本發(fā)明屬于生物，涉及一種檢測豬圓環(huán)病毒cap蛋白vlp組裝率和含量的方法。

背景技術(shù)：

1、豬圓環(huán)病毒(pcv)是導(dǎo)致多種豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(pcvad)的病原體，其感染造成豬的免疫系統(tǒng)功能抑制，繼發(fā)其他病原如細(xì)菌等的感染，嚴(yán)重影響豬群健康，在全球范圍內(nèi)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。pcv屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，依據(jù)pcv基因組序列及抗原特性的不同，目前將其分為pcv1、pcv2、pcv3和pcv4四種基因型。pcv基因組為單股閉合環(huán)狀dna，包含orf1和orf2兩個開放閱讀框。病毒衣殼蛋白(cap)由orf2編碼，是pcv唯一的結(jié)構(gòu)蛋白。cap上包含多個中和抗原表位，能刺激機體產(chǎn)生持久的體液免疫和細(xì)胞免疫，是pcv引起宿主免疫應(yīng)答的關(guān)鍵抗原，因此cap是pcv基因工程疫苗研究的關(guān)鍵靶蛋白。

2、病毒樣顆粒(vlp)是由病毒結(jié)構(gòu)蛋白自組裝形成的不含有遺傳物質(zhì)的空心顆粒，沒有復(fù)制和感染的能力。其結(jié)構(gòu)與天然病毒類似，更易被抗原提呈細(xì)胞吞噬、加工和提呈，具有很高的免疫原性。pcv的vlp由12個cap五聚體共60個cap蛋白單體聚合而成。

3、目前疫苗免疫是豬場預(yù)防和控制pcv感染的最佳防控手段，重組亞單位疫苗發(fā)揮著越來越關(guān)鍵的作用。目前國內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)主要通過重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)pcv2的cap蛋白，表達(dá)的cap蛋白能夠自行組裝成vlp，形成近似于天然pcv2病毒的二十面體形態(tài)。然而，不同表達(dá)系統(tǒng)下蛋白的表達(dá)量有差異，單體蛋白組裝為vlp的效率也有差異，據(jù)文獻(xiàn)報道，形成vlp的pcv?cap蛋白的免疫原性顯著優(yōu)于單體cap蛋白的免疫原性。

4、pcv亞單位疫苗最核心的質(zhì)量控制項目是蛋白的含量、純度以及vlp組裝率，其對于疫苗的免疫效果以及安全性都至關(guān)重要。

5、目前蛋白含量測定的方法主要包括紫外分光光度法、2，2'-聯(lián)喹啉-4，4'-二羧酸法(bca)以及考馬斯亮藍(lán)法(bradford)和sds-page法。前三種方法都無法特異性地對目的蛋白進(jìn)行定量，檢測的是總蛋白，也無法判斷蛋白的純度，sds-page方法能特異性檢測蛋白，但只能做半定量。而且上述四種方法均不能檢測vlp組裝率。因此，目前急需一種檢測方法對pcv?cap蛋白的含量進(jìn)行精準(zhǔn)定量，對vlp的組裝情況進(jìn)行檢測。

6、高效液相體積排阻色譜法(hpsec)是一種根據(jù)樣品的分子大小進(jìn)行分離檢測的色譜技術(shù)，大分子比小分子先被洗脫，可以依據(jù)出峰時間來確定目的蛋白，具有快速、準(zhǔn)確、高效的優(yōu)勢。hpsec法在疫苗純度分析檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如百白破聯(lián)合疫苗、戊型肝炎疫苗、腸道病毒71型疫苗、流感疫苗、狂犬病疫苗等?！吨袊幍洹啡?2020版)“重組乙型肝炎疫苗(cho細(xì)胞)”中規(guī)定，純度檢測采用hpsec法，但豬圓環(huán)病毒(pcv)疫苗純度測定法無相關(guān)規(guī)定。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種檢測豬圓環(huán)病毒cap蛋白vlp組裝率和含量的方法，與常規(guī)方法相比，本發(fā)明不僅可以檢測豬圓環(huán)病毒cap蛋白的濃度，還能檢測出vlp的組裝效率，檢測方便、高效、快捷、準(zhǔn)確，適用于豬圓環(huán)病毒苗抗原生產(chǎn)以及質(zhì)量評估。

2、本發(fā)明提供一種檢測豬圓環(huán)病毒cap蛋白vlp組裝率和含量的方法，采用高效液相體積排阻色譜檢測方法，色譜條件包括：

3、色譜柱：tsk-gel?g6000pwxl；

4、檢測波長：280nm；

5、流動相：流動相成分為50mm磷酸鹽緩沖液和100mm硫酸鈉，ph為7.0-7.2。

6、本方法可對待測樣品中形成vlp形式的占比和含量進(jìn)行檢測，包括下述步驟：

7、(1)高效液相體積排阻色譜檢測方法的建立，確定檢測條件，通過該檢測方法，獲得參比品中目的豬圓環(huán)病毒cap蛋白vlp色譜峰面積和豬圓環(huán)病毒cap蛋白單體峰面積；

8、(2)建立豬圓環(huán)病毒cap蛋白的特異吸收峰面積與蛋白濃度之間線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

