背景技術(shù)：

1、注意，以下討論涉及作者的多個(gè)公開(kāi)和公開(kāi)年份，并且由于最近的公開(kāi)日期，某些公開(kāi)不應(yīng)被認(rèn)為是有關(guān)本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。為了背景更完整，提供了本文中對(duì)這些公開(kāi)的討論，并且該討論不應(yīng)被視為是對(duì)于以下的承認(rèn)：這些公開(kāi)是出于專利性確定目的的現(xiàn)有技術(shù)。

2、2020年，全球據(jù)估計(jì)有180萬(wàn)人死于肺癌。據(jù)估計(jì)，僅在美國(guó)，2022年就將有130180人死于肺癌?？傮w而言，肺癌的五年存活率仍很低，為22.9％，因?yàn)榇蠖鄶?shù)患者表現(xiàn)為晚期疾病。美國(guó)國(guó)家肺部篩查試驗(yàn)(nlst)證實(shí)ldct篩查在高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體(即年齡在55-74歲、吸煙指數(shù)>30且目前正在吸煙或在過(guò)去15年內(nèi)已戒煙的人)中檢測(cè)出93.8％的肺癌。在美國(guó)(us)，低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(ldct)是肺癌篩查的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理。ldct的靈敏度為93.8％，但其特異性為73.4％，這在無(wú)肺癌患者中導(dǎo)致了潛在有害的隨訪程序。因此，需要具有高準(zhǔn)確度的可以用作ldct的輔助來(lái)診斷肺癌的其它測(cè)定。當(dāng)所鑒定的結(jié)節(jié)較小時(shí)，低劑量螺旋計(jì)算機(jī)斷層掃描可能不會(huì)產(chǎn)生明確的治療路徑。

3、nlst顯示與通過(guò)胸部放射照相術(shù)的篩查相比，ldct篩查導(dǎo)致肺癌特異性死亡率總體降低20％。不幸地，在該試驗(yàn)中，96.4％的陽(yáng)性ldct掃描是假陽(yáng)性，這導(dǎo)致約90％的陽(yáng)性ldct患者接受額外程序以確定在其ldct掃描中觀察到的結(jié)節(jié)是否是癌性的。這些程序，包括成像、活組織檢查和手術(shù)切除，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的不良影響，包括死亡。解釋ldct掃描和模型以評(píng)估結(jié)節(jié)為癌性的概率的新指南改善了假陽(yáng)性率(fpr)。盡管如此，只有一小部分符合條件的患者接受了ldct篩查。未能傳達(dá)篩查益處和潛在危害(無(wú)論是由于缺乏知識(shí)還是時(shí)間)、與ldct相關(guān)的費(fèi)用、缺少獲得ldct的途徑以及來(lái)自連續(xù)ldct掃描的重復(fù)輻射暴露都可能導(dǎo)致篩查的低采用率。

4、幫助醫(yī)生更確定地做出或排除肺癌診斷的一種簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)、無(wú)輻射且成本有效的測(cè)試可以減少不必要的隨訪程序并提高肺癌篩查。痰液是一種容易獲得的體液，其長(zhǎng)期以來(lái)一直是肺癌診斷的一部分。由papanicolaou開(kāi)發(fā)并由saccomanno優(yōu)化，pap痰液細(xì)胞學(xué)測(cè)試是第一個(gè)肺癌診斷方法，其可追溯到20世紀(jì)60年代。對(duì)于該測(cè)試，用pap染色標(biāo)記兩個(gè)痰液涂片載玻片，并由專門(mén)從事肺細(xì)胞學(xué)的病理學(xué)家讀取。痰液細(xì)胞學(xué)的靈敏度差異很大；然而，其特異性很高。一項(xiàng)對(duì)16項(xiàng)已發(fā)表的痰液細(xì)胞學(xué)研究(包括超過(guò)28000名患者)的綜述報(bào)道靈敏度范圍為42％至97％，平均靈敏度為66％，而特異性平均為99％。

