本發(fā)明涉及生命科學(xué)分析，特別是涉及一種用于meca基因檢測(cè)的dna電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來(lái)，抗生素耐藥基因(args)受到越來(lái)越多的關(guān)注，已成為一個(gè)日益嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)，其中最引人注目的是，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)作為最著名的細(xì)菌之一，正在全球范圍內(nèi)傳播，對(duì)抗生素的高度耐藥，給治療帶來(lái)了極大的困難。mrsa的耐藥機(jī)制主要依賴于meca基因，其編碼青霉素結(jié)合蛋白(pbp2a)，可水解破壞β-內(nèi)酰胺類抗生素獲得耐藥性。在選擇壓力條件下，meca基因可通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移在各種微生物中廣泛傳播，這不僅增加了環(huán)境病原體獲得抗生素耐藥性的可能性，也增加了人類和動(dòng)物直接暴露于args的途徑和頻率。因此，迫切需要開發(fā)一種新穎、簡(jiǎn)便的超靈敏檢測(cè)meca基因的方法。目前，廣泛采用聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qpcr)和下一代測(cè)序等分子方法檢測(cè)args。盡管這些方法可以提供精確和全面的信息，然而，由于缺乏敏感性，傳統(tǒng)的pcr僅限于定性檢測(cè)，樣品中的干擾物會(huì)抑制dna擴(kuò)增，造成分析偏差，不利于實(shí)際樣品的定量分析?；趐cr的技術(shù)需要昂貴和精密的實(shí)驗(yàn)室儀器，不利于現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，為了解決這個(gè)問(wèn)題，人們?cè)O(shè)計(jì)了大量的光學(xué)生物傳感器。然而，光學(xué)傳感器的低靈敏度限制了其應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)一種新的檢測(cè)方法從而實(shí)現(xiàn)對(duì)meca基因的高靈敏性檢測(cè)。

2、目前電化學(xué)傳感器具有價(jià)格低廉、反應(yīng)速度快、小型化等顯著特點(diǎn)，在基因檢測(cè)方面顯示出巨大的潛力，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。各種放大信號(hào)的策略如納米材料、電活性化合物和長(zhǎng)鏈聚合物等被用于構(gòu)建生物傳感器，保證了電化學(xué)dna傳感器優(yōu)異的靈敏度，它的成功開發(fā)對(duì)各個(gè)領(lǐng)域的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值，被認(rèn)為特別適合用于直接和快速的傳感檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種用于meca基因檢測(cè)的dna電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題。利用該dna電化學(xué)傳感器檢測(cè)meca基因，具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種用于meca基因檢測(cè)的dna電化學(xué)傳感器的制備方法，包括將probe3探針修飾到鍍金電極表面，得到所述dna電化學(xué)傳感器的步驟；

4、所述probe?3探針的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，其3’端修飾有-sh，5’端修飾有-n3。

5、進(jìn)一步地，所述probe?3探針通過(guò)孵育反應(yīng)和封閉處理修飾到所述鍍金電極表面。

6、進(jìn)一步地，所述封閉處理使用的封閉劑為6-巰基-1-己醇。

7、本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述的制備方法制備得到的用于meca基因檢測(cè)的dna電化學(xué)傳感器。

8、本發(fā)明還提供修飾capture?probe探針的羧基功能化磁珠、h1探針、h2探針和上述的dna電化學(xué)傳感器在制備用于meca基因檢測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用，

9、所述capture?probe探針的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其3’端修飾有-nh2；

10、所述h1探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，其5’端修飾有生物素；

11、所述h2探針的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，其3’端修飾有生物素。

12、本發(fā)明還提供一種用于meca基因檢測(cè)的試劑盒，包括修飾capture?probe探針的羧基功能化磁珠、h1探針、h2探針和上述的dna電化學(xué)傳感器；

13、所述capture?probe探針的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其3’端修飾有-nh2；

