專(zhuān)利名稱(chēng):基于原子力顯微鏡的自動(dòng)化dna分子操縱方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA分子技術(shù)領(lǐng)域：
的方法，具體地說(shuō)，涉及的是一種基于原子力顯微鏡的自動(dòng)化DNA分子操縱方法。
背景技術(shù)：
原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)是在納米尺度上檢測(cè)樣品表面性質(zhì)的主要工具之一。AFM通過(guò)探測(cè)針尖與樣品表面的相互作用力獲取樣品表面的形貌，其橫向分辨率能夠達(dá)到0. Inm,縱向分辨率能夠達(dá)到0. Olnm。由于針尖樣品間存在力的相互作用，我們可以通過(guò)針尖給樣品施加不同大小和方向的作用力，從而實(shí)現(xiàn)在納米尺度上改變樣品形貌或性質(zhì)的目的。DNA分子是生物遺傳信息的載體，是生命科學(xué)領(lǐng)域最重要的生物大分子之一。傳統(tǒng)的生化基因分析方法只能夠獲得大量分子的統(tǒng)計(jì)信息，而基于AFM的納米操縱技術(shù)能夠?qū)⑻囟―NA片段進(jìn)行定位切割分離，提供了獲取單個(gè)DNA分子信息的可能性。
基于AFM的納米操縱需要解決的技術(shù)難題主要是提高針尖定位的準(zhǔn)確性，尤其是在操縱DNA這樣尺度在IOnm以下的納米物體的過(guò)程中，針尖定位的準(zhǔn)確性是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。目前高分辨的AFM的微位移驅(qū)動(dòng)器都采用壓電陶瓷材料，優(yōu)點(diǎn)是位移精度高，響應(yīng)速度快，但是存在非線性、遲滯、蠕變和熱漂移等效應(yīng)。其中熱漂移效應(yīng)是影響納米操縱準(zhǔn)確性的主要因素(Babak Mokaberi, A. G. Requicha, IEEE transaction on Automation Science and Engineering, 2004, 3 (3)，199-207)。例如在常規(guī)的DNA分子手動(dòng)操縱過(guò)程中， 實(shí)驗(yàn)人員需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力用于調(diào)整針尖的位置補(bǔ)償熱漂移，使得DNA分子的切割分離和拾取需要約8小時(shí)的時(shí)間，這限制了基于AFM的納米操縱的效率，不利于單分子納米操縱技術(shù)的推廣和標(biāo)準(zhǔn)化。因此，非常有必要發(fā)展一套基于高效漂移補(bǔ)償?shù)淖詣?dòng)化DNA 分子操縱方法。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Guangyong Li等在《Nanotechnology，2003. IEEE-ΝΑΝΟ 2003. 2003 Third IEEE Conference on》U003 年第三屆 IEEE 納米技 ^ ^ iX) (2003 ^Ξ pp64-67) ± R ^ 的 “Augmented Reality System forReal-time Nanomanipulation"(納米操縱擴(kuò)增實(shí)境系統(tǒng))，該文中提出基于原子力顯微鏡的自動(dòng)化操縱系統(tǒng)，具體為通過(guò)對(duì)針尖及針尖-樣品相互作用力建立模型，用力反饋操縱系統(tǒng)對(duì)納米尺度物體進(jìn)行“推動(dòng)”等操縱。其不足在于該系統(tǒng)由于沒(méi)有對(duì)熱漂移進(jìn)行補(bǔ)償，針尖的定位的精度約為50 lOOnm。