本發(fā)明公開了一種生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是一種降低最低檢出限檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的方法。

背景技術(shù)：

β-內(nèi)酰胺酶，英文名β-lactamase，由革蘭氏陽性菌代謝產(chǎn)生的一種酶蛋白，可選擇性分解牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺類抗生素，其原理是青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)被β-內(nèi)酰胺酶破壞而失去活性，如青霉素和頭孢菌素等。牛奶中的β-內(nèi)酰胺酶的可能來源有兩種，第一種是外源性，某些奶農(nóng)或廠家為了殺滅細(xì)菌防止新鮮牛奶腐敗，人為直接添加青霉素殺菌后解抗添加進(jìn)牛奶中的。第二種是內(nèi)源性，某些奶農(nóng)為給奶牛治療某些疾病采用注射廉價(jià)的青霉素類抗生素或在飼料中中添加青霉素，引起奶牛擠出的牛奶中青霉素殘留或β-內(nèi)酰胺酶殘留。目前常規(guī)方法無法正確判斷是否為“無抗奶”，掩蓋解抗劑即β-內(nèi)酰胺酶從而掩蓋了青霉素等抗生素超標(biāo)的事實(shí)。β-內(nèi)酰胺酶無論是在國外還是在我國都是不允許使用的食品添加劑。到目前為止，國內(nèi)外對(duì)β-內(nèi)酰胺酶各方面的研究是比較少的，甚至連溫度對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活性的影響程度都不確定，更糟糕的也未見是β-內(nèi)酰胺酶及其代謝產(chǎn)物的食用安全性報(bào)道。

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)市售牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)，本發(fā)明提出了一種在ph計(jì)檢測(cè)法的基礎(chǔ)上加入酸堿滴定法進(jìn)行檢測(cè)，此方法提出的一種新型β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)方法是最適合目前我國市場(chǎng)需求的快速，經(jīng)濟(jì)，精確的檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了實(shí)現(xiàn)對(duì)市售牛奶β-內(nèi)酰胺酶殘留的檢測(cè)，同時(shí)也為解決目前我國缺少經(jīng)濟(jì)，精確，快速的β-內(nèi)酰胺酶殘留檢測(cè)的問題，達(dá)到讓消費(fèi)者放心的目的，本發(fā)明提出了一種在ph計(jì)檢測(cè)法的基礎(chǔ)上加入酸堿滴定法使其最終最低檢出限大大降低的檢測(cè)方法，其技術(shù)方案如下：

一種降低最低檢出限檢測(cè)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶殘留的方法，其特征在于：利用ph計(jì)法做單因素試驗(yàn)確定酶最適反應(yīng)溫度、酶反應(yīng)最適底物濃度、酶反應(yīng)最適反應(yīng)時(shí)間，再進(jìn)行酸堿滴定法檢測(cè)樣品中β-內(nèi)酰胺酶含量，并檢測(cè)出最低檢出限。

進(jìn)一步的，所述酸堿滴定法具體包括如下步驟：

(1)用無抗奶粉和50℃-100℃溫水以1：6至1:10的比例配置成牛奶，冷卻至室溫后分別裝入五組錐形瓶，每組5-10ml；

(2)向步驟(1)中的錐形瓶中分別加入濃度為0.01-1g/ml的青霉素儲(chǔ)備液和濃度為1-10u/μl的β-內(nèi)酰胺酶儲(chǔ)備液，震蕩均勻；