5、痰液細(xì)胞學(xué)的靈敏度較差，這部分歸因于樣品不足，并且只分析了一小部分樣品。由于所產(chǎn)生的樣品是唾液或者涂片中的粘液/碎片/紅細(xì)胞掩蓋了準(zhǔn)確分析所需的細(xì)胞組分，因此可能會(huì)出現(xiàn)不足的情況。隨著時(shí)間的推移，對(duì)原有痰液細(xì)胞學(xué)測(cè)試的改變改善了其靈敏度。噴霧器和輔助裝置，如阿卡貝拉(acapella)和肺笛(lung?flute)，以及患者對(duì)如何產(chǎn)生肺部痰液樣品的正確指導(dǎo)的堅(jiān)持，已表明改善了患者產(chǎn)生痰液的能力。液體細(xì)胞學(xué)測(cè)試和自動(dòng)載玻片制備裝置可以減少痰液涂片的背景污染物，并因此提高載玻片的質(zhì)量。提高讀取的樣品數(shù)也顯示提高了發(fā)現(xiàn)指示肺癌的異常細(xì)胞的可能性。

6、卟啉，如tcpp，目前在膀胱癌和外科手術(shù)中用作診斷試劑以識(shí)別癌性組織的邊緣。使用顯微鏡檢查，我們表明通過(guò)用熒光卟啉tcpp標(biāo)記痰液細(xì)胞，我們可以使用基于載玻片的測(cè)定(基于細(xì)胞學(xué)的方法)和分級(jí)人員以高準(zhǔn)確度區(qū)分患有肺癌的研究參與者和未患病的研究參與者?；诩?xì)胞學(xué)的方法的實(shí)用性有限，因?yàn)樽x取載玻片是耗時(shí)的，并且需要高度專業(yè)化的人員。此外，大量碎片和過(guò)多鱗狀上皮細(xì)胞(sec)或頰細(xì)胞(cheek?cell)的存在往往使樣品不足以用于診斷。由于基于載玻片的測(cè)定是耗時(shí)的，通常阻止對(duì)整個(gè)樣品進(jìn)行分析，并由此可能遺漏重要事件，并且分級(jí)人員引入了主觀偏差(也稱為操作員偏差，即不同分級(jí)人員之間不一致)，因此用于分析痰液以確定癌癥可能性的替代方法將是有用的。

7、根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，顯示了使用流式細(xì)胞術(shù)平臺(tái)，在不堵塞儀器的情況下分析整個(gè)痰液樣品以鑒定由診斷患有肺癌的人獲得的樣品與由未患該疾病的人獲得的樣品之間的顯著差異的可行性。

8、通過(guò)篩查早期檢測(cè)肺癌可以提高存活并降低發(fā)病率。美國(guó)和英國(guó)某些地區(qū)現(xiàn)在提倡每年對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體進(jìn)行低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描(ldct)篩查。因此，陽(yáng)性ldct結(jié)果需要隨訪測(cè)試以確定結(jié)節(jié)是良性還是惡性的。這些醫(yī)療程序具有固有的發(fā)病率和死亡率風(fēng)險(xiǎn)6，并且可以對(duì)篩查參與者及其家庭造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，同時(shí)相關(guān)費(fèi)用對(duì)患者和社會(huì)來(lái)說(shuō)是巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

9、因此，工作已轉(zhuǎn)向開(kāi)發(fā)無(wú)創(chuàng)測(cè)試，它既可與ldct結(jié)合使用，也可作為獨(dú)立測(cè)試以鑒定肺癌高風(fēng)險(xiǎn)并應(yīng)接受ldct的人。在這兩種情況下，這些測(cè)試的目標(biāo)都是為低風(fēng)險(xiǎn)患者消除不必要的醫(yī)療程序，同時(shí)在早期階段鑒定肺癌患者。一種容易從肺部獲得的材料是痰液，其含有多種血細(xì)胞和剝落的支氣管上皮細(xì)胞7，包括肺癌患者的癌前細(xì)胞和惡性細(xì)胞。我們先前已報(bào)道了一種基于載玻片的測(cè)定，其能夠由四(4-羧基苯基)卟啉(tcpp)染色的痰液對(duì)癌癥和非癌癥患者進(jìn)行分類。盡管準(zhǔn)確率為81％，但讀取標(biāo)記的載玻片非常耗時(shí)，易受觀察者偏差的影響，并且可能會(huì)因采樣不足而錯(cuò)過(guò)關(guān)鍵的低頻事件。利用自動(dòng)流式細(xì)胞術(shù)(fcm)進(jìn)行痰液樣品分析的高通量方法可以改善基于載玻片分析的缺陷。