同時(shí)由于該系統(tǒng)的操縱控制是基于對(duì)目標(biāo)物體的建模，因此形態(tài)較為復(fù)雜，力學(xué)性質(zhì)尚未完全清晰的DNA分子而言，操縱難度較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于原子力顯微鏡的自動(dòng)化 DNA分子操縱方法，克服在納米操縱過(guò)程中熱漂移對(duì)針尖定位準(zhǔn)確性的影響，同時(shí)參數(shù)設(shè)定方便，顯著提高操縱效率。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明采用動(dòng)態(tài)/靜態(tài)混合模式操縱DNA分子。成像時(shí)采用動(dòng)態(tài)模式(輕敲模式)，操縱時(shí)通過(guò)控制掃描管下降一定距離，使針尖振幅減小為零(靜態(tài)模式)，從而獲得足夠的操縱力。操縱之前首先計(jì)算當(dāng)前操縱范圍的表面傾斜，并在操縱過(guò)程中，讓針尖的移動(dòng)始終平行于樣品表面。然后基于熱漂移變化緩慢的性質(zhì)，采用圖像配準(zhǔn)的方法，通過(guò)計(jì)算連續(xù)兩幅掃描圖像之間的差異，獲取當(dāng)前操縱環(huán)境下熱漂移大小，并對(duì)針尖位移進(jìn)行補(bǔ)償，提高操縱精度。最后通過(guò)設(shè)計(jì)針尖移動(dòng)路徑，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的DNA分子切割分離和拾取操縱。
本發(fā)明包括如下步驟
第一步，用AFM對(duì)DNA樣品成像，選擇需要操縱的DNA片段后，以該片段為中心，將掃描范圍縮小至<2μπι;
第二步，對(duì)該范圍進(jìn)行一次掃描成像，獲取樣品表面的傾斜。然后，再按照相同的掃描方向(從上至下，或從下至上)連續(xù)存儲(chǔ)兩幅圖像。
第三步，根據(jù)兩幅連續(xù)存儲(chǔ)的圖像數(shù)據(jù)，計(jì)算當(dāng)前條件下的熱漂移大小和方向。
第四步，選擇操縱的目標(biāo)片段及操縱方式。操縱的方式包括切割、推動(dòng)和拾取，其中切割操縱將目標(biāo)片段從DNA分子鏈上分離，推動(dòng)操縱將目標(biāo)片段折疊成便于拾取的顆粒狀，拾取操縱將折疊的目標(biāo)片段粘附在AFM針尖上。
第五步，根據(jù)熱漂移的大小，補(bǔ)償目標(biāo)片段的坐標(biāo)，并根據(jù)設(shè)定的操縱方式完成 DNA操縱。
本發(fā)明通過(guò)采用基于圖像處理的熱漂移補(bǔ)償技術(shù)，將基于原子力顯微鏡的自動(dòng)化操縱的操縱精度提高到了 IOnm以下，與DNA分子(理論直徑2nm)相當(dāng)，因而能夠?qū)崿F(xiàn)高精度的DNA分子操縱。同時(shí)結(jié)合了自動(dòng)化技術(shù)，將DNA分子的操縱時(shí)間(單個(gè)DNA目標(biāo)片段切割、推動(dòng)和拾取的時(shí)間)，由手動(dòng)操縱的數(shù)小時(shí)，縮短至15分鐘以?xún)?nèi)，顯著提高了操縱效率。


圖1為DNA分子自動(dòng)化操縱流程圖；
其中(A)掃描獲取表面傾斜并連續(xù)同方向掃描兩幅圖像，并選擇需要操縱的DNA 片段，如箭頭所示；(B)切割操縱結(jié)果；(C)從下至上按“Z”字型推動(dòng)DNA片段，使其折疊成小球狀；并設(shè)定拾取操縱范圍，如圖中虛線方框所示；(D)拾取結(jié)果。
圖2為連續(xù)多次DNA自動(dòng)操縱流程圖；
其中㈧掃描獲取表面傾斜并連續(xù)同方向掃描兩幅圖像，并選擇需要操縱的DNA 片段，如箭頭所示；(B)切割分離和拾取第一個(gè)420nm的DNA片段，同時(shí)選取第二個(gè)需要操縱的DNA片段；(C)切割分離和拾取第二個(gè)341nm的DNA片段，同時(shí)選取第三個(gè)需要操縱的 DNA片段；⑶拾取第三個(gè)316nm的DNA片段。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例中使用的λ -DNA 分子和 APTES(3-aminopropyltriethoxysiIan)均購(gòu)自Sigma公司，裸云母購(gòu)自四川美豐云母工業(yè)有限責(zé)任公司，封口膜(Parafilm膜)購(gòu)自 American National Can 公司。
