本發(fā)明屬于有害物質(zhì)檢測(cè)，具體涉及一種基于磷酸銅雜化納米花的電化學(xué)-血糖儀雙模傳感器的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、黃曲霉毒素b1(afb1)是一種由霉菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。這些霉菌主要是曲霉屬的霉菌,比如黃曲霉和寄生曲霉。這些霉菌廣泛存在于自然環(huán)境中,易污染許多食物和飼料。afb1是毒性最強(qiáng)的黃曲霉毒素，有致畸、致癌作用，易造成肝臟損傷，影響動(dòng)物和人體健康。許多國(guó)家和地區(qū)都制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)限制食物和飼料中afb1的殘留量。

2、傳統(tǒng)的afb1檢測(cè)方法主要集中在色譜質(zhì)譜技術(shù)，如高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和薄層色譜法等。盡管這些方法準(zhǔn)確可靠，但是復(fù)雜耗時(shí)、儀器昂貴，不能滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和快速檢測(cè)的要求。近年來(lái)，基于適配體的方法廣泛應(yīng)用于afb1的快速檢測(cè)，主要涉及電化學(xué)、熒光、比色和表面增強(qiáng)拉曼散射等。其中電化學(xué)傳感器因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、響應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)，已被用于真菌毒素的檢測(cè)研究。然而相對(duì)復(fù)雜的讀出模式限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用，且單輸出模式容易受到環(huán)境影響，從而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此，開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速的afb1現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法十分必要。

3、血糖儀體積小、成本低、操作簡(jiǎn)單，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，但只能檢測(cè)葡萄糖這一種物質(zhì)。因此在本發(fā)明中，基于磷酸銅雜化納米花制備了雙功能信號(hào)探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)非葡萄糖靶標(biāo)的定量檢測(cè)，開(kāi)發(fā)了一種電化學(xué)-血糖儀雙模傳感器，雙輸出模式提高了傳感器的檢測(cè)準(zhǔn)確度與可靠性，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)afb1的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一種基于磷酸銅雜化納米花的電化學(xué)-血糖儀雙模傳感器的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

2、（1）信號(hào)探針的制備：將鏈霉親和素sa和硫酸銅共同加入到磷酸鹽緩沖液中，室溫反應(yīng)12?h后將溶液離心，得到鏈霉親和素修飾的磷酸銅雜化納米花(sa-cu3(po4)2hnfs)，加入互補(bǔ)鏈cdna，混合孵育2?h，形成sa-cu3(po4)2hnfs/dna復(fù)合體，在sa-cu3(po4)2hnfs/dna復(fù)合體中加入生物素化轉(zhuǎn)化酶，室溫下混合孵育2?h，并在4℃下繼續(xù)反應(yīng)過(guò)夜，完成信號(hào)探針的制備；

3、（2）信號(hào)探針/適配體/磁珠體系的構(gòu)建：將鏈霉親和素磁珠sa-mbs與適配體apt于37℃反應(yīng)1?h，完成apt與sa-mbs的固定，在apt與sa-mbs的復(fù)合體系中加入信號(hào)探針，于37℃恒溫震蕩1?h完成信號(hào)探針/適配體/磁珠體系的構(gòu)建；

4、（3）電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建：將不同濃度的afb1加入信號(hào)探針/適配體/磁珠體系中，apt與afb1結(jié)合，信號(hào)探針脫落，經(jīng)過(guò)磁分離后，將上清液中游離的信號(hào)探針滴加在金電極表面，孵育后用電化學(xué)工作站進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)，同時(shí)在沉淀中加入蔗糖溶液進(jìn)行反應(yīng)，信號(hào)探針上的轉(zhuǎn)化酶將蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，用血糖儀進(jìn)行測(cè)定，最終通過(guò)對(duì)電化學(xué)信號(hào)和血糖儀信號(hào)的響應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)afb1的電化學(xué)-血糖儀雙模檢測(cè)。

5、進(jìn)一步限定，步驟（1）中，所述的信號(hào)探針本身具有電化學(xué)信號(hào)，同時(shí)信號(hào)探針上的轉(zhuǎn)化酶將蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖。

6、進(jìn)一步限定，步驟（1）中，所述的互補(bǔ)鏈cdna的一端修飾有與sa-cu3(po4)2hnfs結(jié)合的基團(tuán)，另一端修飾有與金電極結(jié)合的基團(tuán)，為生物素、氨基、羧基、巰基中的一種或多種。

7、進(jìn)一步限定，步驟（1）中，所述的生物素化轉(zhuǎn)化酶是由轉(zhuǎn)化酶與生物素溶液、生物素酰胺基己酰肼、生物素-n-琥珀酰亞胺基酯中的一種或多種混合反應(yīng)后得到的。