14、所述h1探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，其5’端修飾有生物素；

15、所述h2探針的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，其3’端修飾有生物素。

16、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括還原劑。

17、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括銅納米花。

18、本發(fā)明還提供上述的試劑盒在檢測(cè)meca基因中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明還提供一種檢測(cè)meca基因的方法，包括以下步驟：

20、用修飾capture?probe探針的羧基功能化磁珠識(shí)別捕獲meca基因，得到分離液；

21、在所述分離液中加入h1探針和h2探針，孵育反應(yīng)后，得到富含銅納米花的長(zhǎng)雙鏈聚合物；

22、將所述富含銅納米花的長(zhǎng)雙鏈聚合物與還原劑反應(yīng)后，加入2-溴異丁酸炔丙酯溶液混合均勻，得到混合液；

23、將所述混合液滴加到上述的dna電化學(xué)傳感器的電極表面，得到pbib/probe?3/spce-au電極；所述pbib/probe?3/spce-au電極再經(jīng)過(guò)電介導(dǎo)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)，得到fmma/pbib/probe?3/spce-au電極；

24、將高氯酸鋰溶液滴加到所述fmma/pbib/probe?3/spce-au電極表面，進(jìn)行方波伏安掃描，記錄電流最大峰強(qiáng)度；將所述電流最大峰強(qiáng)度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到所述meca基因的濃度；

25、所述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是利用不同梯度濃度的meca基因標(biāo)準(zhǔn)溶液構(gòu)建得到；

26、所述capture?probe探針的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，其3’端修飾有-nh2；

27、所述h1探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，其5’端修飾有生物素；

28、所述h2探針的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，其3’端修飾有生物素。。

29、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

30、本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種基于meca基因引發(fā)的hcr聚合銅納米花催化點(diǎn)擊化學(xué)和電介導(dǎo)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)聯(lián)合三重級(jí)聯(lián)信號(hào)放大方案的dna電化學(xué)傳感器，避免了單電信號(hào)放大策略或目前常用信號(hào)策略中生物酶(易受外界環(huán)境如ph和溫度影響)的使用，信號(hào)得到有效放大，靈敏度得到極大提高，同時(shí)，磁分離系統(tǒng)的應(yīng)用確保了檢測(cè)的特異性。

技術(shù)特征：

1.一種用于meca基因檢測(cè)的dna電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于，包括將probe3探針修飾到鍍金電極表面，得到所述dna電化學(xué)傳感器的步驟；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述probe?3探針通過(guò)孵育反應(yīng)和封閉處理修飾到所述鍍金電極表面。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述封閉處理使用的封閉劑為6-巰基-1-己醇。

4.一種根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的用于meca基因檢測(cè)的dna電化學(xué)傳感器。

5.修飾capture?probe探針的羧基功能化磁珠、h1探針、h2探針和權(quán)利要求4所述的dna電化學(xué)傳感器在制備用于meca基因檢測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于，

6.一種用于meca基因檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括修飾capture?probe探針的羧基功能化磁珠、h1探針、h2探針和權(quán)利要求4所述的dna電化學(xué)傳感器；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括還原劑。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括銅納米花。

9.一種如權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢測(cè)meca基因中的應(yīng)用。

10.一種檢測(cè)meca基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種用于mecA基因檢測(cè)的DNA電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用，涉及生命科學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域。該制備方法包括將Probe?3探針修飾到鍍金電極表面，得到所述DNA電化學(xué)傳感器的步驟；該P(yáng)robe?3探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示，其3’端修飾有?SH，5’端修飾有?N<subgt;3</subgt;。該DNA電化學(xué)傳感器可應(yīng)用于mecA基因檢測(cè)，不僅對(duì)mecA基因有高選擇性，而且操作簡(jiǎn)便，快速，靈敏度高，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，易于推廣。

技術(shù)研發(fā)人員：陳冬梅,謝書宇,霍萌月,李意
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10