將新剝離的云母表面用的APTES(3-aminopropyltriethoxysilan)進(jìn)行修飾， 并在120°C環(huán)境下烘烤2小時(shí)以上。然后在修飾過(guò)的云母表面，用“分子梳”技術(shù)將DNA分子拉直以便于目標(biāo)片段的選取。
以下實(shí)施例中，各個(gè)參數(shù)的定義為
a)切割操縱參數(shù)
i.切割寬度切割過(guò)程中，以操縱點(diǎn)為中心，針尖在XY方向移動(dòng)的寬度。
ii.切割重復(fù)次數(shù)針尖在操縱點(diǎn)往返切割的次數(shù)。
iii.切割力針尖作用在DNA分子上的力(實(shí)際上此參數(shù)表示掃描管下降的距
1 ) O
b)推動(dòng)操縱參數(shù)
i.推動(dòng)寬度推動(dòng)過(guò)程中，以操縱點(diǎn)為中心，針尖在XY方向移動(dòng)的寬度。
ii.推動(dòng)步長(zhǎng)針尖“Z”字型運(yùn)動(dòng)時(shí)，每一步的長(zhǎng)度。
iii.推動(dòng)力針尖作用在DNA分子上的力(實(shí)際上此參數(shù)表示掃描管下降的距
1 ) O
c)拾取操縱參數(shù)
i.拾取范圍拾取過(guò)程中，以操縱點(diǎn)為中心的方形操縱范圍的大小。
ii.拾取力針尖作用在DNA分子上的力(實(shí)際上此參數(shù)表示掃描管下降的距
1 ) O
實(shí)施例一
用AFM對(duì)DNA樣品成像，并選擇需要操縱的DNA片段。以該DNA片段為中心將掃描范圍縮小至1. 5 μ m。通過(guò)一次完整掃描，獲取當(dāng)前掃描范圍的樣品表面傾斜。然后連續(xù)同方向掃描兩次，存儲(chǔ)兩幅圖像數(shù)據(jù)，如圖I(A)所示。根據(jù)兩幅圖像計(jì)算當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下的漂移大小和方向。選擇一段700nm長(zhǎng)度的DNA片段。設(shè)定切割操縱參數(shù)切割寬度200nm(針尖以切割位置為中心，沿DNA鏈切線方向，以200nm寬度在XY平面移動(dòng))，切割力-18nm(掃描管下降ISnm距離)，切割次數(shù)8次(針尖在切割位置往返移動(dòng)8次)；切割操縱結(jié)果如圖I(B)所示。然后設(shè)定推動(dòng)參數(shù)推動(dòng)寬度250m(針尖以目標(biāo)片段為中心軸，以200nm寬度在XY平面移動(dòng))，推動(dòng)力-17nm(掃描管下降17nm距離)，推動(dòng)步長(zhǎng)2nm(針尖沿DNA鏈軸向按“之”字型移動(dòng)，步長(zhǎng)2nm)；推動(dòng)操縱結(jié)果如圖I(C)所示。最后選擇拾取操縱范圍 IOOnm(以推動(dòng)后的DNA顆粒為中心，在100X IOOnm范圍內(nèi)進(jìn)行拾取操縱)，如圖1 (C)中虛線方框，拾取力-17nm(掃描管下降17nm距離)。拾取操縱結(jié)果如圖(D)所示。本例中，操縱精度為3nm，切割操縱的時(shí)間約為3秒，推動(dòng)操縱的時(shí)間約為50秒，拾取操縱的時(shí)間約為 10秒。
實(shí)施例二
用AFM對(duì)DNA樣品成像，并選擇需要操縱的DNA片段。以該DNA片段為中心將掃描范圍縮小至1.7μπι。通過(guò)一次完整掃描，獲取當(dāng)前掃描范圍的樣品表面傾斜。然后連續(xù)同方向掃描兩次，存儲(chǔ)兩幅圖像數(shù)據(jù)，如圖2(A)所示。DNA自動(dòng)化操縱軟件根據(jù)兩幅圖像計(jì)算當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下的漂移大小和方向。首先選擇一段420nm長(zhǎng)度DNA片段。