本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗，具體涉及cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞在再生障礙性貧血和移植物抗宿主病輔助診斷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、再生障礙性貧血(aplastic?anemia,aa)是一種骨髓造血衰竭征，主要表現(xiàn)為骨髓造血功能低下、全血細(xì)胞減少所致的貧血、出血、感染綜合征。其發(fā)病與原發(fā)或繼發(fā)的造血干細(xì)胞缺陷相關(guān)，發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但目前普遍認(rèn)為t淋巴細(xì)胞異常活化、功能亢進(jìn)造成骨髓損傷是導(dǎo)致再生障礙性貧血的原因之一。再生障礙性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)血常規(guī)：全血細(xì)胞(包括網(wǎng)織紅細(xì)胞)減少，淋巴細(xì)胞比例增高。至少符合以下三項中的兩項：hgb<100g/l；plt<50x?109/l；中性粒細(xì)胞絕對值(anc)<1.5x?109/l。(2)骨髓穿刺：多部位(不同平面)骨髓增生減低或重度減低；小?？仗摚环窃煅?xì)胞(淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)比例增高；巨核細(xì)胞明顯減少或缺如；紅系、粒系細(xì)胞均明顯減少。(3)骨髓活檢(髂骨)：全切片增生減低，造血細(xì)胞減少，非造血細(xì)胞增多，無異常細(xì)胞。(4)必須除外先天性和其他獲得性、繼發(fā)性全血細(xì)胞減少，如：先天性無巨核細(xì)胞性血小板減少性癥、范可尼貧血、低增生性mds、原發(fā)免疫性血小板減少等。

2、移植物抗宿主病(graft-versus-host?disease,gvhd)是異基因造血細(xì)胞移植中最常見的威脅生命的并發(fā)癥之一，其主要因移植后供者的移植物中的t細(xì)胞在受者體內(nèi)被免疫反應(yīng)激活以獲得細(xì)胞溶解能力，然后攻擊攜帶外來抗原的細(xì)胞。其特征類似于自身免疫及其他免疫性疾病的癥狀，如：硬皮病、s-綜合征、免疫性血細(xì)胞減少癥等。目前診斷移植物抗宿主病主要依據(jù)患者移植后出現(xiàn)腹瀉、皮疹等病理表現(xiàn)及實(shí)驗室相關(guān)檢驗。

3、人類白細(xì)胞抗原(human?leukocyte?antigen,hla)是組織相容性復(fù)合體(mhc)所編碼的糖蛋白，專門向t細(xì)胞遞送短肽，在人體的免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用。編碼hla-dr分子β鏈的hla-drb基因包括：-drb1、-drb3、-drb4、-drb5等，目前已發(fā)現(xiàn)-drb1的基因變異與自身免疫性疾病以及一些炎癥疾病和癌癥相關(guān)，其與疾病的相關(guān)性也得到了證實(shí)，而-drb5基因表達(dá)水平較低，且研究技術(shù)受限，對其與疾病相關(guān)性研究尚不清楚，但仍有少數(shù)研究報告-drb5基因的異常表達(dá)可增加患i型糖尿病、白癜風(fēng)和系統(tǒng)性硬皮病等疾病的風(fēng)險。尚未見cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞在aa及gvhd中的相關(guān)報道。

4、目前為止，再生障礙性貧血及移植物抗宿主病都缺乏特征性病理診斷標(biāo)志物，移植物抗宿主病更是缺乏標(biāo)準(zhǔn)及廣泛使用的診斷指南。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明首要目的在于彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞作為診斷標(biāo)志物在制備輔助診斷再生障礙性貧血和移植物抗宿主病的試劑盒中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一方面在于提供一種診斷再生障礙性貧血和移植物抗宿主病的診斷標(biāo)志物，所述標(biāo)志物為cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞，人cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記為cd45+cd8+hla-drb5+，即cd45陽性、cd8陽性、hla-drb5陽性。

3、本發(fā)明的第二方面在于提供一種cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞作為診斷標(biāo)志物在制備診斷再生障礙性貧血和移植物抗宿主病相關(guān)檢測產(chǎn)品中的應(yīng)用。

4、在一個實(shí)施方式中，所述檢測產(chǎn)品是可用于輔助診斷的cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒。

5、在一個實(shí)施方式中，所述再生障礙性貧血和移植物抗宿主病相關(guān)檢測產(chǎn)品為診斷試劑盒，所述試劑盒可用于輔助診斷再生障礙性貧血和移植物抗宿主病。