(3)將步驟(2)中的錐形瓶以保鮮膜封口并置于酶最適反應(yīng)溫度水浴鍋中水浴，水浴完成后以沸水浴滅菌5-20s；

(4)滅菌后向錐形瓶中加入指示劑，震蕩均勻并觀察顏色變化，以naoh進(jìn)行滴定，記錄滴定數(shù)據(jù)；

(5)根據(jù)滴定數(shù)據(jù)計(jì)算產(chǎn)酸速度和酶濃度。

進(jìn)一步的，所述步驟(4)滴定時(shí)naoh濃度為0.001-0.005mol/l或0.010-0.015mol/l，滴定量為8ml—12ml。

進(jìn)一步的，所述步驟收(3)中指示劑為甲基紅指示劑，用量為1-10滴。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)中五組錐形瓶中β-內(nèi)酰胺酶儲(chǔ)備液用量為0μl、3μl、4μl、5μl、6μl。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明利用ph計(jì)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，主要測(cè)定反應(yīng)溫度、青霉素鉀底物濃度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)于整體反應(yīng)的影響，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定最適反應(yīng)條件。以最適條件為前提進(jìn)行不同β-內(nèi)酰胺酶濃度實(shí)驗(yàn)，根據(jù)牛奶中所含酸量選用不同濃度的naoh進(jìn)行滴定，以甲基紅為指示劑，顏色的變化較清晰，靈敏度高，操作簡單，成本低，耗時(shí)短。相比于原本的酸度計(jì)法，改進(jìn)了酸度法檢出限較高的問題，大大降低了β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限，適用于目前我國市售牛奶檢測(cè)的現(xiàn)狀。

附圖說明

圖1為牛奶ph值受不同底物濃度影響變化圖。

圖2為牛奶ph值受不同反應(yīng)溫度影響變化圖。

圖3為牛奶ph值受不同反應(yīng)時(shí)間影響變化圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明：

實(shí)施例1：

一、ph計(jì)法測(cè)定牛奶中的最適酶促反應(yīng)溫度：

準(zhǔn)確稱取無抗奶粉6g，和80℃溫水以1：10配制牛奶溶液60ml,分6組,其中包含一組空白對(duì)照組，放入離心管中，每組加入β-內(nèi)酰胺酶2ml,用旋渦混合器充分振蕩，放入溫度分別為25℃、30℃、32.5℃、35℃、37.5℃、40℃不同溫度的水浴鍋中水浴，將青霉素鉀同時(shí)加入到空白和試驗(yàn)管中，振蕩均勻，立即用實(shí)驗(yàn)室ph計(jì)測(cè)量，三次測(cè)量ph值計(jì)算取平均值，具體參數(shù)值如下表所示：

通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪制牛奶ph值受不同反應(yīng)溫度影響變化圖，如圖2所示，經(jīng)過圖2的比較以及誤差分析可知，當(dāng)溫度達(dá)到32.5℃時(shí)，酶反應(yīng)速度最快，誤差最小。因此，本實(shí)驗(yàn)選取32.5℃為最適反應(yīng)溫度。

二、最適反應(yīng)青霉素鉀的質(zhì)量濃度：

分別準(zhǔn)確稱取無抗奶粉5g，和80℃溫水以1：8，配制牛奶溶液50ml,共5組，每組加入β-內(nèi)酰胺酶2ml，把牛奶樣品放入最適酶反應(yīng)溫度32.5℃恒溫水浴鍋中，依次加入質(zhì)量濃度為0mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml的底物青霉素鉀，測(cè)量其ph，計(jì)算分析出最適酶促反應(yīng)青霉素鉀的質(zhì)量濃度，數(shù)據(jù)記錄入下表所示：

通過上述表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行繪制不同底物濃度影響變化圖，如圖1所示，當(dāng)?shù)孜餄舛?mg/ml上升到15mg/ml過程中，牛奶ph值變化量始終在上升，在15mg/ml達(dá)到最高點(diǎn)，隨后再增加底物濃度則ph值變化不大，呈平穩(wěn)趨勢(shì)。由此可知，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到15mg/ml時(shí)，酶反應(yīng)速率最大，ph值變化最快。因此，在32.5℃最適反應(yīng)溫度下，根據(jù)米氏原理，青霉素鉀底物量達(dá)到15mg/ml，即為最適反應(yīng)濃度。

