本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑及其制備方法、封片方法，屬于免疫熒光。

背景技術(shù)：

1、免疫熒光原位雜交技術(shù)（immunofluorescence?in?situ?hybridizationtechnique，immuno-fish），簡(jiǎn)稱免疫?fish，是利用抗原與抗體反應(yīng)的原理，將特異性抗原或抗體定位于試驗(yàn)細(xì)胞或細(xì)胞中的染色體上的一種常用標(biāo)記技術(shù)，用于對(duì)特異蛋白抗原或抗體在細(xì)胞或染色體上的分布、表達(dá)量等情況進(jìn)行研究，以達(dá)到定量、定位檢測(cè)的效果。該技術(shù)已在人、小鼠、斑馬魚、果蠅等模式生物的染色體免疫熒光定位分析中有較多報(bào)道。

2、長(zhǎng)期以來(lái)，熒光染料的淬滅，也就是染色后細(xì)胞或組織切片上熒光的衰減一直是困擾細(xì)胞或組織熒光染色的主要問(wèn)題。熒光染料的淬滅原因主要有兩種：第一，染料本身的屬性。熒光衰減是一個(gè)不可避免的過(guò)程，熒光染料之間的衰減速度也差別很大。目前市場(chǎng)上常見的alexa?fluor系列染料如488、555、594和647等和傳統(tǒng)的染料比起來(lái)不僅亮度增加，而且衰減速度明顯變慢。第二，在顯微照相時(shí)顯微鏡的激發(fā)光尤其是共聚焦顯微鏡的激光會(huì)加速熒光染料的淬滅速度。這一點(diǎn)對(duì)于表達(dá)豐度很低的蛋白非常明顯，因?yàn)榈鞍妆磉_(dá)量低導(dǎo)致熒光信號(hào)很弱，在用共聚焦顯微鏡照相時(shí)往往需要加大激光能量輸出的強(qiáng)度而導(dǎo)致熒光信號(hào)迅速衰減。

3、熒光的減弱或淬滅不僅嚴(yán)重影響圖片的質(zhì)量（最佳分辨率低）和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。目前市場(chǎng)上現(xiàn)有的大部分封片劑都不能解決強(qiáng)激發(fā)光或拍攝時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成的熒光信號(hào)衰減的問(wèn)題，即使有少部分抗熒光淬滅的封片劑也只對(duì)某些熒光染料有保護(hù)作用，做不到全覆蓋，且當(dāng)靶向蛋白的豐度過(guò)低時(shí)，這個(gè)問(wèn)題尤其突出。因此，亟需研究出一種可以增強(qiáng)整體熒光亮度并減緩熒光染料的衰減的抗淬滅的封片劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑及其制備方法、封片方法，可以增強(qiáng)整體熒光亮度，在激發(fā)光下維持熒光的穩(wěn)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光信號(hào)更準(zhǔn)確的定量。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明是采用下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，每100ml封片劑中包括15~30ml酸堿緩沖液、10~20ml粘度調(diào)節(jié)劑、0.5~5g抗熒光淬滅復(fù)合物以及0.1~1g增效劑，其余為蒸餾水，其中，所述抗熒光淬滅復(fù)合物包括三乙烯二胺和乙二胺四乙酸。

4、可選的，所述酸堿緩沖液的ph范圍為7.0~9.0，其包括磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷中的一種或多種。

5、可選的，所述酸堿緩沖液為檸檬酸緩沖液和三羥甲基氨基甲烷的混合物。

6、可選的，所述粘度調(diào)節(jié)劑為甘油和/或聚乙二醇。

7、可選的，所述聚乙二醇為低分子量聚乙二醇、中分子量聚乙二醇和高分子量聚乙二醇中的一種或多種，其中，所述低分子量聚乙二醇的分子量為200、400、600和800，所述中分子量聚乙二醇的分子量為1000、1500、2000和4000，所述高分子量聚乙二醇的分子量為6000、8000、10000和20000。

8、可選的，所述抗熒光淬滅復(fù)合物中三乙烯二胺和乙二胺四乙酸的質(zhì)量比為1:?3~6。

9、可選的，所述增效劑為丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯經(jīng)二甲基亞砜溶解后的溶液。

10、第二方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑的制備方法，包括：

11、將酸堿緩沖液、粘度調(diào)節(jié)劑、抗熒光淬滅復(fù)合物以及蒸餾水混合得到溶液a；

12、將溶液a與增效劑混合得到增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑。

13、第三方面，本發(fā)明提供一種增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑的封片方法，包括：

