本發(fā)明涉及材料分析檢測，具體涉及一種功能性含氟納米磁珠的制備方法及應用。

背景技術(shù)：

1、隨著蛋白質(zhì)組學的研究與質(zhì)譜儀的準確性與靈敏度的提高，目前基于質(zhì)譜方法檢測ptms已經(jīng)成為常用手段之一。然而如何實現(xiàn)快速、大量的檢測成了限制質(zhì)譜在蛋白組學中應用的關(guān)鍵。常見的方法大多是利用生物素標記法，通過親和分離以及純化進行質(zhì)譜檢測。然而在分離與純化的過程中，未反應的生物素標簽難以從捕獲樹脂中洗脫，且生物素標簽在質(zhì)譜測試過程中會發(fā)生解離。導致在數(shù)據(jù)分析過程中觀察到大量的被解離的分子碎片，導致在鑒定低豐度物質(zhì)中產(chǎn)生的誤差較大。為了解決這一問題的困擾，近年來提出了利用氟親和標簽(fluorousaffinitytag,?fat)?來代替生物素作為標記物應用于蛋白質(zhì)組學方法的開發(fā)中。我們曾利用?tfia作為標簽實現(xiàn)對擬南芥體內(nèi)的s-亞硝基化修飾的肽段進行定量檢測（參照文獻：1?guochen?qin,?menghuan?qu,?bei?jia,?wei?wang,?zhoujunluo,?chun-peng?song,?w.?andy?tao,?pengcheng?wang.?fat-switch-basedquantitative?s-nitrosoproteomics?reveals?a?key?role?of?gsnor1?in?regulatinger?functions.?nat.?commun.,?2023,?14,?3268.）。在實驗過程中選擇c18富集柱對含有tfia標簽的肽段進行標記，但由于c18富集柱無法實現(xiàn)特異性富集，因此導致富集效率穩(wěn)定性較差。

2、為了提高對含氟標簽的特異性富集，也為了能夠更好的實現(xiàn)高通量、自動化檢測。我們嘗試利用磁珠這一廣泛應用于生物醫(yī)學領(lǐng)域的一種新型功能性材料實現(xiàn)提高富集效率、自動化檢測的目標。我們利用氟與氟之間的鍵合能力遠強于氟與氫之間的鍵合能力的特點，嘗試將含氟硅烷與功能性磁珠結(jié)合，來構(gòu)建能夠批量的、特異性的富集含有氟標簽的肽段的方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對以上問題提供一種功能性含氟納米磁珠的制備方法及應用，分別用于制備含氟納米磁珠、構(gòu)建富集含有氟標簽的肽段的方法。

2、為達到上述目的，本發(fā)明公開了一種功能性含氟納米磁珠的制備方法及應用，該功能性含氟納米磁珠的制備方法包括如下步驟：步驟a100、利用二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物；步驟a200、對含有功能性含氟納米磁珠的混合物進行清洗，得到功能性含氟納米磁珠。

3、進一步的，所述二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應的結(jié)構(gòu)式表示如下：

4、。

5、進一步的，所述步驟a100包括：步驟a101、將二氧化硅包裹四氧化三鐵溶于乙醇溶液中；步驟a102、加入含氟硅烷和氨水，二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷發(fā)生偶聯(lián)反應，得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物。

6、進一步的，所述步驟a102中加入含氟硅烷和氨水后，觀察到分層現(xiàn)象后，在50oc下反應至上方懸濁液澄清，下層氟相逐漸渾濁，得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物。

7、進一步的，所述步驟a200包括：步驟a201、含有功能性含氟納米磁珠的混合物在磁力作用下除掉上層乙醇相及下層氟相溶液；步驟a202、加入全氟辛烷洗滌，磁力作用下去除溶液；步驟a203、加水溶液洗滌，磁力作用下去除溶液；步驟a204、加入甲醇水混合溶液洗滌，磁力作用下去除溶液；步驟a205、加入甲醇溶液洗滌，磁力作用下去除溶液；步驟a206、吹干得到功能性含氟納米磁珠。

8、本發(fā)明還公開了一種功能性含氟納米磁珠的應用方式，該功能性含氟納米磁珠由二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應得到，該功能性含氟納米磁珠用于富集含有氟標簽的肽段。