三、最適酶促反應(yīng)時(shí)間：

分別準(zhǔn)確稱取無抗奶粉6g，和100℃溫水以1：10，配制牛奶溶液60ml,共6組，其中包含一組空白對(duì)照組，每組加入β-內(nèi)酰胺酶2ml，將青霉素鉀同時(shí)加入到空白和試驗(yàn)管中，振蕩用旋渦混合器充分振蕩，使其混合均勻，立即用實(shí)驗(yàn)室ph計(jì)測(cè)量，計(jì)算取平均值，計(jì)算分析出最適酶促反應(yīng)時(shí)間，數(shù)據(jù)記錄入下表所示：

通過上表數(shù)據(jù)進(jìn)行繪制牛奶ph值受不同反應(yīng)時(shí)間影響變化圖，如圖3所示，在最適反應(yīng)溫度32.5℃，最適反應(yīng)底物濃度15mg/ml，最終酶濃度60u/ml情況下，牛奶中ph值隨反應(yīng)時(shí)間的增長不斷降低，當(dāng)時(shí)間到達(dá)50min時(shí)，ph值降至最低，隨后延長時(shí)間，ph值變化不大，趨于穩(wěn)定，即此時(shí)酶與青霉素鉀充分反應(yīng)。因此，我們選取50min作為最適酶反應(yīng)時(shí)間。

四、不同濃度β-內(nèi)酰胺酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)驗(yàn)分析出最低檢出限：

分別準(zhǔn)確稱取無抗奶粉配制牛奶溶液8g，和80℃溫水以1：10配制牛奶溶液80ml,共6組，每組分別放入青霉素鉀2ml放入32.5℃恒溫水浴鍋中，使每只離心管中β-內(nèi)酰胺酶的最終濃度分別為0u/ml、5u/ml、10u/ml、20u/ml、40u/ml、60u/ml、80u/ml、100u/m，立即用實(shí)驗(yàn)室ph計(jì)測(cè)量，分析計(jì)算畫出不同濃度β-內(nèi)酰胺酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析出最低檢出限。五、酸堿滴定法檢測(cè)牛奶用內(nèi)酰胺酶的最低檢出限

(1)用無抗奶粉，80℃溫水按1:10的比例配置成牛奶，冷卻至室溫后分別裝入編號(hào)1-5的錐形瓶中，每瓶10ml；

(2)每瓶牛奶中加入2ml濃度為0.1g/ml的青霉素儲(chǔ)備液，使其濃度達(dá)到16mg/ml；

(3)1號(hào)瓶為空白對(duì)照組，2-5號(hào)瓶分別加入3,4,5,6微升濃度為5u/μl的β-內(nèi)酰胺酶儲(chǔ)備液，使其濃度分別為1.25u/ml,1.67u/ml,2.08u/ml,2.5u/ml，震蕩均勻；

(4)以保鮮膜封口，置于32.5℃水浴鍋中水浴50min；

(5)50min后立即取出以沸水浴10s滅酶；

(6)每瓶加入3滴甲基紅指示劑，震蕩均勻，觀察顏色；

(7)使用ph試紙測(cè)定2號(hào)瓶ph值，測(cè)得當(dāng)牛奶中β-內(nèi)酰胺酶含量為5u/ml時(shí)，牛奶ph值為5.7，則若ph大于等于5.7則選用濃度為0.005mol/l的naoh進(jìn)行滴定，若ph小于5.7則選用濃度為0.015mol/l的naoh進(jìn)行滴定，因?yàn)椴煌瑵舛鹊臍溲趸c適用于不同ph的牛奶，使滴定量穩(wěn)定在8-12ml之間，數(shù)據(jù)更精確；

(8)滴定前期以較快速度滴定，后期以每兩秒一滴的速度滴定直到終點(diǎn)；

(9)記錄滴定數(shù)據(jù)，計(jì)算產(chǎn)酸速度，根據(jù)米氏方程計(jì)算酶濃度，以此來確定牛奶中是否非法添加了酶，以及確定了酶濃度。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。