專利名稱:超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，屬于掃描顯微成像領域。
背景技術：
在材料科學領域，大量研究結(jié)果表明物質(zhì)在納米尺度的尺寸效應、量子效應、表面效應等使得納米材料與納米器件展現(xiàn)出非常優(yōu)異的性能。只有在納米尺度深入研究納米功能器件中表面與界面的物理化學過程以及不同表界面分子結(jié)構和性質(zhì)的變化，了解納米功能器件的工作機制，才能實現(xiàn)人工設計、制備具有特定性能納米器件的科學目標。
生命科學中生化反應和生物分子結(jié)構與性能的研究更是如此，由于生物分子結(jié)構(如構象)的多樣性、生化反應的非同步性和所處環(huán)境的非均一性，在納米尺度實現(xiàn)生理條 件下蛋白質(zhì)、核酸等單個生物分子成像表征，對揭示生命的奧秘、提高疾病的預防、診斷、治療水平具有重要意義。
光學成像是最常用的成像表征技術，但是由于光學衍射原理的限制，傳統(tǒng)光學顯微鏡只能達到波長量級的空間分辨率(一般在200nm-500nm)，限制了它在納米尺度對分子結(jié)構和功能研究中的應用。2006年以來各國研究人員提出了光活化定位顯微鏡(PALM)、隨機光學重構顯微鏡(STORM)、受激福射耗盡(Stimulated emission depletion-STED)顯微鏡等幾種突破衍射極限的熒光成像新原理，其中STED顯微鏡以其時間分辨的優(yōu)勢在對動態(tài)過程的成像應用中具有很大的前景。
STED顯微鏡作為一種超分辨的共聚焦光學顯微鏡,是一種掃描成像技術，它是在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡的基礎上，添加一路STED光束，通過調(diào)制STED光束波前在物鏡焦平面上形成空殼形狀焦斑，將激發(fā)光衍射光斑周圍的熒光分子轉(zhuǎn)換為非輻射態(tài)，實現(xiàn)了好于50納米的空間分辨率。目前超分辨的共聚焦光學顯微鏡的研究還處于起步階段，與其他成像技術的聯(lián)用尚未開展。
掃描探針顯微鏡(SPM)是二十世紀末發(fā)展起來的納米表界面掃描顯微成像技術。SPM具有很高的空間分辨率，能夠在三維實空間下實時觀察單個原子、分子在物質(zhì)表面的狀態(tài)并且研究與表面電子行為有關的物理及化學性質(zhì)，已成為在原子分子尺度上研究表界面行為的最有力的手段之一。SPM技術包括基于表界面的電子態(tài)的掃描隧道顯微技術、基于表面原子間相互作用力的原子力顯微技術、基于電解液離子電流的離子電導顯微技術等。
因為熒光成像可以定位特定的靶分子，將熒光成像技術與SPM技術聯(lián)用，通過熒光成像引導SPM探針在樣品表面特定位置進行形貌成像和多參量研究，既可以獲得單分子的光學信號和形貌圖像，又可以獲得單對分子間相互作用的其它參量信息。但是由于光學衍射極限的限制，現(xiàn)有的激光共聚焦顯微鏡空間分辨率只能達到250nm — 300nm，難以實現(xiàn)復雜體系中納米級光學成像，對SPM探針的弓I導定位也不夠精確。

發(fā)明內(nèi)容
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，通過在共聚焦光學顯微鏡中加入第二路調(diào)制光，實現(xiàn)超分辨的共聚焦光學顯微成像，突破傳統(tǒng)的光學衍射極限的限制；本發(fā)明通過將SPM與超分辨的共聚焦光學顯微系統(tǒng)結(jié)合，由于超分辨的共聚焦光學顯微鏡分辨率可接近SPM的分辨率，在獲得單分子的光學信號和形貌圖像的同時，可以獲得單對分子間相互作用的其它參量信息，實現(xiàn)在納米尺度和分子水平對復雜體系多參量成像和分析，還可以首先進行超分辨的光學顯微成像，然后利用該高分辨的光學顯微圖像對SPM探針進行納米級精確引導定位，實現(xiàn)特定靶點的SPM分析。
本發(fā)明所提供的一種超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)中，激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡,激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后匯聚至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺，得到待測樣品的熒光信號又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測器，所述光電探測器輸出的光電信號輸入至光學信號采集器；
經(jīng)收集透鏡匯聚后的激光入射至SPM探針的懸臂上，所述SPM探針設于所述樣品臺的上方；經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后入射至SPM探測器，所述·SPM探測器輸出的電信號輸入至SPM信號采集器；
