專利名稱:用于環(huán)境雌激素類污染物檢測(cè)的基因工程試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種境檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域：
的基因工程試劑盒及其應(yīng)用方法，具體是一種用于環(huán)境雌激素類污染物檢測(cè)的基因工程試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)境雌激素類污染物(Environmental htrogens，EEs)是自然或人類活動(dòng)中產(chǎn)生的在環(huán)境中持久存在的一類化學(xué)物質(zhì)，可通過(guò)直接或間接的方式在動(dòng)物和人類體內(nèi)蓄積、 富集，在機(jī)體內(nèi)與激素受體結(jié)合，它的作用與動(dòng)物內(nèi)分泌激素的作用類似，會(huì)引起人類及多種生物的神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)、內(nèi)分泌紊亂、免疫能力下降以及生殖失常等，直接關(guān)系著人類社會(huì)與生物圈生存與繁衍的根本性安全。因此，必須對(duì)Eh作全方位的檢測(cè)，以評(píng)估其潛在的風(fēng)險(xiǎn)與危害。
目前，EEs的檢測(cè)手段主要有化學(xué)法和生物學(xué)法?；瘜W(xué)法中應(yīng)用最廣泛的一種是高效液相色譜法，它往往與其它技術(shù)相結(jié)合來(lái)檢測(cè)EEs，如固相微萃取技術(shù)-高效液相色譜法(SPME-HPLC)，高效液相色譜法-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(HPLC-ToF)以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MQ等。雖然化學(xué)法測(cè)定環(huán)境激素含量準(zhǔn)確性較高且方法較多，但其樣品前處理和測(cè)定步驟十分復(fù)雜，儀器價(jià)格昂貴，且只能局限于對(duì)目標(biāo)化合物的分析方面，限制了化學(xué)法在檢測(cè)EEs的推廣與應(yīng)用。生物檢測(cè)方法可以兼顧Eh之間的加和作用和協(xié)同作用。子宮生長(zhǎng)試驗(yàn)是最早建立的生物學(xué)檢測(cè)Eh活性的方法，隨后，細(xì)胞檢測(cè)Eh 的方法如人類乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)，大鼠子宮腺癌細(xì)胞培養(yǎng)，肝細(xì)胞卵黃素生成實(shí)驗(yàn)等也有一定應(yīng)用。盡管動(dòng)物及細(xì)胞檢測(cè)方法可比較有效地研究雌激素類物質(zhì)的代謝過(guò)程，但其模型建立難度大，操作復(fù)雜，篩選通量不大，且哺乳動(dòng)物細(xì)胞的抗毒素能力較低，所以不太適于大量樣品的Eh快速檢測(cè)。相比于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，微生物具有培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單，篩選通量大， 抗毒素能力強(qiáng)等特點(diǎn)，更適于高通量樣品的快速篩查。利用分子生物學(xué)技術(shù)建立的重組酵母系統(tǒng)(YES) (Takamura Enya T, Ishihara J, Tahara S, et al. Analysis of estrogenic activity of food stuffs and cigarette smokecondensates using a yeast estrogen screening method. Food Chem Toxicol, 2003,41 (4) :543 550)是近年來(lái)應(yīng)用較廣泛的 EEs生物檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏度和特異性較好，且費(fèi)用低廉。但酵母生長(zhǎng)速度較慢，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，仍需進(jìn)一步完善。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和Eh污染問(wèn)題的日益嚴(yán)重，亟需建立更為簡(jiǎn)便快捷、高效靈敏且經(jīng)濟(jì)的高通量生物學(xué)檢測(cè)Eh的方法。
與其它微生物相比，大腸桿菌具有生長(zhǎng)周期短，遺傳背景清楚，操作步驟簡(jiǎn)單，改造技術(shù)成熟，培養(yǎng)成本低廉等優(yōu)勢(shì)，是進(jìn)行環(huán)境Eh生物學(xué)檢測(cè)的極佳個(gè)體，結(jié)合近年來(lái)分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一——蛋白質(zhì)內(nèi)含肽antein)，可實(shí)現(xiàn)高效靈敏、快捷經(jīng)濟(jì)的高通量檢測(cè)。蛋白質(zhì)內(nèi)含肽是存在于前體蛋白質(zhì)中的一段氨基酸序列，在蛋白成熟過(guò)程中可發(fā)生自我剪切，從前體蛋白中釋放出來(lái)，同時(shí)連接兩端的肽鏈，形成有活性的成熟蛋白。目前， 蛋白內(nèi)含肽已應(yīng)用到蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的各個(gè)方面，如蛋白快速純化，蛋白互作檢測(cè)，蛋白體內(nèi)外連接及環(huán)化，及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系研究；在醫(yī)學(xué)、制藥、傳染病學(xué)、農(nóng)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域
3都有應(yīng)用。由于蛋白質(zhì)內(nèi)含肽最早是在微生物中發(fā)現(xiàn)，且具有微生物易培養(yǎng)、易于操作、理化性質(zhì)明確等性質(zhì)，因此內(nèi)含肽在微生物分子生物學(xué)方面的應(yīng)用最為廣泛。最近，有關(guān)條件性蛋白內(nèi)含肽的研究備受研究者關(guān)注，一些條件性蛋白內(nèi)含肽被陸續(xù)構(gòu)建成功。這些內(nèi)含肽僅在特定條件下，如溫度和藥物誘導(dǎo)時(shí)(Rubing Liang et al. A novel strategy to create temperature-sensitive mutants withT7-expression system in Escherichia coli，J Microbiol Meth，2007，68 ( :497 506)，才能發(fā)生剪切，產(chǎn)生有活性的目標(biāo)蛋白。 利用條件性蛋白內(nèi)含肽來(lái)調(diào)控蛋白活性的方法與其它方法相比，其本底表達(dá)更低，不同條件下蛋白的表達(dá)水平與活性差異更明顯，使用范圍更廣泛。若利用雌激素敏感的蛋白內(nèi)含肽，將該內(nèi)含肽與顏色蛋白融合，即可實(shí)現(xiàn)受雌激素誘導(dǎo)的顏色蛋白表達(dá)，從而在分光光度計(jì)下進(jìn)行快速檢測(cè)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)資料檢索發(fā)現(xiàn)，公開(kāi)號(hào)為CN 1624483A的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)說(shuō)明書披露了一種檢測(cè)環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒及其制備方法，該方法利用抗原抗體反應(yīng)來(lái)檢測(cè)環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒。它利用了包被在酶標(biāo)板殺傷的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體和酶標(biāo)記鯽卵黃蛋白原單克隆抗體來(lái)反應(yīng)。步驟包括制備鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，包被于酶標(biāo)板上，用BSA封閉；制備鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，并用酶標(biāo)記，將標(biāo)記的抗體與等量甘油混合；將鯽卵黃蛋白原多克隆抗體與鯽卵黃蛋白原單克隆抗體共同包裝，得到為其檢測(cè)試劑盒。該試劑盒檢測(cè)方法復(fù)雜，需多步操作，時(shí)間較長(zhǎng)；價(jià)格昂貴，成本高；抗原抗體反應(yīng)假陽(yáng)性較高；檢測(cè)閾值較高，一般為500 1400ng/mL;且該試劑盒的應(yīng)用范圍有限，只能檢測(cè)鯽魚和相關(guān)種類的魚類的血清或血漿中含有的卵黃蛋白原。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于環(huán)境雌激素類污染物檢測(cè)的基因工程試劑盒及其應(yīng)用，檢測(cè)過(guò)程更加簡(jiǎn)便快捷，只需2 3小時(shí)即可獲得結(jié)果；沒(méi)有特殊的儀器要求，樣品需要量少，檢測(cè)穩(wěn)定性高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)ng/L ；在大大降低了分析成本的同時(shí)也提高了分析率。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)環(huán)境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其組分為2X104 體積份的LB培養(yǎng)基、1體積份的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)、20體積份的氯仿、10 體積份的十二烷基硫酸鈉溶液(SDQ、20體積份的鄰-硝基苯-β -D-半乳糖苷(ONPG)以及100體積份的碳酸鈉溶液。
所述的十二烷基硫酸鈉溶液是指質(zhì)量百分?jǐn)?shù)濃度為1 %的SDS的水溶液。
所述的碳酸鈉溶液是指濃度為IM的Na2CO3的水溶液。
本發(fā)明涉及上述試劑盒的檢測(cè)方法，包括如下步驟
步驟一，培養(yǎng)大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)DE3 (pLacZMER)；
所述的培養(yǎng)是指在37°C環(huán)境下采用振蕩搖床以以ISOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，培養(yǎng)至 OD600 為 0.6。
所述的大腸埃希氏菌DE3 (pLacZMER)為包含質(zhì)粒pLacZMER的大腸桿菌，具有卡那霉素抗性，生長(zhǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，生長(zhǎng)與培養(yǎng)溫度為37度；顯著特征為雌激素加入后會(huì)產(chǎn)生顏色反應(yīng)，且強(qiáng)度與雌激素濃度呈正相關(guān)。[0015]步驟二，向基因工程菌株的培養(yǎng)物中加入IPTG并進(jìn)行誘導(dǎo)處理；
所述的誘導(dǎo)處理是指在37°C環(huán)境下采用振蕩搖床以以ISOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)1小時(shí)。
步驟三，向基因工程菌株的培養(yǎng)物中依次加入氯仿、SDS和ONPG并進(jìn)行孵育處理后加入碳酸鈉溶液，再置于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)得到環(huán)境雌激素類污染物的含量。
所述的孵育處理是指在的環(huán)境下溫育至培養(yǎng)物的顏色為黃色。
所述的置于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)是指采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD42tl和 OD55tl后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算β-半乳糖苷酶活性=[IOOOX(OD420-OD550) X 1.75]/ [OD600 X (Τ2-Τ1) XV]，并得到環(huán)境雌激素類污染物的含量，其中Τ2和Tl分別為反應(yīng)終止時(shí)間和反應(yīng)起始時(shí)間，單位為分鐘；V為所取菌液體積，單位為mL，OD420和OD55tlOD6tici為光密度，OD = log(l/trans)，trans為檢測(cè)物的透光值。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明利用含有雌激素敏感的蛋白內(nèi)含肽的基因工程菌株并結(jié)合分光光度技術(shù)，建立了一種高通量快速檢測(cè)環(huán)境雌激素效應(yīng)的基因工程試劑盒與方法。利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程更加簡(jiǎn)便快捷，只需 2 3小時(shí)即可獲得結(jié)果；沒(méi)有特殊的儀器要求，樣品需要量少，檢測(cè)穩(wěn)定性高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)ng/L ；在大大降低了分析成本的同時(shí)也提高了分析率。
本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌Escherichia coli DE3 (pLacZMER)于2010年06月 04號(hào)提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏編號(hào)為 CGMCCN0 3913 ；該單位的地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編，100101。


圖1為質(zhì)粒pLacZMER酶切鑒定結(jié)果圖；
圖2為菌體蛋白SDS-PAGE檢驗(yàn)結(jié)果圖；
圖3體外純化的工程菌株表達(dá)蛋白在17 β -雌二醇誘導(dǎo)后的SDS-PAGE結(jié)果圖；
圖4DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的17 β -雌二醇后β -半乳糖苷酶活性變化圖；
圖5DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的雙酚A后β -半乳糖苷酶活性變化圖；
圖6DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環(huán)芳烴屈后β -半乳糖苷酶活性變化圖；
圖7DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環(huán)芳烴60H-屈后β -半乳糖苷酶活性變化圖。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1
基因工程試劑盒的制備
步驟一，將人源雌激素受體α蛋白的Ser301-Thr553肽段與蛋白質(zhì)內(nèi)含肽 (Mycobacteriumtuberculosis recA intein)融合，構(gòu)建雌激素敏感的蛋白質(zhì)內(nèi)含肽嵌合體；
(I)PCR擴(kuò)增蛋白質(zhì)內(nèi)含肽(Mycobacterium tuberculosis recA intein)片段，引物為 5，-GGATCCtgtttcgactacagcacccg_3，，5，-AAGCTTgttgtgcaccatgacaccgt-3，，純化回收；將該片段和質(zhì)粒pET28a分別用Bam Hi/Hind III雙酶切后，回收酶切片段；之后用T4 DNA連接酶連接兩個(gè)酶切片段，化學(xué)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a (F-endAl gin V44 thi-1 recAl relAl gyrA96 deoRnupG 0 80dlacZ ΔΜ15 Δ (lacZYA-argF) U169，hsdR17 (rK_mK+)，λ-)，鋪 LBK平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)；挑取克隆并提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMRecA，純化回收，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>(2) PCR擴(kuò)增人雌激素受體蛋白的kr301至Thr553區(qū)域，模板為 Gal4-ER-VP16 (Randal IMorse, Wadsworth Center 索取)。將人雌激素受體和 pMRecA 質(zhì)粒用Bss HII酶切后連接，即為雌激素敏感的蛋白質(zhì)內(nèi)含肽嵌合體質(zhì)粒pMER。
步驟二，將顏色蛋白β -半乳糖苷酶基因克隆到質(zhì)粒的Τ7啟動(dòng)子下游，構(gòu)建可高水平表達(dá)顏色蛋白的質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果證實(shí)；
以質(zhì)粒 ρΜΕ6522 為模板，用引物(5，-CCTTGGGGATCCatgaccatgattcaaggcacg-3，； 5‘-CCTTGGAAGCTTttatttttgacaccagaccaactgg-3‘)擴(kuò)增全長(zhǎng)的 IacZ 基因片段，純化回收； 將該片段和質(zhì)粒pET28a分別用Bam Hi/Hind III雙酶切后，回收酶切片段；之后用T4DNA 連接酶連接兩個(gè)酶切片段，化學(xué)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (F-endAl gin V44 thi-1 recAl relAl gyrA96 deoRnupG 0 80dlacZ ΔΜ15 Δ (lacZYA-argF) U169, hsdR17 (rK-mK+)，λ -)，鋪 LBK 平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)；挑取克隆并提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pETlacZ，純化回收，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>步驟三，利用反向PCR和無(wú)痕定點(diǎn)插入重組技術(shù)，將雌激素敏感的蛋白內(nèi)含肽插入到顏色蛋白半乳糖苷酶基因中，構(gòu)建雌激素敏感的基因工程菌株。酶切檢測(cè)證實(shí)基因插入無(wú)誤；蛋白質(zhì)電泳檢測(cè)證實(shí)工程菌株在無(wú)雌激素存在時(shí)顏色蛋白不表達(dá)，雌激素加入后可誘導(dǎo)顏色蛋白的高水平表達(dá)，且蛋白表達(dá)水平與雌激素濃度成正比；β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)證實(shí)該菌株在無(wú)雌激素存在時(shí)沒(méi)有β -半乳糖苷酶的活性，雌激素的加入可誘導(dǎo)出高水平的β -半乳糖苷酶活性，并與雌激素濃度成正比。
(1)以質(zhì)粒 pETlacZ 為模板，用引物(5，-tgttactcgctcacatttaatgttg-3‘； 5，-acccgtcggattctccgtg-3，)線性擴(kuò)增 pETlacZ，純化回收，_20°C保存?zhèn)溆茫?br>(2)以質(zhì)粒pMER為模板，PCR擴(kuò)增Mek intein片段
(5， -GTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGA GAATCCGACGGGTtgtttcgactacagcacccg-3，， 5，-TAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAA CAgttgtgcaccatgacaccgt-3，)，兩側(cè)帶有與IacZ插入位點(diǎn)兩側(cè)同源的序列。
(3)將線性片段pETlacZ和ΔI-SMTR intein混合后電轉(zhuǎn)化DY329(W3110DlacU169nadA: :TnlO gal490 lcI857 D(cro-bioA))感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)同源重組構(gòu)建lacZ-intein-ER嵌合物，鋪LBA平板，32°C過(guò)夜培養(yǎng)，分別挑取克隆并提取質(zhì)粒，測(cè)序鑒定，陽(yáng)性克隆即為重組質(zhì)粒-pLacZMER，純化回收，_20°C保存?zhèn)溆谩?br>(4)將重組質(zhì)粒 pLacZMER 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DE3 (F-, ompT, hsdSB (r B-mB-)，gal dcm(DE3))菌株，即為雌激素敏感的基因工程菌株。
(5) pLacZMER質(zhì)粒的酶切鑒定將構(gòu)建成功的質(zhì)粒pLacZMER用Bam Hi/Hind III 雙酶切，瓊脂糖電泳鑒定。如圖所示(圖1)，質(zhì)粒PLacZMER長(zhǎng)度大約為101Λ左右，質(zhì)粒 pET28a的長(zhǎng)度大約為5. 31Λ。質(zhì)粒pLacZMER用Bam Hi/Hind III酶切之后產(chǎn)生兩條條帶， 一條帶大小與pET28a相同，大約為5. 3kb ；另一條帶大小大約為4. 71Λ，與LacZ-intein-ER 嵌合物的大小相當(dāng)(LacZ為3. 51Λ，ER-intein為1.業(yè))。根據(jù)基因測(cè)序結(jié)果可知，質(zhì)粒 pLacZMER構(gòu)建成功，即已將LacZ-intein-ER嵌合物裝入pET28a質(zhì)粒。
圖1為質(zhì)粒pLacZMER酶切鑒定。圖中，M :DNA Marker ；1 pLacZMER質(zhì)粒；2 質(zhì)粒 pET28a ；3 :pLacZMER 質(zhì)粒用 Bam Hi/Hind III 酶切后電泳；4 =LacZ 片段；5 :ER_intein 片段。
(6)體內(nèi)顏色蛋白活性測(cè)定挑取DE3 (pLacZMER)單克隆，接種于3mL LB中(含 50 μ g/mL卡那霉素)，37°C培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6左右，加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)Ih或同時(shí)加入終濃度為ImM的IPTG和IOyL 17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品母液，搖培誘導(dǎo)lh，用聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGE)鑒定菌體蛋白。如圖所示(圖2)，DE3 (pLacZMER)工程菌可表達(dá)大小為198KD的蛋白；而DE3(pET28a)對(duì)照組只表達(dá)LacZ基因，蛋白大小為110KD。在加入17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品母液誘導(dǎo)后，DE3 (pLacZMER)工程菌可產(chǎn)生兩條條帶，一條大小為 110KD，與LacZ基因表達(dá)的蛋白大小相當(dāng)；另一條大小為90KD,與ER-intein蛋白大小相當(dāng)。因此，DE3 (pLacZMER)工程菌株構(gòu)建成功。該菌株不僅可在IPTG的誘導(dǎo)下高產(chǎn)量的表達(dá)，并且在17 β -雌二醇的誘導(dǎo)下，可發(fā)生intein的自我剪切，產(chǎn)生了完整的β _半乳糖苷酶和ER-intein兩部分；在沒(méi)有17 β -雌二醇存在的條件下，菌株蛋白無(wú)變化。
圖 2 為菌體蛋白 SDS-PAGE 檢驗(yàn)結(jié)果。M =Marker ；1 JPTG 誘導(dǎo)的 DE3 (pLacZMER) 工程菌；2 :IPTG誘導(dǎo)DE3(pET28a)3 :IPTG和17 β -雌二醇共同誘導(dǎo)的DE3 (pLacZMER)工程菌。
(7)純化蛋白體外活性誘導(dǎo)鑒定挑取DE3 (pLacZMER)單克隆，接種于3mL LB中 (含50 μ g/mL卡那霉素)，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。次日取出ImL培養(yǎng)物接種到ILLB中(含50 μ g/ mL卡那霉素)，當(dāng)OD6tltl達(dá)到0. 6時(shí)加入ImM IPTG，18°C過(guò)夜誘導(dǎo)。IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白經(jīng)過(guò)Ni-NTA親和純化(見(jiàn)附)后，在體外加入17 β-雌二醇誘導(dǎo)lh，SDS-PAGE鑒定。如圖所示(圖3) ,Ni-NTA親和純化產(chǎn)生的蛋白大小大約為198KD，與體內(nèi)表達(dá)的蛋白大小一致；在 17 β -雌二醇的誘導(dǎo)下，產(chǎn)生了兩條明顯的條帶，一條大小約為110KD，與LacZ基因表達(dá)的蛋白大小相當(dāng)；另一條大小約為90KD，與計(jì)算所得的ER-intein表達(dá)的蛋白大小相當(dāng)。證實(shí)了工程菌株在17 β -雌二醇的誘導(dǎo)下可發(fā)生intein的自我剪切，產(chǎn)生了完整的β _半乳糖苷酶和ER-intein兩部分。
圖3體外純化的工程菌株表達(dá)蛋白在17 β -雌二醇誘導(dǎo)后的SDS-PAGE結(jié)果。左側(cè)泳道為marker，中間泳道為未加入17 β -雌二醇，右側(cè)泳道為加入17 β -雌二醇的結(jié)果。
Ni-NTA親和純化蛋白流程。將IL細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫，8，OOOrpm離心IOmin收集細(xì)胞。將所產(chǎn)生的菌體懸浮于30mL裂解緩沖液QOmM Tris-HCl, 300mM NaCl PH 8.0,10% glycerol, 5mM β -ME,20mM imidazole, ImM PMSF)。超聲波破碎菌體(功率 700W，超聲如， 間歇6s，共超聲裂解100次)。12，OOOrpm離心60分鐘除去裂解液中所有不溶性顆粒，回收上清液。將上清加樣到裂解緩沖液徹底平衡過(guò)的2. 5mL Ni-NTA樹(shù)脂上。用50mL洗滌液以 8mL/h速度洗柱后，用5mL洗脫液以同樣的速度洗脫；分管收集洗脫液；收集液即為目標(biāo)蛋白。
(8) β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)。以無(wú)水乙醇作為溶劑配制17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品母液，使其終濃度為lmg/mL。之后用無(wú)水乙醇逐級(jí)稀釋成不同濃度的17β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 X IO"1,1 X IO"2,1 X IO"3,1 X IO"4,1 X IO"5,1 X IO"6,1 X IO"7,1 X IO"8,1 X IO"9, 1 X l(Tlclmg/mL)。接種 DE3 (pLacZMER)單菌落于 50mL LBK 液體培養(yǎng)基中，37°C搖培到 OD6tltl 約為0. 6時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG。分別取ImL菌液，加入不同濃度的17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μ L，及溶劑空白組(ImL菌液中加入IOyL乙醇)和培養(yǎng)基空白組(ImL菌液中加入10 μ L LB培養(yǎng)基)。搖培誘導(dǎo)lh。測(cè)定半乳糖苷酶活性，計(jì)算半乳糖苷酶活性倍數(shù)，每個(gè)樣品至少重復(fù)五次。如圖4所示，菌株在無(wú)雌激素存在時(shí)無(wú)β-半乳糖苷酶的活性，雌激素加入后可檢測(cè)到高水平的半乳糖苷酶活性，并與雌激素濃度成正比。 β-半乳糖苷酶的活性倍數(shù)隨17 β-雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度的降低而降低，呈S形相關(guān)；其最低檢測(cè)限可達(dá)到ng級(jí)，線性范圍在ng/L和100mg/L之間。
圖4DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的17 β -雌二醇后β -半乳糖苷酶活性變化。橫坐標(biāo)為17 β-雌二醇的濃度，縱坐標(biāo)為β-半乳糖苷酶活性變化倍數(shù)。β-半乳糖苷酶的活性倍數(shù)隨17 β -雌二醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度的降低而降低，呈S形相關(guān)，最低檢測(cè)限為 lng/L0
β -半乳糖苷酶活性測(cè)定方法lmL培養(yǎng)物在室溫6，OOOrpm離心aiiin收集細(xì)胞， ImL滅菌蒸餾水重懸，重復(fù)洗滌1次(將培養(yǎng)基徹底洗去，避免其干擾)，用ImL預(yù)冷的滅菌蒸餾水重懸。取500 μ L菌液補(bǔ)加滅菌蒸餾水到lmL，測(cè)定0D6(1(1。另取500 μ L菌液補(bǔ)加滅菌蒸餾水到ImL,再加入100 μ L氯仿、50 μ L 0. 1% SDS, 28°C水浴振蕩5s，加入0. 2mL 4mg/ mL的0NPG，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)(T1)。溫育直到黃色出現(xiàn)，加入0. 5mL IM的Na2CO3終止反應(yīng)，準(zhǔn)確記錄終止反應(yīng)時(shí)間(T2)。測(cè)定OD42tl和0D55(1。計(jì)算β-半乳糖苷酶活性。
β -半乳糖苷酶活性計(jì)量單位
Miller Units = [1000X (OD42ci-OD550) X 1· 75]/[0D_X (T2—T1) XV]，其中:V 為所取菌液體積(mL)，Tl、T2以min記。
β -半乳糖苷酶活性倍數(shù)
(樣品 Miller Units-溶劑空白組Miller Units) / 培養(yǎng)基空白組Miller Units。
步驟六，將雌激素敏感的基因工程菌株、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑、裂解劑1、裂解劑2、顯色劑和終止劑包裝即得到試劑盒，試劑盒包括雌激素敏感的基因工程菌株，培養(yǎng)基，誘導(dǎo)劑， 裂解劑1，裂解劑2，顯色劑和終止劑。
實(shí)施例2
基因工程試劑盒對(duì)多種環(huán)境雌激素效應(yīng)水平的檢測(cè)
利用實(shí)施例1中得到的試劑盒，對(duì)不同環(huán)境雌激素樣品和從污水處理廠獲得的污水樣品進(jìn)行測(cè)定，分析樣品的雌激素效應(yīng)水平。[0062]配制17β-雌二醇、雙酚A、屈和6-0H-屈的不同濃度(1 X 10—1，1 X 10_2，1 X 10_3， 1 X IO"4,1 X 10_5，1 X 10_6，1 X 10_7，1 X 10_8，1 X 10_9，1 X 10_lclmg/mL)的樣品，低溫保存。將從污水處理廠獲得污水污泥樣品用濾紙過(guò)濾，以固相萃取方法獲得待測(cè)樣品。測(cè)定樣品時(shí)，將雌激素敏感的基因工程菌株接種到ImL液體培養(yǎng)基中，37°C搖培到0D_約為0. 6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑1PL(1 1000稀釋)及不同濃度的樣品溶液10 μ L0 37°C搖培誘導(dǎo)1小時(shí)。室溫 6，OOOrpm離心^iiin收集細(xì)胞，ImL滅菌蒸餾水洗滌后用ImL滅菌蒸餾水重懸。取500 μ L 菌液補(bǔ)加滅菌蒸餾水到lmL，紫外分光光度計(jì)上測(cè)定0D_。另取500 μ L菌液補(bǔ)加滅菌蒸餾水到ImL,再加入100 μ L裂解劑1、50 μ L裂解劑2，28°C水浴振蕩5s，加入0. 2mL顯色劑， 準(zhǔn)確計(jì)時(shí)(T1)。溫育直到黃色出現(xiàn)，加入0. 5mL終止劑終止反應(yīng)，準(zhǔn)確記錄終止反應(yīng)時(shí)間(T2)。紫外分光光度計(jì)測(cè)定00_和0055(|。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算半乳糖苷酶活性 =[1000X (OD42tl-OD55tl) XL 75]/[0D_X (Τ2-Τ1) XV]。結(jié)果如圖 5-7 和表 1 所示。
圖5DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的雙酚A后β -半乳糖苷酶活性變化。 橫坐標(biāo)為雙酚A濃度，縱坐標(biāo)為半乳糖苷酶活性變化倍數(shù)。半乳糖苷酶的活性倍數(shù)隨雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品濃度的降低而降低，呈S形相關(guān)，最低檢測(cè)限為lng/L。
圖6DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環(huán)芳烴屈后β -半乳糖苷酶活性變化。橫坐標(biāo)為多環(huán)芳烴屈濃度，縱坐標(biāo)為半乳糖苷酶活性變化倍數(shù)。半乳糖苷酶的活性倍數(shù)增長(zhǎng)隨屈的濃度降低而逐漸減少，趨勢(shì)基本呈S形，最低檢測(cè)閾值為lOOng/L。
圖7DE3 (pLacZMER)工程菌在加入不同濃度的多環(huán)芳烴60H-屈后β -半乳糖苷酶活性變化。橫坐標(biāo)為多環(huán)芳烴60Η-屈濃度，縱坐標(biāo)為β-半乳糖苷酶活性變化倍數(shù)。β-半乳糖苷酶活性倍數(shù)增長(zhǎng)隨60Η-屈濃度降低而逐漸減少，趨勢(shì)基本呈S形，最低檢測(cè)閾值為 1 μ g/Lo
表1來(lái)源于污水處理廠的污水污泥樣品中麝香類化合物GC/MS含量測(cè)定與菌株法測(cè)定的雌激素活性比對(duì)。兩者趨勢(shì)一致，即麝香類化合物含量越多，其半乳糖苷酶活性倍數(shù)越高。
表1污水處理不同階段污水與污泥樣品中麝香類化合物的含量及雌激素活性
樣品來(lái)源厭氧池污泥缺氧池污泥回流污泥進(jìn)水一沉池水合成麝香類化合物濃度 (pg/L) (GC/MS)12095901.30.8P-半乳糖苷酶的活性倍數(shù)3.02.72.40.10.02
9
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)環(huán)境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其特征在于，其組分為2X104體積份的LB培養(yǎng)基、1體積份的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷、20體積份的氯仿、10體積份的十二烷基硫酸鈉溶液、20體積份的鄰-硝基苯- β -D-半乳糖苷以及100體積份的碳酸鈉溶液；培養(yǎng)大腸埃希氏菌至0D_為0.6。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)環(huán)境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其特征是，所述的十二烷基硫酸鈉溶液是指質(zhì)量百分?jǐn)?shù)濃度為的十二烷基硫酸鈉的水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的檢測(cè)環(huán)境雌激素類污染物的基因工程試劑盒，其特征是，所述的碳酸鈉溶液是指濃度為IM的Na2CO3的水溶液。
4.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求
所述基因工程試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，培養(yǎng)大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DE3 (pLacZMER)；步驟二，向基因工程菌株的培養(yǎng)物中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷并進(jìn)行誘導(dǎo)處理；步驟三，向基因工程菌株的培養(yǎng)物中依次加入氯仿、十二烷基硫酸鈉和鄰-硝基苯-β -D-半乳糖苷并進(jìn)行孵育處理后加入碳酸鈉溶液，再置于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)得到環(huán)境雌激素類污染物的含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測(cè)方法，其特征是，所述的培養(yǎng)是指在37°C環(huán)境下采用振蕩搖床以ISOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D_為0.6。
6.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測(cè)方法，其特征是，所述的大腸埃希氏菌DE3(pLacZMER)為包含質(zhì)粒pLacZMER的大腸桿菌，具有卡那霉素抗性，生長(zhǎng)培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，生長(zhǎng)與培養(yǎng)溫度為37度；顯著特征為雌激素加入后會(huì)產(chǎn)生顏色反應(yīng)，且強(qiáng)度與雌激素濃度呈正相關(guān)。
7.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測(cè)方法，其特征是，所述的誘導(dǎo)處理是指在37°C環(huán)境下采用振蕩搖床以ISOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)1小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的檢測(cè)方法，其特征是，所述的孵育處理是指在的環(huán)境下溫育至培養(yǎng)物的顏色為黃色。
9.根據(jù)權(quán)利要求
4所定述的檢測(cè)方法，其特征是，所述的置于紫外分光光度計(jì)中檢測(cè)是指采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD42tl和OD55tl后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算β -半乳糖苷酶活性=[1000Χ (OD420-OD550) X 1. 75]/[OD600 X (Τ2-Τ1) XV]，并得到環(huán)境雌激素類污染物的含量，其中Τ2和Tl分別為反應(yīng)終止時(shí)間和反應(yīng)起始時(shí)間，單位為分鐘；V為所取菌液體積， 單位為mL，OD420, OD550和OD6tltl為光密度，OD = log(l/trans)，trans為檢測(cè)物的透光值。
專利摘要
一種境檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域：
的用于環(huán)境雌激素類污染物檢測(cè)的基因工程試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒組分含量為2×104體積份的LB培養(yǎng)基、1體積份的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20體積份的氯仿、10體積份的十二烷基硫酸鈉溶液、20體積份的鄰-硝基苯-β-D-半乳糖苷以及100體積份的碳酸鈉溶液。本發(fā)明檢測(cè)過(guò)程更加簡(jiǎn)便快捷，只需2～3小時(shí)即可獲得結(jié)果；沒(méi)有特殊的儀器要求，樣品需要量少，檢測(cè)穩(wěn)定性高，檢測(cè)靈敏度可達(dá)ng/L；在大大降低了分析成本的同時(shí)也提高了分析率。
文檔編號(hào)C12R1/19GKCN101975776 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 201010516783
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2010年10月22日
發(fā)明者劉建華, 梁如冰 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (2),