10、所公開(kāi)的實(shí)施方式已組合了流式細(xì)胞術(shù)和機(jī)器學(xué)習(xí)以開(kāi)發(fā)基于痰液的測(cè)試，該測(cè)試可以幫助醫(yī)生在這些情況下作出決定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了用于分析來(lái)自懷疑患有肺癌的受試者的痰液樣品的流式細(xì)胞儀方法。從懷疑患有肺癌的受試者的痰液樣品中獲得多個(gè)細(xì)胞，例如痰液樣品的單細(xì)胞懸液。用i)多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物、ii)細(xì)胞存活力組合物和iii)四(4-羧基苯基)卟啉(tcpp)組合物標(biāo)記所述多個(gè)細(xì)胞。例如，i)包括cd206、cd3、cd19、cd66b、cd45、epcam、panck及其任意組合中的至少3個(gè)、或至少4個(gè)、或至少5個(gè)、或至少6個(gè)，并且任意組合可以明確排除cd206、cd3、cd19、cd66b、cd45、epcam、panck中的任一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，ii)細(xì)胞存活力組合物優(yōu)先于活細(xì)胞標(biāo)記死細(xì)胞，并且可以包括fvs510。用流式細(xì)胞儀分析用i-iii標(biāo)記的多個(gè)細(xì)胞以獲得基于自動(dòng)選擇的珠尺寸排阻門(mén)從所述多個(gè)細(xì)胞中對(duì)于細(xì)胞尺寸所選的亞群。例如，將珠尺寸排阻門(mén)設(shè)置在5μm至約30μm之間，其中不進(jìn)一步分析小于約5μm和大于約30μm的事件。例如，分析步驟包括從所述多個(gè)細(xì)胞獲得側(cè)向散射、前向散射、來(lái)自tcpp的熒光、來(lái)自細(xì)胞存活力組合物的熒光和來(lái)自多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物的熒光的流式細(xì)胞術(shù)值。使用自動(dòng)非碎片門(mén)(例如，自動(dòng)非碎片門(mén)將大多數(shù)死細(xì)胞排除在非碎片群體之外)和自動(dòng)單細(xì)胞門(mén)(例如，將自動(dòng)單細(xì)胞門(mén)應(yīng)用于在自動(dòng)非碎片門(mén)中所選擇的細(xì)胞群體)，從細(xì)胞尺寸選擇的亞群中選擇活的單細(xì)胞群體?；诙鄠€(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物、存活力標(biāo)志物和tcpp標(biāo)志物，從活的單細(xì)胞群體中獲得了流式細(xì)胞儀值。將經(jīng)訓(xùn)練的分類器應(yīng)用于來(lái)自受試者的元數(shù)據(jù)(例如，年齡)和所獲得的流式細(xì)胞術(shù)值?；诮?jīng)訓(xùn)練的分類器的應(yīng)用，生成痰液樣品的分類，其中該分類選自包括癌癥和非癌癥的多個(gè)分類選項(xiàng)。例如，經(jīng)訓(xùn)練的分類器是

2、

3、其中b0-b5系數(shù)是通過(guò)將經(jīng)訓(xùn)練的分類器擬合至用于構(gòu)建分類器的多個(gè)痰液樣品來(lái)確定的。

4、在一個(gè)實(shí)施方式中，多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物包括熒光抗cd206、熒光抗cd3、熒光抗cd19和熒光抗cd66b。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分類器是通過(guò)將分類器模型擬合至用于構(gòu)建分類器的具體樣品集所確定的包括系數(shù)b0-b5的線性方程。