9、(3)檢測樣品通過步驟(1)的高效液相體積排阻色譜方法，獲取樣品的豬圓環(huán)病毒cap蛋白vlp形式的特異吸收峰面積，和豬圓環(huán)病毒cap蛋白單體吸收峰面積，將兩個吸收峰面積總和即豬圓環(huán)病毒cap蛋白的特異吸收峰面積代入步驟(2)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到樣品豬圓環(huán)病毒cap蛋白總濃度；

10、(4)通過步驟(3)中得到的豬圓環(huán)病毒cap蛋白vlp形式峰面積占cap蛋白總峰面積的比例，計算vlp的組裝率，根據(jù)cap蛋白總濃度乘以vlp組裝率計算vlp的含量。

11、進(jìn)一步的，所述步驟(1)中樣品進(jìn)樣前使用流動相平衡基線，流動相流速為0.6ml/min，樣品的進(jìn)樣量為10μl，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為280nm，柱溫為25℃，記錄時間為30min。

12、進(jìn)一步的，所述步驟(1)中檢測方法還包括使用餾分收集器對主峰和次峰進(jìn)行收集，收集的樣品用10kda的超濾濃縮管濃縮。

13、進(jìn)一步的，所述步驟(1)中檢測方法還包括使用western?blot和電鏡方法對步驟(1)中收集并濃縮的樣品進(jìn)行鑒定。

14、進(jìn)一步的，所述步驟(1)、(2)、(3)、(4)中應(yīng)用的高效液相體積排阻色譜檢測方法中，使用的色譜柱為tsk-gel?g6000pwxl；所述步驟(1)、(2)、(3)、(4)中高效液相體積排阻色譜法中，所述流動相使用前需經(jīng)0.22μm孔徑的濾器過濾以及超聲處理。

15、進(jìn)一步的，所述步驟(2)中建立以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)的線性回歸方程，線性關(guān)系為y＝0.1136x-22.917，其r2為0.9998。

16、進(jìn)一步的，所述豬圓環(huán)病毒cap蛋白的線性回歸方程范圍中，濃度為175μg/ml～2800μg/ml。

17、本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所建立特定的高效液相體積排阻色譜法(hpsec)，在對豬圓環(huán)病毒cap蛋白的vlp形式和單體形式進(jìn)行顯著區(qū)分，具有專屬性和適用性，可根據(jù)vlp峰面積占所有峰面積的比例計算豬圓環(huán)vlp的組裝率，此外，通過標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對樣品的含量進(jìn)行精準(zhǔn)定量。與常規(guī)方法相比，本方法操作簡單，重復(fù)性良好，特異性強，能夠區(qū)分豬圓環(huán)病毒cap蛋白的vlp形式和單體形式。本發(fā)明在豬圓環(huán)疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制以及成品疫苗的質(zhì)量評價方面具有重大應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種檢測豬圓環(huán)病毒cap蛋白vlp組裝率和含量的方法，其特征在于，其特征在于，采用高效液相體積排阻色譜檢測方法，色譜條件包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中樣品進(jìn)樣前使用流動相平衡基線，流動相流速為0.6ml/min，樣品的進(jìn)樣量為10μl，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為280nm，柱溫為25℃，記錄時間為30min。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中檢測方法還包括使用餾分收集器對主峰和次峰進(jìn)行收集，收集的樣品用10kda的超濾濃縮管濃縮。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中檢測方法還包括使用western?blot和電鏡方法對步驟(1)中收集并濃縮的樣品進(jìn)行鑒定。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)、(2)、(3)、(4)中應(yīng)用的高效液相體積排阻色譜檢測方法中，使用的色譜柱為tsk-gel?g6000pwxl；所述步驟(1)、(2)、(3)、(4)中高效液相體積排阻色譜法中，所述流動相使用前需經(jīng)0.22μm孔徑的濾器過濾以及超聲處理。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中建立以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白濃度為縱坐標(biāo)、峰面積為橫坐標(biāo)的線性回歸方程，線性關(guān)系為y＝0.1136x-22.917，其r2為0.9998。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒cap蛋白的線性回歸方程范圍中，濃度為175μg/ml～2800μg/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種檢測豬圓環(huán)病毒Cap蛋白VLP組裝率和含量的方法，該方法包括：(1)高效液相體積排阻色譜檢測方法的建立，確定檢測條件，獲得豬圓環(huán)病毒Cap蛋白VLP形式和單體形式的峰面積，(2)建立標(biāo)準(zhǔn)品蛋白的濃度和對應(yīng)的峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，(3)使用步驟(1)的方法測定樣品的峰面積，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得到樣品的總濃度，對Cap蛋白VLP形式以及單體形式的峰面積分別進(jìn)行積分，根據(jù)VLP峰面積占Cap蛋白總峰面積的比例，確定Cap蛋白VLP的組裝率和含量。本發(fā)明的檢測方法具有快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的優(yōu)勢，適用于豬圓環(huán)病毒Cap蛋白VLP組裝率和含量的檢測，在豬圓環(huán)病毒疫苗生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制以及成品疫苗的質(zhì)量評價等具有重要的指導(dǎo)意義。

技術(shù)研發(fā)人員：楊博,徐高原,任明星,劉維,陳斌,尹爭艷,蘇秀嬋,金建云,吳應(yīng)凱,席同,王菁菁,金丹
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢科前生物股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10