本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法。

背景技術(shù)：

1、“低內(nèi)毒素回收”(low?endotoxin?recovery,ler)是指使用藥典中規(guī)定的細菌內(nèi)毒素檢查方法(鱟試劑法)檢測細菌內(nèi)毒素時,無法檢測出加入到某些無菌生物制品樣品中的已知濃度的標準內(nèi)毒素的現(xiàn)象。根據(jù)美國注射劑協(xié)會(parenteral?drug?association，pda)撰寫的第82號技術(shù)報告(technical?report?no.82)中的定義，ler是指“加入的標準內(nèi)毒素在樣品中隨著時間的延長,用鱟試劑法檢測，其回收率低于50％”"的現(xiàn)象。這將會出現(xiàn)內(nèi)毒素在藥品放行時無法檢出,使得具有潛在熱原物質(zhì)的藥品流向市場,被患者使用。ler帶來的潛在致熱風險,尤其是基于生物制品特性造成的ler值得重視。

2、2013年美國fda開始要求申請人在提交生物制品許可申請(bla)時要提供ler的研究數(shù)據(jù)，以證明使用usp第＜85＞章細菌內(nèi)毒素檢查法可以檢測出加標至該產(chǎn)品中的內(nèi)毒素，以避免ler使產(chǎn)品存在潛在的致熱風險。若內(nèi)毒素檢查法不能準確檢測,則需用家兔熱原試驗作為替代。

3、2023年歐洲藥品管理局(european?medicines?agency，ema)發(fā)布的《生物制品問答》中提到,對于含表面活性劑(如聚山梨酯)和螯合劑(如edta、檸檬酸鹽、磷酸鹽、組氨酸)的制劑,在提交上市許可申請時需提交ler研究數(shù)據(jù)。這表明監(jiān)管機構(gòu)對ler日益重視。

4、我國的藥品監(jiān)管法規(guī)中,《藥品gmp指南》(第2版)《無菌制劑》下冊《生物制品(單抗)細胞治療產(chǎn)品》中"下游工藝的生產(chǎn)質(zhì)量控制"中列出關(guān)于低內(nèi)毒素回收的相關(guān)信息,也未做出具體法規(guī)要求?！吨袊幍洹?025年版中擬收載低內(nèi)毒素回收率的相關(guān)要求。

5、雖然近年來,隨著對ler現(xiàn)象研究的深入,人們對其定義、機制、影響因素等有了更多認識。但仍有大量的ler的現(xiàn)象難以被解決。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過以下技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，包括以下步驟：

2、(1)鱟試劑靈敏度復核/標準曲線可靠性驗證

3、凝膠法使用0.25-0.03eu/ml的凝膠法鱟試劑，按中國藥典進行鱟試劑靈敏度復核試驗。線性范圍建議采用10-0.01eu/ml或50-0.005eu/ml。

4、(2)根據(jù)生產(chǎn)工藝確定保持時間研究的關(guān)鍵參數(shù)：溫度和時間

5、在生產(chǎn)工藝中，即表面活性劑和螯合劑同時出現(xiàn)的步驟中查找存在ler高風險因素。

6、(3)確定樣品的不干擾稀釋倍數(shù)或者確定樣品的排除干擾方法

7、按照中國藥典細菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗，確定樣品不干擾濃度。采用其他猜出干擾的方法時，方法應經(jīng)過驗證。

8、(4)開展保持時間研究

9、預先在內(nèi)毒素檢查用水、樣品中添加細菌內(nèi)毒素濃度至10eu/ml/20eu/ml等濃度，

10、根據(jù)步驟(2)確定溫度，在不超過步驟(2)確定時間的基礎(chǔ)上分別在第1，2，3，4，7，14，28天依次取樣。

11、每次取樣后，對添加了內(nèi)毒素的內(nèi)毒素檢查用水和樣品進行檢測：用內(nèi)毒素檢查用水稀釋樣品到步驟3確定的不干擾稀釋倍數(shù)進行檢測。或者采用其他經(jīng)過驗證的方法處理樣品后進行檢測。

12、計算內(nèi)毒素的回收率。(也可根據(jù)實際情況考察1h，2h，4h，8h等時間點)

