本發(fā)明涉及小分子提取檢測，具體而言，涉及一種植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的高通量分析方法。

背景技術(shù)：

1、代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛用于食品中小分子組分的分析。合理的提取分離技術(shù)和可靠高效的分析工具是提高組分分析的數(shù)量和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。萃取溶劑的極性會影響組分的提取范圍，含有水、甲醇、乙腈和/或甲酸的水-有機混合物是最常見的溶劑，可以為極性和中極性小分子組分提供足夠的溶解度，該溶液體系通常與反相液相色譜(rplc)結(jié)合使用，其中c18固定相因其良好的穩(wěn)定性和相對廣泛的覆蓋范圍而被廣泛使用。然而，強極性組分在rplc模式下保留較差，這可能導(dǎo)致目標(biāo)物遺漏、降低方法覆蓋率。

2、另外，有效的分析工具和數(shù)據(jù)庫對化合物的注釋是不可或缺的。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多個大型開源數(shù)據(jù)庫，如hmdb、massbank、mona等也在逐步完善。各國研究者提供的標(biāo)準(zhǔn)品驗證信息以及近年來迅速發(fā)展的基于深度學(xué)習(xí)的in?silico預(yù)測，使得數(shù)據(jù)庫內(nèi)化合物的數(shù)量和譜圖準(zhǔn)確性在不斷提高。值得注意的是，數(shù)據(jù)庫也是影響注釋數(shù)量的關(guān)鍵因素，通常不同的數(shù)據(jù)庫可能包含獨特的物質(zhì)信息，因此結(jié)合多個數(shù)據(jù)庫進行化合物注釋也可提高分析效率。

3、植物，包括：果蔬及其制品。果蔬及其制品中含有大量的小分子組分，包括已報道的如有機酸、小分子糖(單糖、雙糖、低聚糖)、維生素、酚類化合物(酚酸類化合物、黃酮類化合物、異黃酮類化合物等)、萜類化合物等功能性植物化合物。這些小分子組分是表征果蔬及其制品品質(zhì)特性與健康效益的重要物質(zhì)基礎(chǔ)組成。而目前，采用各類分析工具在進行果蔬及其制品中小分子組分注釋的研究較少，導(dǎo)致適用于果蔬源基質(zhì)的極性組分的高通量分析策略有限，果蔬及其制品的極性小分子組分構(gòu)成基礎(chǔ)數(shù)據(jù)仍需完善。

4、現(xiàn)有專利申請?zhí)枮?02110676053.5中公開了一種植物代謝產(chǎn)物的分析方法及其應(yīng)用，該專利在多種提取溶劑中優(yōu)選了一種提取溶劑配比(甲醇和水的體積比為3：1)，期望在一次實驗中盡可能提取到更多的組分，但對于強極性組分的提取缺乏。該專利申請選用了acquity?uplc?hss?t3色譜柱，是一類極性保留反相色譜柱，可以改善反相色譜對極性物質(zhì)的保留，但對于強極性化合物，反相色譜無法保留。

5、現(xiàn)有專利申請?zhí)枮?01910136530.1采用50-90％乙醇溶液加熱回流提取三次，合并提取液后抽濾，在50-70℃真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮體積，再依次用正庚烷和乙酸乙酯洗脫旋蒸濃縮液，得到的乙酸乙酯洗脫液在真空下進一步干燥，得到樣品，最后采用50％甲醇水溶解樣品并離心，將上清液通過0.45μm膜過濾得到極性餾分。該專利申請中的強極性成分是通過收集unitary?c18柱中接近“死體積”時間出峰的餾分得到。該專利申請技術(shù)制備流程復(fù)雜，且存在提取過程加熱導(dǎo)致組分降解的可能性，操作簡單快速才不易造成降解。該專利僅適用于一種對象中強極性化合物的研究，在適用范圍和對象上，具有一定的局限性，同時在對研究對象的小分子組分的全面表征上，該方法僅側(cè)重于一類物質(zhì)的靶向提取分析。

6、鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的提取分離方法。與單一溶劑、單一色譜柱的提取分離方法相比，本發(fā)明提出的“分類”提取、“分組”分離、“合并”注釋的“兩分一合”策略得到小分子組分，經(jīng)過質(zhì)譜檢測和解析結(jié)果后，注釋重疊的小分子組分占比較低，說明可以有效提高小分子組分的提取覆蓋率，大幅度增加了可注釋組分的數(shù)量。

2、本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的提取分離方法，其包括如下步驟：

4、s1：對待處理樣本進行提取，提取包括：對待處理樣本分別用第一極性溶劑、第二極性溶劑進行提取，分別獲得第一極性溶劑提取物、第二極性溶劑提取物；第一極性溶劑的極性強于第二極性溶劑的極性；

