本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法。

背景技術(shù)：

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是分泌途徑的蛋白質(zhì)折疊“工廠”，幾乎所有到達(dá)質(zhì)膜、細(xì)胞外空間或其他分泌腔室的蛋白質(zhì)都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進(jìn)行折疊和成熟。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擁有獨(dú)特的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，允許特殊的修飾，如n-糖基化和二硫鍵的形成，對(duì)于許多分泌蛋白的正確折疊和功能至關(guān)重要。蛋白質(zhì)糖基化(glycosylation)是最普遍、最重要的翻譯后修飾之一，據(jù)估計(jì)，哺乳動(dòng)物中有超過(guò)50％的蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化修飾。盡管已知糖基化具有多種生理功能并參與癌癥、神經(jīng)退行性疾病等，但其在病理過(guò)程中發(fā)揮的作用有待于深入研究。

2、糖基化修飾起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以磷酸多萜醇為載體，先合成14個(gè)糖基的寡糖鏈前體，接著新生多肽翻譯后會(huì)首先通過(guò)sec61孔進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，同時(shí)寡糖基轉(zhuǎn)移酶(ost)會(huì)將寡糖鏈從脂質(zhì)連接低聚糖(llo)轉(zhuǎn)移到新生多肽糖基化位點(diǎn)(asn-x-ser/thr，x代表除脯氨酸以外的任何一種氨基酸)的天冬酰胺殘基上，隨后駐留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體中的糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)一步加工形成糖蛋白，參與細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白折疊和蛋白質(zhì)量控制等生物學(xué)過(guò)程。糖基化抑制劑tunicamycin(衣霉素)主要在糖蛋白合成的第一步發(fā)揮作用，通過(guò)抑制多萜醇焦磷酸n-乙酰氨基葡萄糖(dol-pp-glcnac)的生成而影響糖蛋白的表達(dá)。

3、維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)n-糖基化修飾對(duì)大腦功能至關(guān)重要，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊的蛋白積累，可引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，目前在神經(jīng)退行性疾病中得到廣泛研究。

4、適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)改變細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組來(lái)增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的適應(yīng)能力，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)后續(xù)損傷的保護(hù)。然而，在神經(jīng)退行性疾病中出現(xiàn)的長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為會(huì)破壞非折疊蛋白反應(yīng)介導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制，導(dǎo)致炎癥和凋亡程序的激活，從而促進(jìn)神經(jīng)毒性。

5、糖蛋白在神經(jīng)元功能中扮演著重要角色，其時(shí)序性變化可能揭示神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制。

6、在過(guò)去的幾十年里，高通量糖蛋白質(zhì)組解析技術(shù)得到了廣泛的發(fā)展，其策略大體分為兩種：一是基于凝集素與糖鏈的親和作用開(kāi)發(fā)的糖鏈解析技術(shù)，二是基于質(zhì)譜的組學(xué)解析技術(shù)。

7、然而，這些方法主要關(guān)注的是復(fù)雜樣本中糖鏈或者糖蛋白的整體變化，難以精準(zhǔn)捕捉神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白的動(dòng)態(tài)變化，且無(wú)法在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率的監(jiān)測(cè)。

8、因此，對(duì)神經(jīng)元中糖蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞水平的分布和動(dòng)態(tài)變化表征仍然是非常必要的。

9、鄰近標(biāo)記已然成為分子空間組學(xué)研究有用的工具，通過(guò)引入某種具有鄰近標(biāo)記功能的工具酶，包括過(guò)氧化氫酶(e.g.apex,hrp)和生物素連接酶(e.g.bioid,turboid)等，到目的蛋白或特定亞細(xì)胞區(qū)室中，通過(guò)酶催化特定反應(yīng)，對(duì)鄰近區(qū)域一定距離范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)標(biāo)記，然后結(jié)合相應(yīng)的富集純化方法以及質(zhì)譜鑒定，最終在活細(xì)胞水平獲得與目的蛋白質(zhì)或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，為難以分離的亞細(xì)胞區(qū)提供高質(zhì)量的蛋白質(zhì)組圖譜。

10、然而，由于以下原因，現(xiàn)有的鄰近標(biāo)記且針對(duì)293t，hela，u-2?os三種工具細(xì)胞為主，并未用于捕獲神經(jīng)元亞細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)糖蛋白變化，其潛在原因在于：1、神經(jīng)元存在各種突起，轉(zhuǎn)染效率有限；2、為減少本底標(biāo)記，bioid/turboid通常采用的生物素饑餓法會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的生物素水平下降，改變糖蛋白表達(dá)模式；3、細(xì)胞表達(dá)turboid不可避免地會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性蛋白質(zhì)普遍發(fā)生生物素化，這可能會(huì)擾亂正常的細(xì)胞過(guò)程，并引起細(xì)胞毒性。