6、本發(fā)明的第三方面在于提供一種cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒，其中所述cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒包括如下組分：試劑盒為標(biāo)記不同熒光的用于檢測cd45+cd8+hla-drb5+的t細(xì)胞亞群的單克隆抗體：抗cd45抗體、抗cd8抗體、抗hla-drb5抗體。

7、在一個實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含熒光標(biāo)記：所述抗cd45抗的熒光標(biāo)記為percp-cy5.5；所述抗cd8抗體的熒光標(biāo)記為pe；所述抗hla-drb5抗體的熒光標(biāo)記為fitc。

8、在一個實(shí)施方式中，所述試劑盒的抗體使用劑量按所購買抗體的說明書推薦的劑量。

9、在一個實(shí)施方式中，所述試劑盒檢測樣本為外周血或骨髓液。

10、在一個實(shí)施方式中，所述試劑盒還包含紅細(xì)胞裂解液和磷酸鹽緩沖(pbs)溶液。

11、本發(fā)明的第四方面在于提供一種上述試劑盒在用于非診斷目的的、研究再生障礙性貧血和移植物抗宿主病中的應(yīng)用。

12、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果：

13、本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)再生障礙性貧血和移植物抗宿主病患者骨髓液中cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞比例顯著升高。其中，經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析證實(shí)cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞在aa、gvhd與健康志愿者及其他血液疾病患者之間具有顯著差異性(aa：p<0.001，gvhd：p<0.05)。經(jīng)過roc曲線分析發(fā)現(xiàn)，在用于aa和gvhd診斷時auc分別為0.9336和0.9221，檢測靈敏度均為0.8182，特異性均為1，在驗證集中，在用于aa和gvhd診斷時auc分別為0.9717和0.9524，檢測靈敏度均為0.9333，特異性分別為0.95和1，cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞在診斷aa和gvhd中具有較佳的準(zhǔn)確性，表明其可作為輔助診斷aa和gvhd的實(shí)驗室免疫相關(guān)檢測指標(biāo)之一，而且操作簡單可行，具有很高的臨床應(yīng)用價值。另外，本發(fā)明還提供了cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞亞群的檢測方法，可用該檢驗方法對上述t細(xì)胞亞群的表型進(jìn)行定量分析。

技術(shù)特征：

1.cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞作為診斷標(biāo)志物在制備輔助診斷再生障礙性貧血(aa)和移植物抗宿主病(gvhd)的試劑盒中的應(yīng)用。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于：所述試劑盒為流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒。

3.一種輔助診斷再生障礙性貧血和移植物抗宿主病的流式細(xì)胞術(shù)檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒使用權(quán)利要求1所述的cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞作為輔助診斷再生障礙性貧血和移植物抗宿主病的診斷標(biāo)志物，所述試劑盒包含檢測人cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞含量的試劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑為檢測人cd45+cd8+hla-drb5+t細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)分析標(biāo)記的抗體。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于：所述抗體為標(biāo)記不同熒光的以下單克隆抗體：抗cd45抗體、抗cd8抗體和抗hla-drb5抗體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述抗cd45抗體的熒光標(biāo)記為percp-cy5.5；所述抗cd8抗體的熒光標(biāo)記為pe；所述抗hla-drb5抗體的熒光標(biāo)記為fitc。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述抗體使用劑量按所購買抗體的說明書推薦劑量。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒檢測樣本為外周血或骨髓液。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包含紅細(xì)胞裂解液和磷酸鹽緩沖(pbs)溶液。

10.權(quán)利要求3至9中任一項所述的試劑盒在用于非診斷目的的、研究再生障礙性貧血和移植物抗宿主病中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及CD45<supgt;+</supgt;CD8<supgt;+</supgt;HLA?DRB5<supgt;+</supgt;T細(xì)胞在制備輔助診斷再生障礙性貧血(AA)和移植物抗宿主病(GVHD)的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者及其他血液疾病患者相比，CD45<supgt;+</supgt;CD8<supgt;+</supgt;HLA?DRB5<supgt;+</supgt;T細(xì)胞在AA和GVHD患者外周血或骨髓液中的表達(dá)顯著升高。本發(fā)明可作為AA和GVHD的輔助診斷檢測指標(biāo)之一。本發(fā)明提供了一種AA和GVHD診斷的標(biāo)志物CD45<supgt;+</supgt;CD8<supgt;+</supgt;HLA?DRB5<supgt;+</supgt;T細(xì)胞，可簡單、高效地對AA和GVHD進(jìn)行診斷，具有易于推廣、快速的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：黃金棋,許艷麗,劉穎慧,郝嘉懿,王順清,周睿卿
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17