群落在健康和疾病中的作用認識的越來越精確。雖然這些檢測技術(shù)存在精確度高的優(yōu)勢，然而耗時久、成本高，無法檢測活細菌的實時狀態(tài)，臨床實用性相對不足。因而，研發(fā)低成本、簡便易操作、快速檢測活細菌的方法，具有重大意義。

參考文獻：

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供可用于檢測單種細菌或兩種混合細菌，快速、便捷的檢測益生菌與致病菌的相對濃度，為臨床指導治療提供重要參考價值的提供一種基于光聲成像技術(shù)的活細菌檢測方法。

本發(fā)明所述基于光聲成像技術(shù)的活細菌檢測方法之一，包括以下步驟：

1)將光聲成像增強劑加入活細菌的培養(yǎng)液中進行孵育，為了保證細菌活力并促進細菌對探針的吞噬，得細菌溶液；

在步驟1)中，所述光聲成像增強劑可選自吲哚菁綠，所述吲哚菁綠的濃度可為0.4mg/μl，吸收峰為790nm波長，在光聲成像儀器最適波長680～980nm范圍之內(nèi)，且對細菌無殺傷作用，所述光聲成像儀可采用美國endranexus128光聲成像系統(tǒng)；所述吞噬的溫度可37℃，吞噬的轉(zhuǎn)速可為200rpm，吞噬的時間可為8～12h。

2)將所得細菌溶液取150μl，加入體積為200μl的新ep管中，進行基于光聲成像技術(shù)的活細菌檢測方法。

本發(fā)明所述基于光聲成像技術(shù)的活細菌檢測方法之二，包括以下步驟：

1)將兩種不同的光聲成像增強劑分別加入益生菌和致病菌的培養(yǎng)液中進行孵育，為了保證細菌活力并促進細菌對探針的吞噬，益生菌為乳桿菌、酪酸梭菌、雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、放線菌、酵母菌等中的一種；致病菌為大腸埃希菌、沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌、脆弱擬桿菌、耶爾森菌等中的一種；

在步驟1)中，所述光聲成像增強劑可為普魯士藍，所述普魯士藍的濃度為0.4mg/μl，吸收峰為713nm波長，在光聲成像儀器最適波長680～980nm范圍之內(nèi)，且對細菌無殺傷作用，所述光聲成像儀可采用美國endranexus128光聲成像系統(tǒng)；所述吞噬的溫度可37℃，吞噬的轉(zhuǎn)速可為200rpm，吞噬的時間可為8～12h。

2)將所得益生菌細菌溶液和致病菌細菌溶液各取75μl混合，加入體積為200μl的新ep管中，進行基于光聲成像技術(shù)的活細菌檢測方法，根據(jù)所得光聲強度值，計算出益生菌與致病菌的相對濃度比例。

在步驟2)中，所述計算出益生菌與致病菌的相對濃度比例的計算公式如下：

其中，e為致病菌在不同波長處的光聲信號值；f為益生菌在不同波長處的光聲信號值；g為大腸桿菌與乳酸桿菌的混合菌液分別在800nm和720nm不同波長處的光聲信號值，分別指示吲哚菁綠和普魯士藍所標記的活細菌；c為不同細菌的濃度。

本發(fā)明通過活細菌染色培養(yǎng)，基于光聲成像技術(shù)的活細菌檢測，將活細菌進行培養(yǎng)和染色，應(yīng)用光聲成像技術(shù)進行細菌檢測的方法，可以用于單種活細菌的快速光聲成像檢測，也可用于兩種活細菌的混合相對濃度鑒定。本發(fā)明的優(yōu)勢在于可將活菌直接用于檢測，具有操作簡單、檢測快速、無輻射、低成本等明顯優(yōu)勢。

附圖說明

圖1為基于光聲成像技術(shù)的單種活細菌(乳酸桿菌)、增強劑(吲哚菁綠)及溶劑吸收峰圖。在圖1中，曲線a為lac，b為lac-icg，c為medium。

圖2為基于光聲成像技術(shù)的單種活細菌(大腸桿菌)、增強劑(普魯士藍)及溶劑吸收峰圖。在圖2中，曲線a為e.coli，b為e.coli-pb，c為medium。

