本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、許多地區(qū)都曾發(fā)生肉毒神經(jīng)毒素中毒的病例，從全球來(lái)看，食物和嬰兒肉毒神經(jīng)毒素中毒事件也常有報(bào)道，在已報(bào)道的病例中，以a型和b型肉毒神經(jīng)毒素中毒最多。隨著肉毒神經(jīng)毒素在藥物和美容應(yīng)用方面的廣泛應(yīng)用，因使用不當(dāng)導(dǎo)致肉毒神經(jīng)毒素中毒的案例也逐漸發(fā)生。因此，開發(fā)能夠?qū)Ω黝愐伤迫舛旧窠?jīng)毒素中毒案例在短時(shí)間的定性檢測(cè)，從而為輔助醫(yī)生診斷，及時(shí)進(jìn)行治療決策提供證據(jù)支持的檢測(cè)方法以及檢測(cè)產(chǎn)品具有重要意義。

2、此外，在肉毒神經(jīng)毒素制品研發(fā)、生產(chǎn)過(guò)程中也需要對(duì)肉毒神經(jīng)毒素進(jìn)行一系列檢測(cè)以保證質(zhì)量控制，例如用總蛋白測(cè)定法檢測(cè)相關(guān)毒素蛋白含量、用小鼠體內(nèi)中和法進(jìn)行血清型別鑒定（時(shí)長(zhǎng)可能為若干天）等。但針對(duì)肉毒神經(jīng)毒素的這些檢測(cè)方法依然存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等缺點(diǎn)。

3、因此，目前仍需開發(fā)一種快速有效的肉毒神經(jīng)毒素檢測(cè)抗體或其抗原結(jié)合片段、檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的至少部分技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明使用天然肉毒神經(jīng)毒素復(fù)合物為抗原，制備得到了一種抗b型肉毒神經(jīng)毒素的天然抗體，該抗體或其抗原結(jié)合片段具有良好的靈敏度、特異性、親和力和穩(wěn)定性。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

2、本發(fā)明的第一方面，提供一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)試劑盒，所述檢測(cè)試劑盒包含能夠與b型肉毒神經(jīng)毒素結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

3、本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測(cè)b型肉毒神經(jīng)毒素的方法，所述檢測(cè)b型肉毒神經(jīng)毒素的方法包括以下步驟：

4、(1)?使待測(cè)樣本與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠與b型肉毒神經(jīng)毒素結(jié)合，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd(seq?id?no.3)、issggsst(seq?id?no.4)和arqafytydgtamdy(seq?id?no.5)所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty(seq?id?no.6)、kvs和fqgshipwt(seqid?no.7)所示的輕鏈cdr1-3；

5、(2)?檢測(cè)所述b型肉毒神經(jīng)毒素與抗體或其抗原結(jié)合片段的結(jié)合，以確定所述待測(cè)樣本中b型肉毒神經(jīng)毒素的存在或確定所述待測(cè)樣本中b型肉毒神經(jīng)毒素的量。

6、本發(fā)明的第三方面，提供抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠靶向b型肉毒神經(jīng)毒素，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

7、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有(i)-(iii)所示的任意一種氨基酸序列：

8、(i)?包含evklvesggglvkpggslklscaasgfafssydmswvrqtpekrlewvatissggsstfypdsvkgrftisrdsarntlylqmislrsedtalyfcarqafytydgtamdywgqgtsvtvssakttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk(seq?id?no.1)的重鏈氨基酸序列和/或dvlmtqtplslpvslgdqasiycrssqsivhnngdtyfewylqkpgqspklliykvsnrfsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshipwtfgggtkleikradaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec(seq?id?no.2)的輕鏈氨基酸序列；

9、(ii)?與(i)所示的氨基酸序列具有至少90%同源性，且具有相同功能的氨基酸序列；

10、(iii)?與(i)或(ii)所示的氨基酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失或添加一個(gè)或多于一個(gè)氨基酸獲得的且具有相同功能的氨基酸序列。