所述SPM探針和樣品臺均與一位移控制器相連接。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述激光器a輸出的所述激光器b輸出的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡，以調(diào)整光路對準。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述待測樣品的熒光信號在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一反射鏡，用于對準光路；所述待測樣品的熒光信號在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一濾波片，用于濾除激發(fā)光。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后再經(jīng)一半反半透鏡后入射至SPM探測器。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所述SPM探針具體可為STM探針、AFM探針、TERS金屬探針或尚子電導探針。
本發(fā)明提供的超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)具有以下有益效果
I、在一套成像平臺上同時實現(xiàn)光學成像與SPM成像，在獲得單分子的光學信號和形貌圖像的同時，可以獲得單對分子間相互作用的其它參量信息。
2、同時成像克服了現(xiàn)在流行的二次成像帶來的定位不準和信息變化的缺點。
3、由超分辨的光學成像引導SPM成像和分析，由于超分辨的共聚焦光學顯微鏡分辨率可接近SPM的分辨率，可以實現(xiàn)更高精度的靶點定位。


圖I為本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)的結(jié)構示意圖。
圖2為使用本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)對熒光標記的納米微球的原子力形貌圖像(左)和超分辨共聚焦顯微圖像(右)。
圖中各標記如下1激光器a、2 二向色性濾光片a、3,9反射鏡、4顯微物鏡、5激光器b、6位相板、7 二向色性濾光片b、8樣品臺、10濾波片、11收集透鏡a、12光電探測器、13光學信號采集器、14半反半透鏡、15收集透鏡b、16AFM探針、17SPM探測器、18SPM信號采集器、19位移控制器。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實施例。
本發(fā)明提供的超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，
激光器al輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a2濾光后經(jīng)反射鏡3反射后匯聚至顯微物鏡4，激光器b5輸出的激光依次經(jīng)位相板6和二向色性濾光片b7濾光后經(jīng)反射鏡3反射后匯聚至顯微物鏡4 ;經(jīng)過顯微物鏡4匯聚的激光照射至樣品臺8上，待測樣品的熒光信號又經(jīng)顯微物鏡4匯聚后經(jīng)反射鏡3、二向色性濾光片a2、二向色性濾光片b7、反射鏡9、濾波片10和收集透鏡all收集后入射至光電探測器12，光電探測器12輸出的光電信號輸入至光學信號采集器13 ;透射過半反半透鏡14的激光經(jīng)收集透鏡bl5收集后入射至AFM探 針16的懸臂上，該AFM探針16設于樣品臺8的上方j^AFM探針16反射后的光經(jīng)收集透鏡bl5收集后入射至SPM探測器17，該SPM探測器17輸出的電信號輸入至SPM信號采集器18 ;本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)中，AFM探針16和樣品臺8均與一位移控制器19相連接，用于控制AFM探針16和樣品臺8的移動。
上述的聯(lián)用系統(tǒng)中，所用的SPM探針具體可選擇為STM探針、AFM探針、TERS金屬探針或離子電導探針等。
本發(fā)明提供的聯(lián)用系統(tǒng)中，激發(fā)用激光器al經(jīng)過二向色性濾光片a2、反射鏡3反射入顯微物鏡4，經(jīng)顯微物鏡4匯聚后，激發(fā)樣品發(fā)射熒光；退激發(fā)用激光器b5，經(jīng)過位相板6調(diào)整光束波前，經(jīng)二向色性濾光片b7和反射鏡3反射后，經(jīng)顯微物鏡4匯聚后形成空殼型焦斑，將激發(fā)光激發(fā)的熒光斑周圍熒光分子退激發(fā)，最后只有小體積的熒光分子自發(fā)輻射熒光，實現(xiàn)超分辨光學成像；樣品臺8在位移控制器19的控制下對樣品進行掃描，獲得不同位置的光學信號。熒光信號經(jīng)顯微物鏡4收集后，經(jīng)反射鏡3和反射鏡9反射后，由濾波片10濾除熒光以外的其它光，經(jīng)收集透鏡all匯聚后，由光電探測器12轉(zhuǎn)換為電信號；由光電探測器12獲得的光電信號，經(jīng)過光學信號采集器13采集后，由計算機進行重構和處理獲得超分辨熒光顯微圖像。