14、細(xì)胞或組織用目標(biāo)第一抗體孵育結(jié)合，并進(jìn)行熒光染色標(biāo)記操作；

15、將細(xì)胞或組織滴加于載玻片上，并將封片劑滴加在細(xì)胞或組織上，

16、在蓋玻片的下表面均勻涂抹密封劑以密封蓋玻片所有側(cè)面，并將其蓋于載玻片上，完成封片。

17、進(jìn)一步的，在蓋上蓋玻片前還包括復(fù)染操作，所述復(fù)染操作包括向封片劑內(nèi)加入細(xì)胞核熒光染料，所述細(xì)胞核熒光染料為4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，其濃度范圍為0.5~10μg/ml。

18、有益效果

19、本發(fā)明所提供的抗熒光淬滅的封片劑可以強(qiáng)勁地穩(wěn)定細(xì)胞或組織樣品中的熒光表征，并大大提高捕獲熒光信號(hào)的敏感度，維持熒光染色樣品較長(zhǎng)的時(shí)間保存，有效解決細(xì)胞或組織樣品中熒光染料的光穩(wěn)定性問(wèn)題，大大提高捕獲的熒光信號(hào)的敏感度，從而為實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)更準(zhǔn)確的定量提供了保障，并且本發(fā)明的抗淬滅劑可以有效地減緩熒光染料在強(qiáng)激發(fā)光照射下的淬滅程度；

20、本發(fā)明所提供的抗熒光淬滅的封片劑的復(fù)合配方獨(dú)特，其中，三乙烯二胺具有減緩熒光淬滅的作用，和聚乙二醇類物質(zhì)在試劑中起到催化作用；丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯作為高效、毒副作用小的抗氧化劑，有利于試劑和玻片的長(zhǎng)期保存；

21、本發(fā)明所提供的抗熒光淬滅的封片劑的制備方法簡(jiǎn)單便捷，經(jīng)濟(jì)性高，可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的熒光信號(hào)保護(hù)中，且利用本發(fā)明的封片劑在實(shí)施封片時(shí)使用方便，封片后即可成像拍照，在封片前加入細(xì)胞核熒光染料還可將封片與復(fù)染一步完成，省略了核染的步驟，節(jié)約了時(shí)間和成本。

技術(shù)特征：

1.一種增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，每100ml封片劑中包括15~30ml酸堿緩沖液、10~20ml粘度調(diào)節(jié)劑、0.5~5g抗熒光淬滅復(fù)合物以及1~15ml增效劑，其余為蒸餾水，其中，所述抗熒光淬滅復(fù)合物包括三乙烯二胺和乙二胺四乙酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述酸堿緩沖液的ph范圍為7.0~9.0，其包括磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷中的一種或多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述酸堿緩沖液為檸檬酸緩沖液和三羥甲基氨基甲烷的混合物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述粘度調(diào)節(jié)劑為甘油和/或聚乙二醇。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述聚乙二醇為低分子量聚乙二醇、中分子量聚乙二醇和高分子量聚乙二醇中的一種或多種，其中，所述低分子量聚乙二醇的分子量為200、400、600和800，所述中分子量聚乙二醇的分子量為1000、1500、2000和4000，所述高分子量聚乙二醇的分子量為6000、8000、10000和20000。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述抗熒光淬滅復(fù)合物中三乙烯二胺和乙二胺四乙酸的質(zhì)量比為1：3~6。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述增效劑為丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯經(jīng)二甲基亞砜溶解后的溶液。

8.一種如權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑的制備方法，其特征在于，包括：

9.一種如權(quán)利要求1~7任一項(xiàng)所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑的封片方法，其特征在于，包括：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑的封片方法，其特征在于，在蓋上蓋玻片前還包括復(fù)染操作，所述復(fù)染操作包括向封片劑內(nèi)加入細(xì)胞核熒光染料，所述細(xì)胞核熒光染料為4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，其濃度范圍為0.5~10μg/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種增強(qiáng)型抗熒光淬滅的封片劑及其制備方法、封片方法，具體涉及免疫熒光技術(shù)領(lǐng)域，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中熒光染料在強(qiáng)激發(fā)光照射下迅速衰減等問(wèn)題，其每100mL封片劑中包括15~30mL酸堿緩沖液、10~20mL粘度調(diào)節(jié)劑、0.5~5g抗熒光淬滅復(fù)合物以及1~15mL增效劑，其余為蒸餾水，其中，所述抗熒光淬滅復(fù)合物包括三乙烯二胺和乙二胺四乙酸。本發(fā)明所提供的封片劑可以增強(qiáng)整體熒光亮度，在激發(fā)光下維持熒光的穩(wěn)定，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光信號(hào)更準(zhǔn)確的定量。

技術(shù)研發(fā)人員：孫益軍,王月平,張峰,章春薺
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19