本發(fā)明涉及鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估，且特別涉及一種基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、鐵皮石斛是一種珍貴名優(yōu)的食用藥材，具有補腎、益胃等傳統(tǒng)特性，作為茶、飲料、輔助食品被廣為消費。鐵皮石斛是一種復(fù)雜的植物基質(zhì)，含有大量的活性成分，如石斛多糖、聯(lián)芐和生物堿以及色素。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鐵皮石斛中的多糖等成分具有抗氧化、抗癌、抗凝血、神經(jīng)保護、保肝、免疫調(diào)節(jié)等作用。因此，鐵皮石斛在世界范圍內(nèi)被日益流行，也是研究的熱點。

2、鐵皮石斛廣泛分布在中國亞熱帶和暖溫帶的中度潮濕的土地生境中，一般生長在海拔800~1500m的腐殖質(zhì)和苔蘚覆蓋的懸崖或樹干上。由于其固有的營養(yǎng)活性成分和不適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件，鐵皮石斛容易受到真菌污染和真菌毒素殘留的影響，進而嚴(yán)重影響其質(zhì)量、安全性、療效和臨床應(yīng)用。研究表明，鐵皮石斛的生產(chǎn)受到交鏈孢屬、鐮刀菌屬等真菌屬的嚴(yán)重威脅，其中，鐮刀菌屬與鐵皮石斛枯死病有關(guān)。交鏈孢霉菌屬是多種植物常見的腐生菌或病原菌，其所有物種中已知70多種可以產(chǎn)生可能具有毒性的代謝產(chǎn)物，其中，交鏈孢酚（alternariol，aoh）、交鏈孢酚單甲醚（alternariol?monomethyl?ether，ame）、細交鏈孢酚酮酸(alternariol?ketonic?acid，tea)是交鏈孢屬主要產(chǎn)毒毒素。aoh和ame已經(jīng)確定具有遺傳毒性，其在體外實驗中也被證實具有致癌性和致突變性。真菌毒素污染不止困擾鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)，給該行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，而且嚴(yán)重影響人類和動物健康，是一個嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。隨著鐵皮石斛在世界范圍內(nèi)的消費量逐漸增長，其食用安全性問題成為關(guān)注的重點。

3、鑒于鐵皮石斛是一種復(fù)雜的植物基質(zhì)，在分析之前必須進行提取以分離目標(biāo)物質(zhì)和純化或凈化以去除雜質(zhì)。真菌毒素提取最廣泛使用的技術(shù)是固相萃?。╯olid-phaseextraction，spe）、免疫親和柱（immunoaffinity?column，iac）或者quechers，以進行提取、純化或凈化，然而以上昂貴且復(fù)雜的前處理體系，不利于大規(guī)模的樣品分析。由于真菌毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性、真菌毒素的共存、真菌毒素的濃度較低以及存在基質(zhì)的復(fù)雜性，采用靈敏可靠的方法對其進行高效檢測和風(fēng)險評估對于鐵皮石斛食用安全性具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法，通過對鐵皮石斛樣品的檢測條件進行優(yōu)化，可實現(xiàn)高靈敏度和高選擇性定量，以及通過采用從保守假設(shè)的點評估到更接近實際的概率評估這樣一種階層式的評估方法，從而實現(xiàn)了更為精細的評估，提供了更加明確、可靠的有關(guān)風(fēng)險大小和可能范圍的信息。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

3、本發(fā)明提出一種基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法，包括以下步驟：

4、s1、樣品提取及凈化：在鐵皮石斛樣品中加入提取劑，震蕩提取、靜置后，取上清液加入交鏈孢霉毒素同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液混勻，經(jīng)冷凍、離心，得到待測液；

5、s2、采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對所述待測液進行檢測；

6、s3、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將所述待測液的檢測結(jié)果與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計算出所述鐵皮石斛樣品中交鏈孢霉毒素的含量；

7、s4、采用點評估法進行初步評估篩檢，點評估結(jié)果超過毒理學(xué)關(guān)注閾值的交鏈孢霉毒素再采用概率評估法進一步評估，其中，根據(jù)所述鐵皮石斛樣品中交鏈孢霉毒素的含量分布計算相對應(yīng)的交鏈孢霉毒素的日暴露量，從而計算慢性暴露風(fēng)險熵。

8、本發(fā)明實施例的基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法的有益效果是：

9、1、本發(fā)明開發(fā)了一種新的樣品制備方法，通過優(yōu)化的色譜/質(zhì)譜條件進行sida-uhplc-ms/ms分析，對各種實驗參數(shù)進行了研究、優(yōu)化和驗證。這種預(yù)處理方案只需一步振蕩和冷凍，且只需受過最低程度培訓(xùn)的人員即可完成，無需額外的凈化、氮氣吹掃濃縮或再溶解步驟。該lc-ms/ms方法已經(jīng)過徹底優(yōu)化，因而可實現(xiàn)高靈敏度和高選擇性定量，對大規(guī)模食品安全監(jiān)測計劃相當(dāng)具有吸引力。

