本發(fā)明涉及新材料，具體涉及一種對豬偽狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量檢測方法。

背景技術(shù)：

1、偽狂犬病(pseudorabies，pr)是由偽狂犬病病毒(prv)引起的，可導致多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢(豬除外)及腦髓炎為主要癥狀的急性傳染病。豬是該病毒的中間宿主和傳染源，不同生長階段的豬均可感染并引起不同的臨床癥狀，豬的偽狂犬病防控對于公共衛(wèi)生學具有極其重要意義。目前，新發(fā)的偽狂犬病病毒變異株已經(jīng)遍布我國主要養(yǎng)豬地區(qū)，傳統(tǒng)的疫苗已經(jīng)無法為免疫豬提供完全的保護。

2、目前已有幾家公司陸續(xù)申報了豬偽狂犬病病毒基因工程亞單位疫苗，是應(yīng)用cho細胞表達系統(tǒng)制備的新型疫苗，重組gb+gd蛋白可有效誘導機體產(chǎn)生抵御prv的感染。cho細胞表達的gb和gd蛋白經(jīng)過純化、滅活后，與免疫佐劑混合等一系列工藝制成，其特點是可避免母源抗體干擾，商品豬首免效果好，同時可鑒別疫苗免疫和野毒感染。

3、目前常規(guī)的定量方法有bca法、紫外吸收法、lowry法、elisa法等，bca、lowry與a280紫外吸收法只能檢測樣品中總蛋白的量，無法測定樣品中目標蛋白的量，elisa法雖然特異性高，但都需要特異性單抗，原料要求高且干擾因素多，易受個人操作影響。

4、在現(xiàn)有技術(shù)中，大部分的檢測方法只能單一的檢測gb蛋白或gd蛋白；

5、如cn117402223a公開了一種牛皰疹病毒4型抗原、制備方法和應(yīng)用，其采用凝膠過濾色譜柱tskgel?g3000swxl，以20mm磷酸鹽，200mm?nacl，ph?6.8的流動相檢測bhv-4gb蛋白樣品。

6、cn113164585b公開了用于預(yù)防或治療巨細胞病毒的先天性感染的疫苗，其采用pbs作為流動相，以流速0.4ml/分鐘進行hplc凝膠過濾分析，檢測gpcmv-gb。

7、目前，沒有一個成熟的方法對gb蛋白和gd蛋白進行檢測。

8、因此，需要一種能夠快速、準確、重復性好的豬偽狂犬病病毒gb和gd蛋白hplc定性及定量檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于，提供一種對豬偽狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量檢測方法，該方法選擇分子尺寸排阻高效液相色譜柱，以加入有異丙醇的磷酸鹽緩沖液為流動相，可以有效的分離和檢測毒gd蛋白和gb蛋白，本發(fā)明的方法具有有效排除雜質(zhì)干擾，出峰時間穩(wěn)定，峰形兩側(cè)對稱，定量準確，重復性好的優(yōu)勢。

2、本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

3、一種對豬偽狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量檢測方法，以添加有3～10vol％的異丙醇的磷酸鹽緩沖液為流動相，采用分子尺寸排阻高效液相色譜柱，在流速為0.5～1.0ml/min；柱溫為18～26℃的條件下，檢測樣品中的gd和/或gb蛋白的含量。

4、在上述的hplc定量檢測方法中，所述磷酸鹽緩沖液的ph為7.2～7.4。

5、在上述的hplc定量檢測方法中，所述方法的檢測波長為280nm。

6、在上述的hplc定量檢測方法中，gb蛋白出峰時間為13.5～14.5min，gd蛋白出峰時間為17.5～18.5min。

7、在上述的hplc定量檢測方法中，所述分子尺寸排阻高效液相色譜柱的分子量分離范圍為10～500kda。

8、在上述的hplc定量檢測方法中，所述分子尺寸排阻高效液相色譜柱的型號為biocore?sec-300型號。

9、在上述的hplc定量檢測方法中，所述樣品在進樣前，樣品經(jīng)過過濾、層析、分子篩脫鹽處理。

10、在上述的hplc定量檢測方法中，層析的具體操作為：

11、使用buffer1平衡5個柱體積，每次上樣體積200ml，使用8vol％buffer2和92vol％buffer1淋洗10個柱體積，使用40vol％buffer2和60vol％的buffer1進行洗脫，收集洗脫液；

12、其中，buffer1含20mm?nah2po4，500mm?nacl，buffer1的ph為7.40；

13、buffer2含20mm?nah2po4，500mm?nacl，500mm咪唑，buffer2的ph為7.40。

14、有益效果

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過色譜柱選擇、流動相的優(yōu)化，獲得了豬偽狂犬病病毒gb或gd蛋白的單一目標峰，避免了雜峰干擾的檢測方法，并且峰型對稱性好。由hplc檢測法的操作步驟可知，只有取樣稀釋存在人為操作誤差，其余步驟均為儀器操作，故此方法簡單，準確度高，重復性好。

技術(shù)特征：

1.一種對豬偽狂犬病病毒gd和/或gb蛋白的hplc定量檢測方法，其特征在于，以添加有3～10vol％的異丙醇的磷酸鹽緩沖液為流動相，采用分子尺寸排阻高效液相色譜柱，在流速為0.5～1.0ml/min；柱溫為18～26℃的條件下，檢測樣品中的gd和/或gb蛋白的含量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hplc定量檢測方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的ph為7.2～7.4。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hplc定量檢測方法，其特征在于，所述方法的檢測波長為280nm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hplc定量檢測方法，其特征在于，gb蛋白出峰時間為13.5～14.5min，gd蛋白出峰時間為17.5～18.5min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hplc定量檢測方法，其特征在于，所述分子尺寸排阻高效液相色譜柱的分子量分離范圍為10～500kda。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的hplc定量檢測方法，其特征在于，所述分子尺寸排阻高效液相色譜柱的型號為biocore?sec-300型號。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hplc定量檢測方法，其特征在于，所述樣品在進樣前，樣品經(jīng)過過濾、層析、分子篩脫鹽處理。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的hplc定量檢測方法，其特征在于，層析的具體操作為：

技術(shù)總結(jié)
本申請屬于日化新材料領(lǐng)域，公開了一種對豬偽狂犬病病毒gD或gB蛋白的HPLC定量檢測方法，以添加有3～10vol％的異丙醇的磷酸鹽緩沖液為流動相，采用分子尺寸排阻高效液相色譜柱，在流速為0.5～1.0ml/min；柱溫為18～26℃的條件下，檢測樣品中的gD和/或gB蛋白的含量。該方法選擇分子尺寸排阻高效液相色譜柱，以加入有異丙醇的磷酸鹽緩沖液為流動相，可以有效的分離和檢測豬偽狂犬病病毒gD蛋白和gB蛋白，本發(fā)明的方法具有有效排除雜質(zhì)干擾，出峰時間穩(wěn)定，峰形兩側(cè)對稱，定量準確，重復性好的優(yōu)勢。

技術(shù)研發(fā)人員：胡美容,齊冬梅,劉秋燕,胡換儀,陳杰濤,吳峰,賴月輝,曾潔香,李文靜
受保護的技術(shù)使用者：廣東永順生物制藥股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10