本發(fā)明涉及一種ppt級hg²⁺的安培分析方法，具體是涉及一種基于t-hg²⁺-t相互作用和酶促沉積金屬放大信號的ppt級hg²⁺的安培分析方法。

背景技術(shù)：

汞是最毒的重金屬元素之一，可以引起各個年齡階段的人的多種健康問題，如腦傷害、腎衰竭以及不同程度的認(rèn)知和運(yùn)動障礙[ariya,p.a.;amyot,m.;dastoor,a.;deeds,d.;feinberg,a.;kos,g.;poulain,a.;ryjkov,a.;semeniuk,k.;subir,m.;toyota,k.chem.rev.2015,115,3760]。世界衛(wèi)生組織（who）和美國環(huán)境保護(hù)署（epa）分別規(guī)定飲用水中汞的含量不能超過1μg/l(1ppb)和2μg/l(2ppb)[aragay,g.;pons,j.;merkocci,a.chem.rev.2011,111,3433]。依照《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（gb3838-2002）中規(guī)定，i類水中汞含量不能超過50ppt。所以，開發(fā)新型高效且靈敏的檢測ppt級hg2+的方法很有必要。

katz首次發(fā)現(xiàn)胸腺嘧啶（t）可以與hg²⁺相互作用后[katz,s.j.am.chem.soc.1952,74,2238]，許多研究工作者利用t-hg²⁺-t復(fù)合物來制備電化學(xué)、比色或者熒光傳感用于檢測hg²⁺。酶催化金屬沉積放大電化學(xué)信號在生化分析領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。lai和其團(tuán)隊發(fā)展了一種基于alp標(biāo)記抗體并催化銀沉積用于信號放大的多通路免疫傳感，實現(xiàn)了higg和migg的同時檢測[lai,g.s.;yan,f.;wu,j.;leng,c.;ju,h.x.anal.chem.2011,83,2726]。wang等報道了一種利用alp催化沉積銀放大信號的三明治型的分析方法用于檢測血液中的小分子rna[si,y.m.;sun,z.z.;qi,w.;li,s.y.;chen,l.j.;wang,h.anal.chem.2014,86,10406]。盡管有很多關(guān)于利用酶催化金屬沉積用于信號放大的研究，但是沒有發(fā)現(xiàn)利用這種方法進(jìn)行電化學(xué)檢測重金屬離子的報道。另外，現(xiàn)有常見的直接檢測可溶性酶促產(chǎn)物的方法存在擴(kuò)散效應(yīng)，會有檢測下限不低、靈敏度低的弊端。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種ppt級hg²⁺的安培分析方法，該方法可以最大限度的放大檢測信號，實現(xiàn)目標(biāo)檢測物hg²⁺的超敏檢測，且條件溫和，操作方便。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種ppt級hg²⁺的安培分析方法，包括以下步驟：

（1）以酶標(biāo)記的dna電極為工作電極，在工作電極上以酶（即標(biāo)記分子）為中心，進(jìn)行酶促沉積金屬的反應(yīng)：在酶標(biāo)記的dna電極上加入酶促反應(yīng)液，反應(yīng)完成后得到富含金屬單質(zhì)的電極表面；

所述酶促反應(yīng)液包括酶底物和對應(yīng)的金屬鹽溶液或氯金酸溶液；

本步驟中，通過酶催化酶底物所得的產(chǎn)物和金屬鹽溶液或氯金酸溶液發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成金屬單質(zhì)沉積在酶附近；可顯著降低目標(biāo)物的檢測下限；

（2）將步驟（1）所得富含金屬單質(zhì)的電極表面用于hg²⁺的電化學(xué)分析，用原位陽極溶出伏安法獲得該工作電極上所富集的金屬的溶出伏安信號，從而間接實現(xiàn)樣品中hg²⁺的定量分析，使得電化學(xué)方法可以檢測ppt級的hg²⁺。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述酶為能催化底物產(chǎn)生具有還原性物質(zhì)的酶，如葡萄糖氧化酶或堿性磷酸酯酶等。所述酶底物的體積為1μl~10ml（濃度不同則體積不同）。