10、2、現(xiàn)有的交鏈孢霉毒素的lc-ms法測定時，液相流動相體系大都需要添加基體改進劑，如碳酸氫銨、甲酸銨、乙酸銨、甲酸等，以改善目標(biāo)色譜峰型，特別是tea容易出現(xiàn)峰展寬、拖尾等。本發(fā)明優(yōu)化的色譜方法簡單、高效，采用shim-pack?scepter?[metal?free]色譜柱，它是一種惰性色譜柱，不銹鋼主體帶有peek內(nèi)襯，其填料和內(nèi)壁都不含金屬，因此非常適合分析易于離子吸附和金屬螯合的目標(biāo)物，例如tea。流動相體系無需添加常用的基改劑，只需使用對液質(zhì)體系友好的水和乙腈即可獲得很好的分離和響應(yīng)，分析操作更簡單，且精密儀器（lc-ms）不易受損。

11、3、本發(fā)明首次公布了基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法。首先進行風(fēng)險監(jiān)測方法的開發(fā)建立，經(jīng)過風(fēng)險監(jiān)測獲得污染物數(shù)據(jù)，再開展慢性暴露風(fēng)險評估體系建模，分別建立確定性評估模型和概率性評估模型，由初步篩檢到精細評估。本評估體系采用的是從保守假設(shè)的點評估到更接近實際的概率評估這樣一種階層式的評估方法。概率評估模型采用經(jīng)驗分布函數(shù)的monte?carlo模擬，量化人群個體間的變異性，并采用bootstrap方法量化模型參數(shù)的不確定性。高階層概率性風(fēng)險評估是對原有確定性評估方法的改進和提高，更實際地代表了食藥品中真實的污染情況，可定量地描述人群化學(xué)物暴露的變異性和不確定性，從而實現(xiàn)了更為精細的評估，提供了更加明確、可靠的有關(guān)風(fēng)險大小和可能范圍的信息，有助于做出更為科學(xué)的決策。本發(fā)明的基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法為食藥物質(zhì)的安全性評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.一種基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中，所述提取劑為乙腈-水-甲酸溶液，所述鐵皮石斛樣品和所述乙腈-水-甲酸溶液的質(zhì)量體積比為1：8（g/ml），其中，所述乙腈-水-甲酸溶液中，乙腈、水和甲酸的體積比為70：29：1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中，所述交鏈孢霉毒素同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液包括13c10-細交鏈孢酚酮酸、13c22-騰毒素、13c14-交鏈孢酚和13c15-交鏈孢酚單甲醚。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中，所述震蕩提取的時間為15~25min，所述靜置的時間不少于30min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s1中，所述冷凍的溫度為-16~-25℃，冷凍時間不少于1h。

6.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s2中，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測的液相色譜條件為：shim-pack?scepter?c18-120?[metal?free]?column?(2.1?mm?×100?mm,?1.9?μm）；流動相：水-乙腈；流速：0.30?ml/min；柱溫：35℃；進樣量：2?μl。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s2中，檢測的質(zhì)譜條件為：離子源：電噴霧離子源(esi)；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(mrm)。

8.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s4中，所述暴露量的計算公式如式（1）所示；所述慢性暴露風(fēng)險熵計算公式如式（2）所示：

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟s4中，所述采用點評估法進行初步評估，若交鏈孢霉毒素的所述暴露量不超過毒理學(xué)關(guān)注閾值，則認(rèn)為該交鏈孢霉毒素健康風(fēng)險可以接受，若所述暴露量超過毒理學(xué)關(guān)注閾值，則采用概率評估法進行評估。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種基于交鏈孢霉毒素暴露特征的鐵皮石斛安全性風(fēng)險評估模型體系構(gòu)建方法，包括在風(fēng)險監(jiān)測鐵皮石斛樣品中加入提取劑，震蕩提取、靜置后，取上清液加入交鏈孢霉毒素同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液混勻，經(jīng)冷凍、離心，得到待測液；采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對待測液進行檢測；然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算出鐵皮石斛樣品中交鏈孢霉毒素的含量；隨后采用點評估法進行初步風(fēng)險評估篩檢，點評估結(jié)果超過毒理學(xué)關(guān)注閾值的交鏈孢霉毒素再采用概率性的慢性暴露評估模型進一步評估。本發(fā)明通過優(yōu)化預(yù)處理方案和色譜/質(zhì)譜條件可實現(xiàn)檢測的高靈敏度和高選擇性定量。此外，本發(fā)明將風(fēng)險監(jiān)測所得毒素含量作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，構(gòu)建風(fēng)險評估模型體系，采用從保守假設(shè)的點評估到更接近實際的概率性風(fēng)險評估模型，從而實現(xiàn)了更為精細、可靠的風(fēng)險評估，有助于做出更為科學(xué)的決策。

技術(shù)研發(fā)人員：林宏琳,陳偉偉,林國斌,倪蕾,陳華峰
受保護的技術(shù)使用者：福建省疾病預(yù)防控制中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10