5、另一個(gè)實(shí)施方式提供了流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)自動(dòng)分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括與其中存儲(chǔ)有流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)器通訊的計(jì)算機(jī)處理器，所述流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)來(lái)自受試者痰液樣品的多個(gè)細(xì)胞中的多種標(biāo)志物，其中所述多種標(biāo)志物包括i)多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物、ii)細(xì)胞存活力組合物和iii)四(4-羧基苯基)卟啉(tcpp)組合物。例如，i)包括cd206、cd3、cd19、cd66b、cd45、epcam、panck及其任意組合中的至少3個(gè)、或至少4個(gè)、或至少5個(gè)、或至少6個(gè)，并且任意組合可以明確排除cd206、cd3、cd19、cd66b、cd45、epcam、panck中的任一個(gè)。在另一個(gè)實(shí)施例中，ii)細(xì)胞存活力組合物優(yōu)先于活細(xì)胞標(biāo)記死細(xì)胞，并且可以包括fvs510。該系統(tǒng)還提供了一種包含在永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品，該計(jì)算機(jī)程序產(chǎn)品包括用于使計(jì)算機(jī)處理器執(zhí)行以下操作的指令。接收從痰液樣品的多個(gè)細(xì)胞采集的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。從痰液樣品中的多個(gè)細(xì)胞中選擇基于選自珠尺寸排阻門(mén)、存活力門(mén)和單細(xì)胞門(mén)的自動(dòng)門(mén)的應(yīng)用自動(dòng)選擇的細(xì)胞亞群。例如，將珠尺寸排阻門(mén)設(shè)置在5μm至約30μm之間，其中不進(jìn)一步分析小于約5μm且大于約30μm的事件，例如自動(dòng)非碎片門(mén)從非碎片群體中排除了大部分死細(xì)胞，例如，將自動(dòng)單細(xì)胞門(mén)應(yīng)用于在自動(dòng)非碎片門(mén)中所選擇的細(xì)胞群體。從所述亞群確定對(duì)于多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物、存活力標(biāo)志物和tcpp標(biāo)志物所需的流式細(xì)胞術(shù)值。將分類器應(yīng)用于所需的流式細(xì)胞術(shù)值和受試者的元數(shù)據(jù)，例如，經(jīng)訓(xùn)練的分類器是

6、

7、其中b0-b5系數(shù)是通過(guò)將經(jīng)訓(xùn)練的分類器擬合至用于構(gòu)建分類器的多個(gè)痰液樣品來(lái)確定的。

8、在顯示裝置產(chǎn)生輸出，該顯示裝置具有對(duì)于包括癌癥或非癌癥的痰液樣品的一個(gè)或多個(gè)分類的鑒定。

9、本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了一種包括程序代碼的永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，該程序代碼在被執(zhí)行時(shí)使得處理電路執(zhí)行以下操作?；诙鄠€(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物(例如，多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物選自熒光抗cd206、熒光抗cd3、熒光抗cd19和熒光抗cd66b)、存活力標(biāo)志物(例如，fvs510，但不限于此)和tcpp標(biāo)志物，獲得受試者痰液細(xì)胞的活單細(xì)胞群體的流式細(xì)胞儀值(例如，來(lái)自側(cè)向散射、前向散射、來(lái)自tcpp的熒光、來(lái)自細(xì)胞存活力組合物的熒光和來(lái)自多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物的熒光)。將經(jīng)訓(xùn)練的分類器應(yīng)用于來(lái)自受試者的元數(shù)據(jù)和所獲得的流式細(xì)胞術(shù)值?；诮?jīng)訓(xùn)練的分類器的應(yīng)用，生成痰液樣品的分類，其中該分類選自包括癌癥和非癌癥的多個(gè)分類選項(xiàng)。根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞存活力組合物優(yōu)先于活細(xì)胞標(biāo)記死細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，設(shè)置珠尺寸排阻門(mén)以排除小于約5μm和大于約30μm的事件，并從痰液樣品中選擇具有未被珠尺寸排阻門(mén)排除在進(jìn)一步分析之外的細(xì)胞尺寸的細(xì)胞亞群，并從該群體中選擇活的單細(xì)胞群體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，用自動(dòng)非碎片門(mén)選擇活的單細(xì)胞群體，自動(dòng)非碎片門(mén)從非碎片群體中排除大多數(shù)死細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。在一個(gè)實(shí)施方式中，經(jīng)訓(xùn)練的分類器是