11、基于上述，本發(fā)明利用一種慢病毒載體的apex2結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白sec61b構(gòu)建神經(jīng)元穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，以盡量減少對(duì)細(xì)胞生理的干擾。利用藥物刺激不同時(shí)間以模擬神經(jīng)元應(yīng)激，精確地描繪出亞細(xì)胞中糖蛋白的動(dòng)態(tài)變化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法，包括以下步驟：

4、s1.構(gòu)建鄰近標(biāo)記系統(tǒng)：將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白sec61b與抗壞血酸過(guò)氧化物酶(apex2)進(jìn)行融合，中間插入標(biāo)簽蛋白v5(sec61b-v5-apex2)，隨后將上述融合蛋白分別插入pcdna3和plvx-ires-hyg的載體中，構(gòu)建可誘導(dǎo)的鄰近標(biāo)記系統(tǒng)；

5、s2.細(xì)胞培養(yǎng)與應(yīng)激誘導(dǎo)：將構(gòu)建的標(biāo)記系統(tǒng)引入人胚腎細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞以建立鄰近標(biāo)記方法，并應(yīng)用刺激物以誘導(dǎo)神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)；

6、s3.標(biāo)記與捕獲：在生理或應(yīng)激條件下，誘導(dǎo)抗壞血酸過(guò)氧化物酶活化，鄰近的糖蛋白會(huì)被生物素化，隨后通過(guò)鏈霉親和素瓊脂糖珠捕獲；

7、s4.質(zhì)譜檢測(cè)：對(duì)捕獲的糖蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，檢測(cè)糖蛋白的時(shí)序性變化；

8、s5.數(shù)據(jù)分析：通過(guò)生物信息學(xué)工具分析糖蛋白的動(dòng)態(tài)變化，識(shí)別關(guān)鍵的應(yīng)激響應(yīng)分子及其功能路徑。

9、優(yōu)選的，s2中神經(jīng)元是小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系。

10、優(yōu)選的，s2中刺激物包括但不限于化合物衣霉素，其中應(yīng)激條件包括但不限于化合物引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

11、優(yōu)選的，所述s4中質(zhì)譜檢測(cè)方法為lc-ms/ms，使用布魯克的nanoelute液相色譜儀聯(lián)合timstof?pro離子淌度質(zhì)譜儀檢測(cè)糖蛋白的時(shí)序性。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

13、本發(fā)明依據(jù)糖蛋白的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、穩(wěn)態(tài)維持具有重要作用的理論基礎(chǔ)，針對(duì)基于質(zhì)譜現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)難度大、缺乏亞細(xì)胞區(qū)室糖蛋白動(dòng)態(tài)變化的問(wèn)題，本發(fā)明將利用鄰近標(biāo)記結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，公開(kāi)了一種神經(jīng)元亞細(xì)胞內(nèi)糖蛋白動(dòng)態(tài)變化技術(shù)，繪制全景式糖蛋白時(shí)空分辨表達(dá)譜，證實(shí)糖蛋白在神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)維持中的作用；可實(shí)現(xiàn)高效監(jiān)測(cè)神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)下糖蛋白的時(shí)序性變化。該技術(shù)不僅提高了糖蛋白動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)的時(shí)空分辨率，還為理解神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制提供了新工具，對(duì)相關(guān)疾病的研究具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法，其特征在于，s2中神經(jīng)元是小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法，其特征在于，s2中刺激物包括但不限于化合物衣霉素，其中應(yīng)激條件包括但不限于化合物引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法，其特征在于，所述s4中質(zhì)譜分析方法為lc-ms/ms，使用布魯克的nanoelute液相色譜儀聯(lián)合timstof?pro離子淌度質(zhì)譜儀檢測(cè)糖蛋白的時(shí)序性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)了一種使用鄰近標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)研究神經(jīng)元應(yīng)激下糖蛋白時(shí)序性變化的方法，包括以下步驟，構(gòu)建鄰近標(biāo)記系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)與應(yīng)激誘導(dǎo)、標(biāo)記與捕獲、質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明依據(jù)糖蛋白的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、穩(wěn)態(tài)維持具有重要作用的理論基礎(chǔ)，針對(duì)基于質(zhì)譜現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)難度大、缺乏亞細(xì)胞區(qū)室糖蛋白動(dòng)態(tài)變化的問(wèn)題，本發(fā)明將利用鄰近標(biāo)記結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，繪制全景式糖蛋白時(shí)空分辨表達(dá)譜，證實(shí)糖蛋白在神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)維持中的作用；實(shí)現(xiàn)高效監(jiān)測(cè)神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng)下糖蛋白的時(shí)序性變化特征，提高了糖蛋白動(dòng)態(tài)變化檢測(cè)的時(shí)空分辨率，對(duì)相關(guān)疾病的研究具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：高霞,楊倩,盧建軍,龔曄,時(shí)曉龍,陳蓉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/10