11、在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述抗體包括單克隆抗體、嵌合抗體、鼠源抗體或人源化抗體；所述抗原結(jié)合片段包括fab（指包含了整個(gè)可變區(qū)（vh和vl）以及恒定區(qū)ch1的片段）、fab’（去除可結(jié)晶區(qū)的片段）、f(ab)2（以二硫鍵連接的片段）、f(ab’)2（去除可結(jié)晶區(qū)的以二硫鍵連接的片段）或scfv（單鏈可變片段）。

12、本發(fā)明的第四方面，提供核酸分子，所述核酸分子包含編碼根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列。

13、本發(fā)明的第五方面，提供載體分子，所述載體分子包含本發(fā)明所述的核酸分子。

14、本發(fā)明的第六方面，提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明所述的核酸分子或本發(fā)明所述的載體分子。

15、本發(fā)明的第七方面，提供根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過(guò)人工合成或基因工程方式制備。

16、本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可以對(duì)各類疑似肉毒神經(jīng)毒素中毒案例在短時(shí)間完成定性檢測(cè)（如使用elisa方法可在8?h內(nèi)完成檢測(cè)），同時(shí)，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段及檢測(cè)方法能夠顯著提高對(duì)毒素蛋白的特異性，避免血清型鑒別等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的時(shí)長(zhǎng)問(wèn)題等，可以應(yīng)用于肉毒神經(jīng)毒素制品研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程。此外，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段及檢測(cè)方法在科研生產(chǎn)工作諸多的檢測(cè)過(guò)程中能夠?qū)θ舛旧窠?jīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性及保質(zhì)期等方面進(jìn)行質(zhì)量控制。

技術(shù)特征：

1.一種用于b型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒包含結(jié)合b型肉毒神經(jīng)毒素的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

2.一種檢測(cè)b型肉毒神經(jīng)毒素的方法，其特征在于，所述檢測(cè)b型肉毒神經(jīng)毒素的方法包括使待測(cè)樣本與抗體或其抗原結(jié)合片段接觸的步驟，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)b型肉毒神經(jīng)毒素的方法，其特征在于，所述檢測(cè)b型肉毒神經(jīng)毒素的方法包括以下步驟：

4.抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段能夠靶向b型肉毒神經(jīng)毒素，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包括氨基酸序列分別如gfafssyd、issggsst和arqafytydgtamdy所示的重鏈cdr1-3，和/或氨基酸序列分別如qsivhnngdty、kvs和fqgshipwt所示的輕鏈cdr1-3。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段具有(i)-(iii)所示的任意一種氨基酸序列：

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體包括單克隆抗體、嵌合抗體、鼠源抗體或人源化抗體；所述抗原結(jié)合片段包括fab、fab’、f(ab)2、f(ab’)2或scfv。

7.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含編碼根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的核苷酸序列。

8.載體分子，其特征在于，所述載體分子包含權(quán)利要求7所述的核酸分子。

9.宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求7所述的核酸分子或權(quán)利要求8所述的載體分子。

10.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的制備方法，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過(guò)人工合成或基因工程方式制備。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種用于B型肉毒神經(jīng)毒素的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明可以對(duì)各類疑似肉毒神經(jīng)毒素中毒案例在短時(shí)間完成定性檢測(cè)，為輔助醫(yī)生診斷、及時(shí)進(jìn)行治療決策提供證據(jù)支持，在社會(huì)衛(wèi)生安全方面具有重要意義。同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法能夠顯著提高對(duì)毒素蛋白的特異性，避免血清型鑒別等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的時(shí)長(zhǎng)問(wèn)題等，可以應(yīng)用于肉毒神經(jīng)毒素制品研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程。此外，本發(fā)明能夠?qū)θ舛旧窠?jīng)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性及保質(zhì)期等方面進(jìn)行質(zhì)量控制。

技術(shù)研發(fā)人員：王怡之,陸儉,張若暉,馬亞峰,張政,朱俐,張雪平,朱衍志,孫寶剛
受保護(hù)的技術(shù)使用者：蘭州生物技術(shù)開發(fā)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19