本發(fā)明涉及生物醫(yī)學，特別是涉及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法。
背景技術(shù)：
：：1、隨著醫(yī)學研究的不斷深入，血清和肽素的檢測在疾病診斷、病理研究和生物標志物發(fā)現(xiàn)中扮演著越來越重要的角色?，F(xiàn)有的檢測血清和肽素水平的方法主要是免疫法。例如方法一(morgenthaler,n.g.,et?al.,assay?for?the?measurement?of?copeptin,astable?peptide?derived?from?the?precursor?of?vasopressin.clin?chem,2006.52(1):p.112-9.)公開了一種檢測血清和肽素水平的方法，包括：將血清或血漿樣本50μl、熒光染料cyanine5.5標記的抗和肽素單克隆抗體(小鼠)和lummi4-tb標記的抗和肽素多克隆抗體(綿羊)混合，基于tracetm技術(shù)(時間分辨擴大穴狀化合物發(fā)射技術(shù))，通過檢測免疫復合物發(fā)出的延時信號，進行和肽素的檢測和定量。方法二(cn115184621a)，公開了一種基于免疫層分析的和肽素檢測試劑及其制備方法，包括：s1、用標記緩沖液將羧基聚苯乙烯納米熒光微球、有色聚苯乙烯微球稀釋至固含量約0.2％；s2、在上述聚苯乙烯納米熒光微球、有色聚苯乙烯微球溶液中加入edc溶液和sulfo-nhs-lc-biontin生物素標記試溶劑，活化15～30min，高速離心20min，去上清后加入適量抗和肽素抗體溶液，混合偶聯(lián)反應(yīng)1～1.5h；s3、分別用0.1m，ph?7.0磷酸鹽緩沖溶液，以及ph?9.0，0.1m硼氫化鈉溶液作為包被溶液考察包被后檢測靈敏度以及本底水平，檢測靈敏度和本底水選取ph?7.0磷酸鹽緩沖溶液作為fgf23試劑盒的包被溶液；s4、將聚苯乙烯納米熒光微球、有色聚苯乙烯微球溶液與抗和肽素抗體偶聯(lián)溶液，加入封閉液反應(yīng)30～60min，高速離心20min，去上清，加入抗體保存液即得抗和肽素抗體聚苯乙烯納米熒光微球、有色聚苯乙烯微球標記溶液；s5、將上述所得的標記溶液用噴金劃膜儀噴至玻璃纖維或聚酯纖維上，噴量為1～5μl/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗體聚苯乙烯納米熒光微球、有色聚苯乙烯微球標記和肽素檢測試劑?？梢?，上述方案具有以下缺點和不足：2、1)基于抗原-抗體結(jié)合的免疫法可能出現(xiàn)交叉反應(yīng)，影響特異度；3、2)黃疸性、溶血性和脂血性樣品，或渾濁或含有纖維蛋白的樣品可能產(chǎn)生不精確的結(jié)果。4、3)缺少基于其他檢測原理方法的驗證。技術(shù)實現(xiàn)思路1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目標是提供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法。2、為實現(xiàn)上述目標，本發(fā)明提供了如下方案：3、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，包括：4、步驟1：向離心管中依次加入血清、內(nèi)標溶液、和肽素抗體包被的磁珠，并充分混勻；5、步驟2：將離心管置于磁力架上，分離磁珠和液體，棄去上清；6、步驟3：使用磷酸鹽緩沖液清洗磁珠，并除去緩沖混合液；7、步驟4：向清洗后的磁珠加入甲酸水溶液，充分混勻后加入氨水溶液，形成樣本；8、步驟5：向所述樣本中加入胰蛋白酶溶液，放在搖床上充分反應(yīng)，形成酶切后的樣本；9、步驟6：對所述酶切后的樣本進行固相萃取形成萃取后的樣本；10、步驟7：使用lc-ms/ms系統(tǒng)對所述萃取后的樣本進行分析檢測得到血清中和肽素的色譜圖。