進(jìn)一步，步驟（1）中，酶底物的濃度為1μmol/l稀溶液~飽和溶液。

進(jìn)一步，步驟（1）中，酶底物為所用酶對應(yīng)的底物。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述金屬鹽溶液為能與酶促產(chǎn)物發(fā)生氧化還原生成金屬單質(zhì)的金屬鹽溶液；所述金屬鹽溶液濃度為1μmol/l稀溶液~飽和溶液。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述金屬鹽溶液的體積為1μl~10ml（濃度不同則體積不同）。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述金屬鹽為氯金酸鉀、氯金酸鈉、亞硫酸金鈉、亞硫酸金鉀或硝酸銀。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述酶標(biāo)記的dna電極制備步驟為：通過t-hg²⁺-t配位，標(biāo)記了生物素的信號探針與捕獲探針結(jié)合，形成復(fù)合物；標(biāo)記了酶分子的親和素，再通過生物素-親和素間的作用，使酶分子與所得復(fù)合物結(jié)合，制得酶標(biāo)記的dna電極。

進(jìn)一步，步驟（2）中，空氣中預(yù)先施加能夠?qū)崿F(xiàn)酶促沉積金屬的離子態(tài)電沉積的陰極電位（參見cn103472123b）為足夠?qū)崿F(xiàn)擴(kuò)散控制的金屬電沉積的陰極電位；所述足夠?qū)崿F(xiàn)擴(kuò)散控制的金屬電沉積的陰極電位為1.0v（vs.sce）~-0.2v（vs.sce）；“vvs.sce”意為相對于飽和甘汞電極的電位（伏特）。

進(jìn)一步，步驟（2）中，使用陽極溶出伏安法對金屬離子進(jìn)行定量分析時，采用兩電極或三電極體系。

本發(fā)明是對重金屬離子hg²⁺進(jìn)行定量分析，并且是在ppt級檢測目標(biāo)分析物的電化學(xué)分析方法，檢測靈敏度高、成本低、簡便、適于野外現(xiàn)場分析等；通過與金屬鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)捕獲酶促產(chǎn)物，并通過原位陽極溶出可以有效放大檢測信號，可實現(xiàn)hg²⁺的ppt級檢測。

附圖說明

圖1（a）和圖1（b）為本發(fā)明實施例方法的實驗步驟示意圖；

圖中：

圖2（a）為實施例中本發(fā)明方法在酶促金屬沉積后定量分析hg²⁺的電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖；

圖2（b）為實施例中本發(fā)明方法在酶促金屬沉積后定量分析hg²⁺的電極上檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2（c）為對比例方法中，直接通過t-hg²⁺-t配位定量分析hg²⁺的電極上、采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖；

圖2（d）為對比例方法中，直接通過t-hg²⁺-t配位定量分析hg²⁺的電極上檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

參考例

以下為實施例使用的修飾電極（即酶標(biāo)記的dna電極）的制備方法：

玻碳電極（gce）先后在0.5微米（μm）和0.05μm的氧化鋁懸濁液中打磨拋光處理，再用超純水沖洗電極表面（將電極表面的氧化鋁粉末沖洗干凈），接下來分別在超純水、乙醇、超純水中各超聲5min以除去電極表面殘留的氧化鋁粉末；然后，在電極表面滴加濃h2so4（18.4mol/l）洗液并保持15s，用超純水沖洗；最后用電化學(xué)清洗以徹底除去電極表面的污染物；電化學(xué)清洗步驟為：在10ml0.5mol/lh2so4中以-1.0v到1.0v以0.1v/s的掃速循環(huán)伏安掃描至穩(wěn)定；處理好的玻碳電極用超純水沖洗（將電極表面殘留的h2so4沖洗干凈）。然后用氮氣吹干用于電沉積auplate。

通過雙電位階躍法將auplate沉積到處理好的玻碳電極上，即在含有2.0mmol/lhaucl4的0.50mol/lh2so4中，從1.1v至0v脈沖電鍍180s（auplate/gce）即可；將電極洗凈，氮氣吹干，滴上10μl含1.0μmol/l巰基化的捕獲探針（p1）和1.0mol/lnacl的tris–hno3緩沖液（ph7.4），濕潤環(huán)境下室溫吸附2h以達(dá)到飽和(p1/auplate/gce)；緩沖液洗掉多余的p1，用1mmol/l6-巰基己醇（mch）暗處理30min以封閉非特異性吸附位點(mch/p1/auplate/gce)；tris–hno3緩沖液洗后，mch/p1/auplate/gce在不用的時候4℃在tris–hno3緩沖液中保存。

將制備好的mch/p1/auplate/gce修飾電極在含1.0μmol/l生物素化的信號探針（p2）和不同濃度的hg²⁺hepes緩沖液中37℃孵育40min，形成p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce；

tris–hno3緩沖液清洗后，在電極上滴6μl含1wt%牛血清白蛋白（bsa）的tris–hno3緩沖液以封閉非特異性酶吸附位點，孵育10min(bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce)；tris–hno3緩沖液清洗掉多余的bsa后，電極再滴10μl0.03mg/ml堿性磷酸酯酶標(biāo)記的親和素（strep-alp），室溫下反應(yīng)35min，得到酶標(biāo)記的dna電極（strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce）；未使用時，電極保存在4℃的hepes緩沖液中。