5、s2：對s1提取獲得的提取物分別進行分離：對第一極性溶劑提取物用親水作用色譜柱進行小分子物質(zhì)分離；對第二極性溶劑提取物用反相色譜柱進行小分子物質(zhì)分離。

6、第二方面，本發(fā)明還提供了一種植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的質(zhì)譜檢測方法，其包括如下步驟：

7、對上述的提取分離方法獲得的組分分別采用質(zhì)譜儀進行檢測，獲得小分子組分?jǐn)?shù)據(jù)。

8、第三方面，本發(fā)明還提供了對植物及其加工品中小分子組分的注釋分析的方法，依據(jù)數(shù)據(jù)庫，采用小分子組分注釋工具對上述的質(zhì)譜檢測方法獲得的小分子組分?jǐn)?shù)據(jù)進行注釋。

9、ms-dial和metaboanalystr作為目前最常用的代謝組學(xué)開源分析工具，可以為目標(biāo)物注釋提供方便有效的解決方案：ms-dial是一款多功能的非靶向代謝組學(xué)程序，支持各種分析方法(lc-ms,gc-ms等)和多種文件格式，專注于原始光譜處理，它可以在windows系統(tǒng)上本地運行，具有用戶友好的圖形界面；metaboanalystr是基于網(wǎng)絡(luò)的代謝組學(xué)工具之一，集成了原始光譜處理、統(tǒng)計和功能分析以及多組學(xué)集成分析，提供了高度自動化的工作流程。對于大規(guī)模樣品，其r包也可以在本地進行光譜處理。

10、本發(fā)明具有以下有益效果：

11、本發(fā)明提供的植物及其加工品中小分子組分的提取分離方法，可以針對強極性、極性、中極性分子進行提取分離，具有方法學(xué)的使用廣譜性。尤其是針對極性分子和強極性分子的“分類”提取，具有提取覆蓋率高的優(yōu)勢。通過設(shè)置不同極性溶劑的分別提取方式，基于相似相溶的原理，可以獲得溶解在不同極性溶劑下的不同提取物。進一步，根據(jù)獲得的提取物，采用相應(yīng)的分離色譜柱可實現(xiàn)更多的小分子組分的“分組”分離，這樣更有利于保留更多的小分子組分。

12、此外，本發(fā)明還提供了小分子組分的質(zhì)譜檢測方法和兩種小分子組分的注釋分析的方法，最終“合并”注釋結(jié)果。該方法有助于提升小分子組分檢測覆蓋率，為在一次實驗中發(fā)現(xiàn)盡可能多的感興趣的化合物提供了技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的提取分離方法，其特征在于，其包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的提取分離方法，其特征在于，所述第一極性溶劑為添加或不添加有機酸的水、添加或不添加有機酸的二甲基亞砜、醇類、乙腈或其水溶液；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物及其加工品中小分子組分的提取分離方法，其特征在于，所述有機酸為甲酸或乙酸；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的提取分離方法，其特征在于，所述提取過程中還包括超聲處理，然后取超聲處理后的液體進行離心、過濾。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的提取分離方法，其特征在于，用反相色譜柱進行中極性小分子物質(zhì)分離的液相色譜條件為：色譜柱的層析填料為c18、苯基和c8中的至少一種，流動相a為0.1-0.2％甲酸水，流動相b為乙腈；

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的提取分離方法，其特征在于，用親水作用色譜柱進行極性小分子物質(zhì)分離的液相色譜條件為：流動相a為5-10mm乙酸銨水溶液，流動相b為乙腈；

7.一種植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，其包括如下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，所述質(zhì)譜檢測條件為：

9.對植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的注釋分析的方法，其特征在于，依據(jù)數(shù)據(jù)庫，采用小分子組分注釋工具對權(quán)利要求7-8任一項所述的質(zhì)譜檢測方法獲得的所述小分子組分?jǐn)?shù)據(jù)進行注釋。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述數(shù)據(jù)庫是指拼接有hmdb、massbank、mona、ms-dial?metabolomics?msp?spectral?kit和riken數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)庫；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種植物及其加工品中的極性與中極性小分子組分的高通量分析方法，涉及小分子高通量檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的提取分離方法提高了小分子組分的提取覆蓋率，增加了可注釋組分的數(shù)量。本發(fā)明提供的小分子組分的質(zhì)譜檢測方法及其注釋分析方法有助于提升小分子組分高通量檢測覆蓋率，為在一次實驗中發(fā)現(xiàn)盡可能多的感興趣的極性與中極性化合物提供了技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：徐貞貞,俞鈞嚴(yán),徐雷,王雪
受保護的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10