圖3為基于光聲成像技術(shù)的單種活細菌(乳酸桿菌)檢測結(jié)果圖。

圖4為基于光聲成像技術(shù)的單種活細菌(大腸桿菌)檢測結(jié)果圖。

圖5為基于光聲成像技術(shù)的兩種活細菌(720nm波長)混合檢測結(jié)果圖。

圖6為基于光聲成像技術(shù)的兩種活細菌(800nm波長)混合檢測結(jié)果圖。

圖7為基于光聲成像技術(shù)的單種活細菌檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

實施例1：

參見圖1～4，一種基于光聲成像技術(shù)的單種活細菌檢測方法，步驟如下：

(1)單種活細菌染色培養(yǎng)

將光聲成像增強劑加入含有活細菌的培養(yǎng)液中進行孵育，細菌培養(yǎng)液依據(jù)不同菌株的生長條件選擇最適培養(yǎng)液。為了保證細菌活力并促進細菌對探針的吞噬，采用溫度37℃，轉(zhuǎn)速200rmp，時間8～12h。光聲增強劑一為：吲哚菁綠，其濃度為0.4mg/ml。其特征在于吸收峰為790nm波長，在光聲成像儀器最適波長680～980nm范圍之內(nèi)，且對細菌無殺傷作用。聲增強劑二為：普魯士藍，其濃度為0.4mg/ml。其特征在于吸收峰為713nm波長，在光聲成像儀器最適波長680～980nm范圍之內(nèi)，且對細菌無殺傷作用。

(2)將上述所得細菌溶液取150μl，加入體積為200微生的新ep管中，應(yīng)用美國endranexus128光聲成像系統(tǒng)進行光聲成像檢測。

實施例2：

參見圖5～7，一種基于光聲成像技術(shù)的兩種活細菌混合檢測方法，步驟如下：

(1)單種活細菌分別染色培養(yǎng)

將兩種不同的光聲成像增強劑分別加入含有益生菌或致病菌的培養(yǎng)液中進行孵育，依據(jù)不同菌株的生長條件選擇最適培養(yǎng)液。為了保證細菌活力并促進細菌對探針的吞噬，采用溫度37℃，轉(zhuǎn)速200rmp，時間8～12h。光聲增強劑一為：吲哚菁綠，其濃度為0.4mg/ml。其特征在于吸收峰為790nm波長，在光聲成像儀器最適波長680～980nm范圍之內(nèi)，且對細菌無殺傷作用。聲增強劑二為：普魯士藍，其濃度為0.4mg/ml。其特征在于吸收峰為713nm波長，在光聲成像儀器最適波長680～980nm范圍之內(nèi)，且對細菌無殺傷作用。

(2)將上述所得益生菌細菌溶液和致病菌細菌溶液各取75μl混合，加入體積為200μl的新ep管中，應(yīng)用美國endranexus128光聲成像系統(tǒng)進行光聲成像檢測。益生菌為乳桿菌、酪酸梭菌、雙歧桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、放線菌、酵母菌等。致病菌為大腸埃希菌、沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌、脆弱擬桿菌、耶爾森菌等。

(3)根據(jù)所得光聲強度值，計算出益生菌與致病菌的相對濃度比例。

計算公式如下：

其中，e為致病菌在不同波長處的光聲信號值；f為益生菌在不同波長處的光聲信號值；g為大腸桿菌與乳酸桿菌的混合菌液分別在800nm和720nm不同波長處的光聲信號值，分別指示吲哚菁綠和普魯士藍所標記的活細菌；c為不同細菌的濃度。

本發(fā)明旨在改進現(xiàn)有針對人體細菌的檢測技術(shù)耗時久、成本高，無法檢測活細菌的實時狀態(tài)等限制。本發(fā)明的優(yōu)勢在于低成本、簡便易操作、能夠快速檢測活細菌，臨床實用性相對較大，具有重大意義。