9、優(yōu)選的，所述功能性含氟納米磁珠通過以上所述的方法制備得到。

10、進一步的，功能性含氟納米磁珠的應用包括如下步驟：步驟b100、用氟標簽標記蛋白質(zhì)；步驟b200、用fasp方法酶解蛋白質(zhì)；步驟b300、用功能性含氟納米磁珠富集氟標簽標記肽段，洗脫并收集富集后的肽段；步驟b400、利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對收集到的肽段進行檢測。

11、進一步的，所述步驟b100包括：將待測蛋白質(zhì)置于離心管中加入氟標簽化合物對目標肽段進行標記，反應結(jié)束后采用fasp方法進行酶解；

12、進一步的，所述步驟b200包括：碳酸氫銨溶液置換洗滌，重復多次；加入酶進行酶解反應；加入酸溶液終止酶解反應，離心后上層清液通過真空濃縮處理。

13、進一步的，所述步驟b300包括：將功能性含氟納米磁珠與肽段溶液混合；孵育后在磁力作用下分離功能性含氟納米磁珠與溶液；用緩沖溶液和有機溶劑的混合溶液洗滌功能性含氟納米磁珠；用有機溶劑洗脫功能性含氟納米磁珠上的肽段。

14、綜上所述，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所制備的功能性含氟納米磁珠實現(xiàn)了對肽段的高效、特異性富集，解決了傳統(tǒng)生物素標記法中未反應標簽難以洗脫及標簽解離導致質(zhì)譜分析誤差的問題，通過應用該功能性含氟納米磁珠實現(xiàn)了高通量、自動化檢測，為蛋白質(zhì)組學研究提供了一種重要手段。

技術(shù)特征：

1.一種功能性含氟納米磁珠的制備方法，其特征在于，該制備方法包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的功能性含氟納米磁珠的制備方法，其特征在于，所述二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應的結(jié)構(gòu)式表示如下：

3.如權(quán)利要求1所述的功能性含氟納米磁珠的制備方法，其特征在于，所述步驟a100包括：

4.如權(quán)利要求3所述的功能性含氟納米磁珠的制備方法，其特征在于，所述步驟a102中加入含氟硅烷和氨水后，觀察到分層現(xiàn)象后，在50?oc下反應至上方懸濁液澄清，下層氟相逐漸渾濁，得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物。

5.如權(quán)利要求3所述的功能性含氟納米磁珠的制備方法，其特征在于，所述步驟a200包括：

6.一種功能性含氟納米磁珠的應用，其特征在于，所述功能性含氟納米磁珠通過如權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法制備得到，該功能性含氟納米磁珠用于富集含有氟標簽的肽段。

7.如權(quán)利要求6所述的功能性含氟納米磁珠的應用，其特征在于，該應用包括如下步驟：

8.如權(quán)利要求7所述的功能性含氟納米磁珠的應用，其特征在于，所述步驟b100包括：將待測蛋白質(zhì)置于離心管中加入氟標簽化合物對目標肽段進行標記。

9.如權(quán)利要求7所述的功能性含氟納米磁珠的應用，其特征在于，所述步驟b200包括：碳酸氫銨溶液置換洗滌，重復多次；加入酶進行酶解反應；加入酸溶液終止酶解反應，離心后上層清液通過真空濃縮處理。

10.如權(quán)利要求7所述的功能性含氟納米磁珠的應用，其特征在于，所述

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于材料分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，并具體公開了一種功能性含氟納米磁珠的制備方法及應用。功能性含氟納米磁珠的制備方法包括：二氧化硅包裹四氧化三鐵與含氟硅烷的偶聯(lián)反應得到含有功能性含氟納米磁珠的混合物；清洗后得到功能性含氟納米磁珠。該功能性含氟納米磁珠能夠用于富集含有氟標簽的肽段，具體操作步驟如下：用氟標簽標記待測蛋白質(zhì)，酶解標記后的待測蛋白質(zhì)，得到氟標簽標記肽段；用功能性含氟納米磁珠富集氟標簽標記肽段，洗脫并收集富集后的肽段；利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜對收集到的肽段進行檢測。本發(fā)明制備的功能性含氟納米磁珠實現(xiàn)了對肽段的高效、特異性富集，實現(xiàn)了高通量、自動化檢測，為蛋白質(zhì)組學研究提供了一種重要手段。

技術(shù)研發(fā)人員：秦國臣,吉瑞雪,杜鵬萌,王月萍
受保護的技術(shù)使用者：北京大學現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19