10、

11、其中b0-b5系數(shù)是通過(guò)將經(jīng)訓(xùn)練的分類器擬合至用于構(gòu)建分類器的多個(gè)痰液樣品來(lái)確定的。

12、本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的一個(gè)方面提供了一種流式細(xì)胞術(shù)方法，例如，用于分析來(lái)自懷疑患有肺癌的受試者的痰液的自動(dòng)fcm，其中所述方法包括以下中的一種或多種：1)使用由(例如)珠標(biāo)準(zhǔn)和存活力染料所限定的設(shè)門(mén)策略來(lái)產(chǎn)生單細(xì)胞群體，從所分析的痰液樣品中消除污染物，包括碎片和鱗狀上皮細(xì)胞(sec，來(lái)自口腔的常見(jiàn)污染物)；2)包括質(zhì)量控制參數(shù)以檢測(cè)樣品中的肺泡巨噬細(xì)胞，借此驗(yàn)證每個(gè)痰液樣品的肺來(lái)源，3)為樣品充分性定義所需的細(xì)胞群體的截止值以提供可靠的分析，4)從用一種或多種白細(xì)胞和/或上皮細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物，如熒光特異性抗體或其片段和tcpp標(biāo)記的痰液來(lái)源的細(xì)胞獲得光學(xué)特征以鑒定從診斷患有肺癌的人獲得的樣品與從未患該疾病的人獲得的樣品之間的顯著差異，5)獲得受試者的元數(shù)據(jù)，例如，年齡和/或吸煙年數(shù)信息，6)基于從1-5項(xiàng)的輸出中所選的特征應(yīng)用分類器，以及7)確定所分析的痰液樣品是高于還是低于癌癥可能性數(shù)值。如果識(shí)別出癌癥或癌癥可能性，則處理受試者以進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試。

13、本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供了一種計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的用于對(duì)來(lái)自處于肺癌風(fēng)險(xiǎn)的測(cè)試受試者的肺痰液樣品進(jìn)行分類的方法，該方法包括在至少一個(gè)處理器上接收來(lái)自測(cè)試受試者的數(shù)據(jù)。將所述至少一個(gè)處理器用于使用分類器來(lái)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)，所述分類器是分類系統(tǒng)的電子表示，所述分類器使用多個(gè)電子存儲(chǔ)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集來(lái)訓(xùn)練，所述多個(gè)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的每一個(gè)表示單獨(dú)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，其中每個(gè)單獨(dú)的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集表示單個(gè)受試者和相應(yīng)受試者的數(shù)據(jù)，每個(gè)訓(xùn)練數(shù)據(jù)集還包括對(duì)于肺癌(如果在相應(yīng)受試者中存在)表征的確定，其中所述分類系統(tǒng)包括對(duì)于肺痰液樣品的癌癥或非癌癥的鑒定?；谠u(píng)價(jià)步驟，將所述至少一個(gè)處理器用于評(píng)價(jià)來(lái)自測(cè)試受試者的測(cè)試痰液樣品的分類。在一個(gè)實(shí)施方式中，數(shù)據(jù)包括流式細(xì)胞數(shù)據(jù)、受試者元數(shù)據(jù)或其組合。例如，流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)得自用來(lái)自受試者痰液樣品的多個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)標(biāo)志物標(biāo)記的痰液樣品，其中所述多個(gè)標(biāo)志物包括i)多個(gè)細(xì)胞譜系特異性標(biāo)志物組合物、ii)細(xì)胞存活力組合物和iii)四(4-羧基苯基)卟啉(tcpp)組合物。受試者元數(shù)據(jù)包括性別、年齡、遺傳信息、生物標(biāo)志物數(shù)據(jù)、吸煙狀態(tài)、病史或其組合中的一個(gè)或多個(gè)。在其它實(shí)施方式中，存儲(chǔ)可執(zhí)行程序的永久性計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包括用于執(zhí)行計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的分類方法的指令。