AFM探針16和樣品臺8在位移控制器19的統(tǒng)一控制下，實現(xiàn)樣品的探針掃描，AFM信號經(jīng)過半反半透鏡14反射后由SPM探測器17轉(zhuǎn)換為電信號，經(jīng)過SPM信號采集器18采集后，由計算機進行重構和處理獲得掃描探針顯微圖像。
AFM探針16由位移控制器19控制實現(xiàn)探針和光學焦斑的對準，然后位移控制器19控制樣品臺8掃描樣品，實現(xiàn)超分辨光學成像和SPM成像的同步成像。光學信號采集器13和SPM信號采集器18由位移控制器19觸發(fā)，實現(xiàn)同步采集。
使用上述聯(lián)用系統(tǒng)對熒光標記的40納米直徑的納米微球進行了超分辨共聚焦顯微和原子力聯(lián)用成像試驗，通過原子力針尖與物鏡焦點的精確對準，同時獲得了圖2所示原子力形貌圖像(左)和超分辨共聚焦顯微圖像(右)，其中超分辨共聚焦顯微圖像的分辨率已經(jīng)達到50nm的橫向空間分辨率，遠遠超過傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡。
權利要求
1.超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于 激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡,激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后入射至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺，得到待測樣品的熒光信號又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測器，所述光電探測器輸出的光電信號輸入至光學信號采集器； 經(jīng)收集透鏡b收集后的激光入射至SPM探針的懸臂上，所述SPM探針設于所述樣品臺的上方；經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后入射至SPM探測器，所述SPM探測器輸出的電信號輸入至SPM信號采集器； 所述SPM探針和樣品臺均與一位移控制器相連接。
2.根據(jù)權利要求
I所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于所述激光器a輸出的所述激光器b輸出的激光在匯聚至所述顯微物鏡之前均經(jīng)一反射鏡。
3.根據(jù)權利要求
I或2所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于所述待測樣品的熒光信號在入射至所述收集透鏡a之前經(jīng)過一反射鏡和一濾波片。
4.根據(jù)權利要求
I或2所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后再經(jīng)一半反半透鏡后入射至SPM探測器。
5.根據(jù)權利要求
1-4中任一所述的聯(lián)用系統(tǒng)，其特征在于所述SPM探針可為STM探針、AFM探針、TERS金屬探針或離子電導探針。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種超分辨共聚焦光學顯微鏡與掃描探針顯微鏡聯(lián)用系統(tǒng)。激光器a輸出的激光經(jīng)二向色性濾光片a濾光后匯聚至顯微物鏡，激光器b輸出的激光依次經(jīng)位相板和二向色性濾光片b濾光后入射至所述顯微物鏡；經(jīng)所述顯微物鏡匯聚的激光照射至樣品臺，得到待測樣品的熒光信號又經(jīng)所述顯微物鏡匯聚后經(jīng)收集透鏡a收集后入射至光電探測器，所述光電探測器輸出的光電信號輸入至光學信號采集器；經(jīng)收集透鏡b收集后的激光入射至SPM探針的懸臂上，所述SPM探針設于所述樣品臺的上方；經(jīng)所述SPM探針反射后的光經(jīng)所述經(jīng)收集透鏡b收集后入射至SPM探測器，所述SPM探測器輸出的電信號輸入至SPM信號采集器。由超分辨的光學成像引導SPM成像和分析，由于超分辨的共聚焦光學顯微鏡分辨率可接近SPM的分辨率，可以實現(xiàn)更高精度的靶點定位。
文檔編號G01Q60/02GKCN102809672SQ201210277343
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月6日
發(fā)明者方曉紅, 袁景和, 于建強, 張雪潔 申請人:中國科學院化學研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan