專利名稱:利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及掃描探針顯微鏡及相關(guān)掃描探針模式傳感器生物學(xué)應(yīng)用的標(biāo)記檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法。
背景技術(shù)：
生物標(biāo)記技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用于生物領(lǐng)域的一門技術(shù)，其基本原理是利用標(biāo)記物的信號(hào)結(jié)合生物材料特異結(jié)合的屬性，進(jìn)而通過對(duì)信號(hào)的閱讀間接反映生物結(jié)合作用的存在。由于通常的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，在反應(yīng)量不足或抗原為半抗原、抗體為單價(jià)抗體時(shí)，肉眼不易察出。而有一些物質(zhì)即使在含量極微時(shí)仍能用某種特殊的理化測(cè)試儀器將其檢測(cè)出來，典型的如酶標(biāo)記的免疫檢測(cè)技術(shù)(EIA)，免疫熒光標(biāo)記技術(shù)(IFA)、反射免疫標(biāo)記技術(shù) (RIA)等，利用抗原抗體的結(jié)合具有高度特異性，通過洗滌、免疫層析等步驟實(shí)現(xiàn)游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離，再通過酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)底物顯色或通過觀察熒光信號(hào)等反映出抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的存在或結(jié)合位置。標(biāo)記物質(zhì)可以結(jié)合在抗體或抗原分子上，它就能追蹤抗原或抗體并與之結(jié)合，通過化學(xué)或物理的手段使肉眼不可見的反應(yīng)放大、轉(zhuǎn)化為可見的、可測(cè)知的、可描記的光、色、電、脈沖等信號(hào)。根據(jù)這種類似抗原抗體結(jié)合的特異性和標(biāo)記分子的敏感性建立的試驗(yàn)技術(shù)，稱為生物標(biāo)記技術(shù)。這些技術(shù)可用于檢測(cè)抗原或抗體，其特異性和敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的血清學(xué)技術(shù)。生物領(lǐng)域內(nèi)已普遍應(yīng)用的還可以是核酸、受體、配體等生物物質(zhì)的標(biāo)記示蹤技術(shù)。
生物標(biāo)記技術(shù)同樣可以結(jié)合微觀成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)納米級(jí)微觀圖像與標(biāo)記物的定位分析，免疫電鏡技術(shù)就是利用納米金顆粒的電子致密性特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了與背景生物材料的區(qū)分，在透射電子顯微鏡上實(shí)現(xiàn)了納米級(jí)病毒顆粒等生物物質(zhì)的免疫分析。但是，免疫電鏡技術(shù)仍然是目前僅有的將病原高分辨率微觀形態(tài)學(xué)與免疫識(shí)別技術(shù)同時(shí)結(jié)合在一起的病原檢測(cè)方法。盡管這是一種需要染色和固定的形態(tài)學(xué)破壞性檢測(cè)技術(shù)，且并不適合于多元化和自動(dòng)化檢測(cè)，但對(duì)于不可培養(yǎng)的病毒檢測(cè)而言，它仍然保持著基準(zhǔn)的檢測(cè)方法地位，核心原因便在于將免疫學(xué)的特異性精確到對(duì)單個(gè)微生物病原的定位與結(jié)合。
由于微觀高分辨率形態(tài)學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展必須依賴于新型高分辨率儀器的出現(xiàn)， 新的替代技術(shù)發(fā)展受到一定限制。隨著新型高分辨率觀測(cè)工具——原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)的出現(xiàn)，由于它具備接近生理?xiàng)l件(液相)觀察樣品的優(yōu)勢(shì)，使之成為生物樣品觀察的理想工具，其制樣的簡(jiǎn)便性以及高分辨率三維成像模式，使之不需要固定、染色或其它合成制樣模式便可直接以粒徑、粗糙度等量化指標(biāo)描述納米級(jí)的病毒顆粒，成為表面微觀研究的重要工具。作為以探針掃描采集信號(hào)的一種成像方式，AFM是近十幾年來表面成像技術(shù)中最重要的進(jìn)展之一。AFM可以在自然狀態(tài)下檢測(cè)樣品，因而使樣品更接近生理狀態(tài)，既可以觀察生物樣品局部微區(qū)形貌，還可以檢測(cè)生物分子間相互作用力。對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的研究，在微生物領(lǐng)域中的研究都具有重要的意義。