11、優(yōu)選的，所述步驟6，對所述酶切后的樣本進行固相萃取形成萃取后的樣本，包括：12、向洗脫板各個孔中加入甲醇，使用氮氣對其進行正壓洗脫以對各孔進行活化，加入純水再次使用氮氣進行正壓洗脫以對各孔進行平衡；13、向酶切后的樣本中加入氨水溶液，混勻后加入到活化平衡后的各個板孔中，使用氮氣對其進行正壓洗脫，形成的目標產(chǎn)物被富集在板孔的填料中；14、對所述目標產(chǎn)物分別用氨水溶液和甲醇清洗，形成清洗后的目標產(chǎn)物；15、用甲酸甲醇溶液對清洗后的目標產(chǎn)物進行洗脫后，經(jīng)氮氣吹干，加入乙腈水溶液復溶形成萃取后的樣本。16、優(yōu)選的，在所述步驟7中，采用acquity?uplc?peptide?beh?c18?column色譜柱對萃取后的樣本進行液相分離，且流動相a為0.03％氨水溶液，流動相b為乙腈，液相系統(tǒng)以0.3ml/min的流速進行梯度洗脫，柱溫箱溫度設(shè)置為40℃。17、優(yōu)選的，在所述步驟1中，使用0.03％氨水溶液對和肽素內(nèi)標進行稀釋形成內(nèi)標溶液。18、優(yōu)選的，在所述步驟4中，甲酸水溶液的體積百分比濃度為2％，氨水溶液的體積百分比濃度為10％。19、根據(jù)本發(fā)明提供的具體實施例，本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：20、本發(fā)明提供了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過對血清進行免疫磁珠富集和固相萃取可以有效去除血清樣品中的雜質(zhì)，然后使用lc-ms/ms系統(tǒng)，可以直接檢測血清樣品的質(zhì)荷比，增加檢測特異性，避免復雜血液成分中的干擾，有高靈敏度、高特異度的特點。技術(shù)特征：1.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，其特征在于，包括：2.如權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，其特征在于，所述步驟6，對所述酶切后的樣本進行固相萃取形成萃取后的樣本，包括：3.如權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，其特征在于，在所述步驟7中，采用acquity?uplc?peptide?beh?c18?column色譜柱對萃取后的樣本進行液相分離，且流動相a為0.03％氨水溶液，流動相b為乙腈，液相系統(tǒng)以0.3ml/min的流速進行梯度洗脫，柱溫箱溫度設(shè)置為40℃。4.如權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，其特征在于，在所述步驟1中，使用0.03％氨水溶液對和肽素內(nèi)標進行稀釋形成內(nèi)標溶液。5.如權(quán)利要求1所述的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，其特征在于，在所述步驟4中，甲酸水溶液的體積百分比濃度為2％，氨水溶液的體積百分比濃度為10％。技術(shù)總結(jié)本發(fā)明提供了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定血清中和肽素的方法，包括：向離心管中依次加入血清、內(nèi)標溶液、和肽素抗體包被的磁珠，并充分混勻；將離心管置于磁力架上，分離磁珠和液體；使用磷酸鹽緩沖液清洗磁珠，向清洗后的磁珠加入甲酸水溶液，充分混勻后加入氨水溶液，形成樣本；向樣本中加入胰蛋白酶溶液，放在搖床上充分反應(yīng)，形成酶切后的樣本；對酶切后的樣本進行固相萃取形成萃取后的樣本；使用LC?MS/MS系統(tǒng)對萃取后的樣本進行分析檢測得到血清中和肽素的色譜圖。本發(fā)明通過對血清進行免疫磁珠富集和固相萃取可以有效去除血清樣品中的雜質(zhì)，然后使用LC?MS/MS系統(tǒng)，可以直接檢測血清樣品的質(zhì)荷比，增加檢測特異性，避免復雜血液成分中的干擾，有高靈敏度、高特異度的特點。技術(shù)研發(fā)人員：程歆琦,邱玲,禹松林,穆丹妮,朱惠娟,陳適受保護的技術(shù)使用者：中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院技術(shù)研發(fā)日：技術(shù)公布日：2024/12/2