實施例：hg²⁺的電分析

本實施例為對重金屬離子hg²⁺進(jìn)行定量分析的方法，比較本發(fā)明與常規(guī)方法的分析性能。

本實施例包括以下步驟：

（1）本發(fā)明方法：在制備好的strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce電極上進(jìn)行酶促金屬沉積反應(yīng)，簡單來說就是在上述制備的電極上滴加10μl含1mmol/lagno3,1.5mmol/l抗壞血酸磷酸二酯鈉（sap）和4mmol/lnh3·h2o（加入nh3·h2o防止agno3和sap形成不溶物）的酶促反應(yīng)液，37℃下暗反應(yīng)20min，得到富含金屬銀單質(zhì)的電極表面（ag/strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce）；最終得到的電極用超純水洗三次，使用之前自然烘干。

對比例：在參考例中制備的p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce電極上直接檢測汞的信號。

（2）檢測方法：參照中國發(fā)明專利“基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”（參見cn103472123b），①在三電極系統(tǒng)中（工作電極為上述實施例中的修飾電極），空氣中接上電化學(xué)儀器并預(yù)先施加能夠充分實現(xiàn)酶促沉積的金屬ag離子（或能夠?qū)崿F(xiàn)通過t-hg²⁺-t配位捕獲的hg²⁺）電沉積的陰極電位-0.3v（vs.sce），再將10μl2mol/lhno3加至電極表面并導(dǎo)通電解池，使金屬沉積物溶解為ag⁺，并同時將ag⁺電還原成原子態(tài)金屬ag，從而在電極表面富集上金屬銀（或富集hg）。②直接在原工作電極表面，使用差分脈沖陽極溶出伏安法（dpv）檢測金屬銀陽極溶出為銀離子的信號，檢測條件為：-0.3v(vs.sce（飽和甘汞電極）)沉積10min，掃描區(qū)間為-0.3~0.7v（或直接檢測hg²⁺的信號，掃描區(qū)間為-0.3~0.4v），獲得該工作電極上所富集到的金屬銀的陽極溶出電流信號，從而間接實現(xiàn)樣品中目標(biāo)分析物hg²⁺的定量分析（或直接實現(xiàn)hg²⁺的定量分析）。

測定結(jié)果分析：結(jié)合圖2進(jìn)行討論，圖2給出了兩種方法中對不同濃度hg²⁺的信號響應(yīng)，圖2（a）為實施例中本發(fā)明方法在酶促金屬沉積后得到的ag/strep-alp/bsa/p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖；圖2（b）為實施例中本發(fā)明方法在酶促金屬沉積后得到的hg²⁺檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2（c）為對比例中在通過t-hg²⁺-t配位得到的p2/hg²⁺/mch/p1/auplate/gce電極上，采用差分脈沖陽極溶出伏安法檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的原圖；圖2（d）為對比例中在通過t-hg²⁺-t配位得到的hg²⁺檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。從圖中可知，隨著hg²⁺濃度增加，電流響應(yīng)也隨之增加；本發(fā)明方法的響應(yīng)信號明顯大于對比例方法；本發(fā)明中銀的氧化電流響應(yīng)與hg²⁺濃度線性范圍為0.1nmol/l~250μmol/l，檢測下限為0.01nmol/l（2ppt）（信噪比為3），對比例方法是通過t-hg²⁺-t配位捕獲hg²⁺直接測汞的氧化電流，線性范圍為2.5μmol/l~1mmol/l，檢測下限為0.5μmol/l（100ppb）；本發(fā)明方法線性范圍寬，檢測下限低，參照國家發(fā)明專利“基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”（專利號：201310459224.4）的電化學(xué)檢測方法使得檢測下限達(dá)到了ppt級水平。

綜上所述，本發(fā)明涉及的分析方法靈敏度高、操作簡便、通用性好，與“基于金屬標(biāo)記和生物親和的原位陽極溶出伏安分析方法”發(fā)明專利（專利號：201310459224.4）方法的聯(lián)用，實現(xiàn)了酶促金屬沉積用于ppt級hg²⁺的電化學(xué)檢測，并且在實際樣品中的檢測結(jié)果令人滿意，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。