基于AFM高分辨率成像能力及其生物學(xué)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，如果結(jié)合生物標(biāo)記等示蹤檢測(cè)技術(shù)，將成為類似于免疫電鏡檢測(cè)的另一新型替代技術(shù)，實(shí)現(xiàn)微觀成像與特異性定位分析的結(jié)合，并充分發(fā)揮AFM生物學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，本方法在生物學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)了原子力顯微鏡的微觀高分辨率成像性能與特異性檢測(cè)性能的有效結(jié)合，可直接用于微生物等生物材料的標(biāo)記免疫診斷和定位分析。
本發(fā)明利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，具體為
1)采用現(xiàn)有技術(shù)的方法制備用于標(biāo)記的硬質(zhì)顆粒材料；
2)將樣品載體玻片經(jīng)過洗滌液超聲洗滌后，再經(jīng)過多聚賴氨酸處理；
3)制備用硬質(zhì)顆粒材料標(biāo)記的微生物樣品片；
4)將樣品片固定到樣品貼片上；
5)利用AFM的探針的輕敲模式對(duì)樣品進(jìn)行掃描；
6)在室溫、大氣條件下以輕敲(Tapping)模式采集硬質(zhì)標(biāo)記材料的高度、振幅和相位的數(shù)據(jù)；
7)以有差異的相位圖顏色變化為主要判讀依據(jù)，以高度圖和振幅圖作為輔助判定依據(jù)，結(jié)合生物檢測(cè)對(duì)象的形態(tài)確定硬質(zhì)標(biāo)記材料顆粒的存在；
8)通過確定硬質(zhì)標(biāo)記材料顆粒后進(jìn)一步確定被標(biāo)記物存在。
進(jìn)一步，所述硬質(zhì)顆粒材料為具有硬質(zhì)屬性的納米金顆粒材料。
進(jìn)一步，所述掃描時(shí)同時(shí)采集高度、振幅和相位AFM信號(hào)數(shù)據(jù)，并利用相位圖亮度形貌數(shù)據(jù)特征結(jié)合高度、振幅形貌數(shù)據(jù)進(jìn)行組合判定。
進(jìn)一步，所述步驟5)中探針為由硅制成的RTESP探針，其懸臂的長度為 115-135 4 111，彈性常數(shù)1^為20-8(^/111，共振頻率為200_400kHz，針尖曲率半徑為5-lOnm，掃描速度為IHz和2. 8Hz。
進(jìn)一步，所述掃描像素256X256pixel 和 512X 512pixel。
進(jìn)一步，所述樣品載體玻片為15mm。
本發(fā)明中對(duì)于生物樣品載體應(yīng)用洗滌液洗滌和多聚賴氨酸處理，所得載體吸附性好，表面平整，適用于大多數(shù)AFM生物樣品樣片的制備。且使用的試劑常見、價(jià)格便宜，處理簡(jiǎn)單，不需用濃硫酸、強(qiáng)堿等有強(qiáng)腐蝕性的試劑分段定時(shí)處理，使整體時(shí)間大大縮短。本發(fā)明使用AFM輕敲模式掃描軟硬度不同的生物材料和硬質(zhì)標(biāo)記物，通過三種信號(hào)同時(shí)采集的分析方式，主要以相位圖反映標(biāo)記顆粒與生物材料軟硬度的不同，并結(jié)合高度圖和振幅圖形貌特征來反映生物抗原抗體等生物結(jié)合作用存在，進(jìn)而進(jìn)行定位檢測(cè)分析。


圖IA為本發(fā)明實(shí)施例1多聚賴氨酸處理樣品玻片AFM掃描結(jié)果；
圖IB為多聚賴氨酸處理的玻片制備納米金樣片的掃描結(jié)果；
圖IC為多聚賴氨酸處理的玻片制備的抗體包被納米金樣片掃描結(jié)果；
圖2A為本發(fā)明實(shí)施例2中制備的重組表達(dá)麻疹病毒核蛋白的大腸桿菌空白對(duì)照片AFM掃描結(jié)果；
圖2B為實(shí)施例2中抗體標(biāo)記納米金結(jié)合重組表達(dá)麻疹病毒核蛋白大腸桿菌樣片AFM掃描結(jié)果；
圖3A為本發(fā)明實(shí)施例3中制備的流感病毒空白對(duì)照片AFM掃描結(jié)果；
圖3B為實(shí)施例3中抗體標(biāo)記納米金結(jié)合流感病毒樣片AFM掃描結(jié)果。
具體實(shí)施方式
本說明應(yīng)用原子力顯微鏡掃描，以納米金作為硬質(zhì)顆粒材料標(biāo)記物，進(jìn)行特異抗體包被標(biāo)記，并對(duì)微生物表面特異抗原抗體結(jié)合的形貌掃描識(shí)別過程為例，目的在于創(chuàng)建一種新型的利用原子力顯微鏡實(shí)現(xiàn)對(duì)硬質(zhì)標(biāo)記材料信號(hào)和生物背景材料信號(hào)特異區(qū)分的解讀方法，但并不限于納米金顆粒材料作為硬質(zhì)標(biāo)記物。進(jìn)而可以利用納米金屬、納米合成物等硬質(zhì)標(biāo)記材料進(jìn)行特異性抗原、抗體、核酸等生物學(xué)標(biāo)記，再利用原子力顯微鏡進(jìn)行直接觀察檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)原子力顯微鏡的微觀高分辨率成像性能與特異性檢測(cè)性能在生物學(xué)領(lǐng)域的有效結(jié)合，擴(kuò)展原子力顯微鏡的生物學(xué)應(yīng)用范圍，直接用于微生物等生物材料的標(biāo)記免疫診斷或定位分析，以及其它領(lǐng)域內(nèi)相關(guān)的雜交技術(shù)標(biāo)記等生物檢測(cè)領(lǐng)域。
本發(fā)明的方法步驟如下
一、納米金的制備
1.煮金