8、進(jìn)一步限定，步驟（2）中，所述的適配體apt的一端修飾有與sa-mbs結(jié)合的基團(tuán)，為生物素、氨基、羧基、巰基中的一種或多種。

9、進(jìn)一步限定，步驟（2）中，所述的sa-mb濃度為10?mg/ml，所用體積為5~10?μl。

10、進(jìn)一步限定，步驟（3）中，所述的信號(hào)探針在金電極表面滴加量為5~10?μl，孵育時(shí)間為1~2?h。

11、進(jìn)一步限定，步驟（3）中，蔗糖溶液的濃度為200?mg/ml，添加量為20~50?μl，反應(yīng)溫度為40~70℃。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：

13、1.本發(fā)明首先合成了具有電化學(xué)信號(hào)的sa-cu3(po4)2hnfs，并結(jié)合互補(bǔ)鏈cdna和生物素化轉(zhuǎn)化酶作為雙功能信號(hào)探針，同時(shí)用于電化學(xué)和血糖儀檢測(cè)。

14、2.本發(fā)明避免了dna鏈的復(fù)雜反應(yīng)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了傳感器的穩(wěn)定性。

15、3.本發(fā)明利用雙模式信號(hào)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行自我監(jiān)督，有利于實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的檢測(cè)性能。

16、4.血糖儀體積小、成本低、信號(hào)響應(yīng)快，能夠應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，有利于發(fā)明的推廣應(yīng)用。

技術(shù)特征：

1.一種基于磷酸銅雜化納米花的電化學(xué)-血糖儀雙模傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟

2.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于sa-cu3(po4)2?hnfs的電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述的信號(hào)探針本身具有電化學(xué)信號(hào)，同時(shí)信號(hào)探針上的轉(zhuǎn)化酶將蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖。

3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于sa-cu3(po4)2?hnfs的電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述的互補(bǔ)鏈cdna的一端修飾有與sa-cu3(po4)2?hnfs結(jié)合的基團(tuán)，另一端修飾有與金電極結(jié)合的基團(tuán)，為生物素、氨基、羧基、巰基中的一種或多種。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于sa-cu3(po4)2?hnfs的電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（1）中，所述的生物素化轉(zhuǎn)化酶是由轉(zhuǎn)化酶與生物素溶液、生物素酰胺基己酰肼、生物素-n-琥珀酰亞胺基酯中的一種或多種混合反應(yīng)后得到的。

5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于sa-cu3(po4)2?hnfs的電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中，所述的適配體apt的一端修飾有與sa-mbs結(jié)合的基團(tuán)，為生物素、氨基、羧基、巰基中的一種或多種。

6.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于sa-cu3(po4)2?hnfs的電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（2）中，所述的sa-mb濃度為10?mg/ml，所用體積為5~10μl。

7.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于sa-cu3(po4)2?hnfs的電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（3）中，所述的信號(hào)探針在金電極表面滴加量為5~10?μl，孵育時(shí)間為1~2?h。

8.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于sa-cu3(po4)2?hnfs的電化學(xué)-血糖儀雙模適配體傳感器的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟（3）中，蔗糖溶液的濃度為200?mg/ml，添加量為20~50?μl，反應(yīng)溫度為40~70℃。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種基于鏈霉親和素修飾的磷酸銅雜化納米花(SA?Cu<subgt;3</subgt;(PO<subgt;4</subgt;)<subgt;2</subgt;?HNFs)的電化學(xué)?血糖儀雙模傳感器的構(gòu)建方法，首次制備了基于SA?Cu<subgt;3</subgt;(PO<subgt;4</subgt;)<subgt;2</subgt;?HNFs的雙功能信號(hào)探針，并將電化學(xué)和血糖儀相結(jié)合構(gòu)建了雙模傳感器，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度與可靠性，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。將信號(hào)探針與磁珠和適配體共同孵育，構(gòu)建信號(hào)探針/適配體/磁珠體系。在復(fù)合體系中加入黃曲霉毒素B1，信號(hào)探針脫落，經(jīng)過(guò)磁分離后將上清液中游離的信號(hào)探針滴加在金電極表面，孵育后用電化學(xué)工作站進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)。同時(shí)在沉淀中加入蔗糖溶液進(jìn)行反應(yīng)，用血糖儀進(jìn)行葡萄糖含量的測(cè)定，最終通過(guò)對(duì)電化學(xué)信號(hào)和血糖儀信號(hào)的響應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)黃曲霉毒素B1的電化學(xué)?血糖儀雙模檢測(cè)。

技術(shù)研發(fā)人員：衛(wèi)敏,索志光,劉嘉惠,李嘉怡,白天,劉勇,金華麗,何保山
受保護(hù)的技術(shù)使用者：河南工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10