13、(5)確定樣品存在ler現(xiàn)象

14、當連續(xù)2個時間點內(nèi)毒素內(nèi)毒素回收率低于50％，則判定樣品存在低內(nèi)毒素回收現(xiàn)象。

15、(6)緩解低內(nèi)毒素回收率的方法：采用人血白蛋白處理樣品并再次開展保持時間研究確認ler現(xiàn)象被排除。

16、預先在內(nèi)毒素檢查用水、樣品中添加細菌內(nèi)毒素濃度至10eu/ml—20eu/ml。

17、根據(jù)步驟(2)確定溫度，在不超過步驟(2)確定時間的基礎(chǔ)上分別在第1，2，3，4，7，14，28天依次取樣。

18、每次取樣后，對添加了內(nèi)毒素的內(nèi)毒素檢查用水和樣品進行檢測：用人血白蛋白溶液稀釋樣品到步驟(3)確定的不干擾稀釋倍數(shù)進行檢測。

19、其中，人血白蛋白溶液的濃度為0.01％-1％。優(yōu)選的，人血白蛋白溶液濃度為0.1％。

20、若采用人血白蛋白稀釋檢測結(jié)果仍然存在干擾，可采用超濾離心管對樣品進行超濾預處理，超濾膜的分子量應選擇3000-30000道爾頓之間，優(yōu)選為20000道爾頓。超濾后再采用人學白蛋白稀釋溶液稀釋樣品。

21、(7)確認低內(nèi)毒素回收率現(xiàn)象已經(jīng)被緩解:計算內(nèi)毒素的回收率。(也可根據(jù)實際情況考察1h，2h，4h，8h等時間點)。

22、以上，步驟1-5是低內(nèi)毒素回收率現(xiàn)象的確認，步驟6是緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，為本發(fā)明的核心內(nèi)容，步驟7是確認低內(nèi)毒素回收率現(xiàn)象已經(jīng)被緩解。

23、優(yōu)選的，步驟(1)中，進行標準曲線可靠性驗證方法包括動態(tài)濁度法、動態(tài)顯色法、重組c因子法、重組級聯(lián)試劑法。

24、綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果：

25、1經(jīng)過本方案處理后，樣本中被遮蔽的內(nèi)毒素(回收率<50％)重新可以被檢測出來(回收率>50％)。

26、2本處理方案省時省力，僅需使用特定溶液稀釋樣品，無需采用目前常見的添加二價陽離子、添加分散劑、表面活性劑、有機溶劑、冷藏等多種復雜技術(shù)手段。

27、3目前仍有大多數(shù)樣品即使采用了上述所有常見方法處理仍不能解決低內(nèi)毒素回收現(xiàn)象，只能選用家兔熱原法進行樣品中的熱原污染情況。家兔熱原法無論從成本，操作難度，實驗精密度都遠不及細菌內(nèi)毒素檢查法。

28、4解決了低內(nèi)毒素回收率現(xiàn)象的樣品，細菌內(nèi)毒素檢查法可以真實的檢測出樣品中的內(nèi)毒素，對臨床安全有效性提供了保障。

技術(shù)特征：

1.一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，其特征在于，步驟(1)中，進行標準曲線可靠性驗證方法包括動態(tài)濁度法、動態(tài)顯色法、重組c因子法、重組級聯(lián)試劑法。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，其特征在于，步驟(1)中，線性范圍采用10-0.01eu/ml或50-0.005eu/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，其特征在于，所述步驟(6)中人血白蛋白溶液濃度為0.1％。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，其特征在于，所述步驟(6)超濾膜的分子量應選擇3000-30000道爾頓之間。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，其特征在于，所述步驟(6)超濾膜的分子量應選擇20000道爾頓。

技術(shù)總結(jié)
一種緩解低內(nèi)毒素回收率的方法，包括以下步驟：(1)鱟試劑靈敏度復核/標準曲線可靠性驗證；(2)根據(jù)生產(chǎn)工藝確定保持時間研究的關(guān)鍵參數(shù)；(3)確定樣品的不干擾稀釋倍數(shù)；(4)開展保持時間研究；(5)確定樣品存在LER現(xiàn)象；(6)緩解低內(nèi)毒素回收率的方法：采用人血白蛋白處理樣品并再次開展保持時間研究確認LER現(xiàn)象被排除。(7)確認低內(nèi)毒素回收率現(xiàn)象已經(jīng)被緩解:計算內(nèi)毒素的回收率。本發(fā)明具有以下有益效果：1樣本中被遮蔽的內(nèi)毒素可以被檢測出來；2省時省力；3成本低，操作簡單，精密度較家兔實驗高；4解決了低內(nèi)毒素回收率現(xiàn)象的樣品，對臨床安全有效性提供了保障。

技術(shù)研發(fā)人員：裴宇盛,蔡彤,趙雨歆,陳晨,賀慶,董春艷,陸德,劉雅丹,衛(wèi)辰
受保護的技術(shù)使用者：中國食品藥品檢定研究院（國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械標準管理中心、中國藥品檢驗總所）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10