三角燒用前用硫酸泡24h，取出水洗10遍，蒸餾水洗8遍，然后雙蒸水洗6遍，煮金用的三角燒及轉(zhuǎn)子為納米金專用。洗好的三角燒取IOOml雙蒸水，先用微波爐煮沸，然后放在加熱磁力攪拌機(jī)上，調(diào)整轉(zhuǎn)子，不要有液體濺出，旋轉(zhuǎn)平穩(wěn)，加Iml氯金酸，1. 5ml檸檬酸二鈉，其中先加氯金酸，然后加檸檬酸二鈉，1. 5ml要一起加入。觀察顏色變化，無色一黑一酒紅，到顏色穩(wěn)定為酒紅色，冷卻，裝在棕色瓶子里4°C保存。2.調(diào)節(jié)PH值
用小三角燒瓶(納米金專用)取15ml煮好的金子，用IM K2C03調(diào)節(jié)PH值，力口 70 μ 1 K2C03PH 值 8. 5 9. 0 之間。
3.最適蛋白量的測(cè)定
將納米金調(diào)至所需的PH值。將抗體用2mmol/L的硼酸鹽緩沖液(PH9. 0)稀釋值 0. 2mg/ml。稀釋后的抗體與其他有關(guān)試劑按下表逐項(xiàng)操作。
表一分光光度計(jì)測(cè)定納米金最小蛋白量計(jì)量
權(quán)利要求
1.利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，具體為1)采用現(xiàn)有技術(shù)的方法制備用于標(biāo)記的硬質(zhì)顆粒材料；2)將樣品載體玻片經(jīng)過洗滌液超聲洗滌后，再經(jīng)過多聚賴氨酸處理；3)制備用硬質(zhì)顆粒材料標(biāo)記的微生物樣品片；4)將樣品片固定到樣品貼片上；5)利用AFM的探針的輕敲模式對(duì)樣品進(jìn)行掃描；6)在室溫、大氣條件下以輕敲模式采集硬質(zhì)顆粒材料的高度、振幅和相位的數(shù)據(jù)；7)以有差異的相位圖顏色變化為主要判讀依據(jù)，以高度圖和振幅圖作為輔助判定依據(jù)，利用缺損的相位圖亮區(qū)指示硬質(zhì)顆粒材料與生物物質(zhì)的區(qū)分特征，結(jié)合生物檢測(cè)對(duì)象的形態(tài)確定硬質(zhì)顆粒材料顆粒的存在；8)通過確定硬質(zhì)顆粒材料顆粒后進(jìn)一步確定被標(biāo)記物存在。
2.如權(quán)利要求
1所述的利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，其特征在于，所述硬質(zhì)顆粒材料為具有硬質(zhì)屬性的納米金顆粒材料。
3.如權(quán)利要求
1所述的利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，其特征在于，所述掃描時(shí)同時(shí)采集高度、振幅和相位AFM信號(hào)數(shù)據(jù)，并利用相位圖亮度形貌數(shù)據(jù)特征結(jié)合高度、振幅形貌數(shù)據(jù)進(jìn)行組合判定。
4.如權(quán)利要求
1所述的利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，其特征在于，所述步驟幻中探針為由硅制成的RTESP探針，其懸臂的長度為115-135 μ m,彈性常數(shù)k為 20-80N/m，共振頻率為200-400kHz，針尖曲率半徑為5_10nm，掃描速度為IHz和2. 8Hz。
5.如權(quán)利要求
1所述的利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，其特征在于，所述掃描像素 256X256pixel 和 512 X 512pixel。
6.如權(quán)利要求
1所述的利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，其特征在于，所述樣品載體玻片的直徑為15mm。
專利摘要
本發(fā)明公開了利用原子力顯微鏡進(jìn)行生物標(biāo)記檢測(cè)的方法，具體為采用現(xiàn)有技術(shù)的方法制備用于標(biāo)記的硬質(zhì)顆粒材料；將樣品載體玻片經(jīng)過洗滌液超聲洗滌后，再經(jīng)過多聚賴氨酸處理；制備用硬質(zhì)顆粒材料標(biāo)記的生物樣品片；將樣品片固定到樣品貼片上；利用AFM的探針的輕敲模式對(duì)樣品進(jìn)行掃描；在室溫、大氣下以輕敲模式同時(shí)采集硬質(zhì)標(biāo)記材料的高度、振幅和相位的數(shù)據(jù)；以有差異的相位圖顏色變化為主要判讀依據(jù)，以高度圖和振幅圖作為輔助判定依據(jù)，結(jié)合生物對(duì)象形態(tài)確定硬質(zhì)標(biāo)記材料顆粒；通過確定硬質(zhì)標(biāo)記材料顆粒后確定被標(biāo)記物存在。本發(fā)明擴(kuò)展了原子力顯微鏡的生物學(xué)應(yīng)用范圍，可推廣至核酸標(biāo)記等領(lǐng)域，具有巨大的科學(xué)應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/48GKCN101408496 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200810226849
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2008年11月18日
發(fā)明者平芮巾, 張麗萍, 胡孔新 申請(qǐng)人:中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),