然后設(shè)定切割操縱參數(shù)切割寬度200nm，切割力-16nm，切割次數(shù)8次；設(shè)定推動(dòng)參數(shù)推動(dòng)寬度250m，推動(dòng)力-15nm，推動(dòng)步長(zhǎng)2nm ；設(shè)定拾取參數(shù)拾取范圍lOOnm，拾取力-15nm。DNA自動(dòng)化操縱軟件根據(jù)熱漂移的大小，調(diào)整目標(biāo)片段的坐標(biāo)，并根據(jù)設(shè)定的操縱方式及相關(guān)參數(shù)完成DNA 操縱，如圖2(B)所示。按照同樣的方法選擇另外兩段長(zhǎng)度分別為341nm和316nm的DNA片段進(jìn)行操縱，如圖2(C)和(D)。由于操縱時(shí)掃描范圍不變，不需要再次獲取表面傾斜，并且由于三次操縱連續(xù)進(jìn)行，熱漂移的大小和方向基本不變，也不需要再次計(jì)算漂移大小。本例中，操縱精度為7nm，連續(xù)三次DNA片段的切割分離和拾取操縱共用時(shí)8min。
權(quán)利要求
1.一種基于原子力顯微鏡的自動(dòng)化DNA分子操縱方法，其特征在于包括如下步驟 第一步，用原子力顯微鏡對(duì)DNA樣品成像，選擇待操縱的DNA片段后，以該片段為中心，將掃描范圍縮小至<2μπι;第二步，對(duì)該范圍進(jìn)行一次掃描成像，獲取樣品表面的傾斜度，然后，再按照相同的掃描方向連續(xù)存儲(chǔ)兩幅圖像；第三步，根據(jù)兩幅連續(xù)存儲(chǔ)的圖像數(shù)據(jù)，計(jì)算當(dāng)前條件下的熱漂移大小和方向； 第四步，選擇操縱的目標(biāo)片段及操縱方式，操縱的方式包括切割、推動(dòng)和拾取，其中切割操縱將目標(biāo)片段從DNA分子鏈上分離，推動(dòng)操縱將目標(biāo)片段折疊成便于拾取的顆粒狀， 拾取操縱將折疊的目標(biāo)片段粘附在原子力顯微鏡針尖上；第五步，根據(jù)熱漂移的大小，補(bǔ)償目標(biāo)片段的坐標(biāo)，并根據(jù)設(shè)定的操縱方式完成DNA操縱。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的基于原子力顯微鏡的自動(dòng)化DNA分子操縱方法，其特征是，第二步中，所述掃描方向，是指從上至下，或從下至上。
專(zhuān)利摘要
本發(fā)明涉及的是一種DNA分子技術(shù)領(lǐng)域：
的基于原子力顯微鏡技術(shù)的自動(dòng)化DNA分子操縱方法，采用動(dòng)態(tài)/靜態(tài)混合模式操縱DNA分子。成像時(shí)采用動(dòng)態(tài)模式，操縱時(shí)通過(guò)控制掃描管下降一定距離，使針尖振幅減小為零，從而獲得足夠的操縱力，操縱之前計(jì)算當(dāng)前操縱范圍的表面傾斜，并在操縱過(guò)程中，讓針尖的移動(dòng)始終平行于樣品表面。然后基于熱漂移變化緩慢的性質(zhì)，采用圖像配準(zhǔn)的方法，通過(guò)計(jì)算連續(xù)兩幅掃描圖像之間的差異，獲取當(dāng)前操縱環(huán)境下熱漂移大小，并對(duì)針尖位移進(jìn)行補(bǔ)償，提高操縱精度。最后通過(guò)設(shè)計(jì)針尖移動(dòng)路徑，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的DNA分子切割分離和拾取操縱。本發(fā)明顯著提高了DNA分子納米操縱的效率，提高了定位操縱的精度。
文檔編號(hào)G01Q60/24GKCN101435759 B發(fā)布類(lèi)型授權(quán) 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810204393
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2008年12月11日
發(fā)明者呂鳴, 孫潔林, 張福春, 胡鈞, 龍飛 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專(zhuān)利引用 (2), 非專(zhuān)利引用 (2),