專利名稱:乙型肝炎病毒的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及處理含有乙型肝炎病毒(下文中稱為“HBV”)的樣本以便高靈敏度地檢測或定量測定血液中的HBV抗原的方法，以及應(yīng)用所述處理方法檢測或定量測定HBV抗原的方法。
背景技術(shù)：
HBV是最早確定為通過手術(shù)中輸血引起輸血后肝炎和HBV感染的病原病毒。因此，為了篩選輸血用血液，診斷血液是否受到HBV感染是極其重要的。
這種HBV感染的診斷方法有樣本中抗HBV抗體的檢測方法、HBV抗原的檢測方法或HBV基因的檢測方法。
在這些方法中，HBV基因檢測方法包括核酸擴(kuò)增法(NAT)和DNA探針檢測法，目前臨床上廣泛采用這些方法。此外，由于NAT法應(yīng)用的普及，HBV DNA的量與HBV攜帶者病態(tài)間的關(guān)系受到關(guān)注，NAT法已普遍用于抗病毒藥物治療后的監(jiān)控中。
PCR法和TMA法等NAT法是基因片段的高靈敏度檢測方法。然而，當(dāng)從樣本中提取HBV基因組DNA時，這些方法過于復(fù)雜，在手工操作時需要的處理時間長達(dá)2小時，而且還包括多個操作步驟，等等。另外，這一操作的復(fù)雜性增加了受污染的機(jī)會，并且還增加了產(chǎn)生假陽性樣本的可能性。還有一個問題是需要熟練的技巧才能獲到穩(wěn)定的測量值。雖然近年來自動化儀器的研發(fā)采取了針對污染的措施，縮短了提取DNA的操作時間，但是仍需要十分昂貴的儀器，因此除大量樣本需要在研究機(jī)構(gòu)處理外，并沒有普及使用。另外，因?yàn)镈NA引物必須與目標(biāo)基因一致，所以需要使用多種引物，這就產(chǎn)生了每次測試成本都比免疫測定法成本高的問題。
因?yàn)檫@些與HBV基因組檢測法有關(guān)的問題，所以病毒抗原檢測方法受到關(guān)注。在HBV抗原檢測方法中，HBs抗原的檢測法已成為血液篩選的常規(guī)方法，HBe抗原的檢測法也廣泛用于HBV增殖標(biāo)記。
除了這些抗原檢測法外，已開發(fā)出HBV核心抗原(HBc抗原)的直接檢測法。Usuda等(Journal of Virological Methods，72，95-103，1998)開發(fā)出一種用具有HBV核心(HBc)抗原特異性的單克隆抗體檢測血清HBc抗原的方法，并指出該方法與上述用于病毒基因組檢測的NAT法有同樣的臨床效果。這一HBc抗原檢測系統(tǒng)因?yàn)閿U(kuò)增程序不包括在檢測過程中，所以比較耐污染。
然而，即使用上述方法，仍會留下一些問題。用于測定的樣本處理程序又復(fù)雜又耗時，如果將該方法用于篩選、監(jiān)控等用途時就會出現(xiàn)問題。為了濃縮病毒顆粒并除去血清成分，處理樣本(血清)時，包括用抗HBs多克隆抗體進(jìn)行處理(37℃，2小時)、離心(10分鐘)、除去上清液、用表面活性劑處理、用堿處理(35分鐘)、添加中和劑等多個步驟的處理過程是必需的。因?yàn)檫@些步驟要求非常熟練的操作，所以必需有一定的熟練程度才能獲得再現(xiàn)性。另外，處理時間最低大約需要3小時。而且，因?yàn)榘x心和除去上清液等步驟，所以自動化操作有困難，同時大量處理也有困難；因此就操作程序而言，上述方法不適于需要大量處理的應(yīng)用。
另外，Oshihara等開發(fā)出一種無需使用抗HBs多克隆抗體進(jìn)行處理，而是通過用堿處理、用鏈霉蛋白酶處理和添加非離子表面活性劑乙基苯基聚乙二醇P40(Nonidet P40，NP-40)和巰基乙醇測定HBc抗原的方法(日本專利特開平第8-50133號)。然而，這一方法的靈敏度低，檢出限的HBc抗原濃度相當(dāng)于2.2pg/ml的HBV-DNA濃度，該HBV-DNA的濃度估計(jì)為105～106拷貝/ml。
除了上述HBc抗原的檢測方法外，還開發(fā)出允許同時測定HBe抗原和HBc抗原的HBV核心關(guān)連抗原(HBcr抗原)的測定方法(國際公布WO 02/14871 A1)和形成HBV病毒樣顆粒的HBV p22cr抗原(HBV p22cr抗原)的測定方法(國際公布WO 04/22585 A1)。這些方法比HBc抗原檢測法更靈敏，但是與HBV基因組測定法相比，靈敏度仍不能令人滿意。
專利文件1日本專利特開平第8-50133號。
專利文件2國際公布WO 02/14871 A1。
專利文件3國際公布WO 04/22585 A1。
非專利文件1Journal of Virological Methods，72，95-103，1998。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問題免疫測定法操作簡便，成本低。但是，HBe抗原用作增殖標(biāo)記的現(xiàn)有測定法不能測定在抗HBe抗體存在時免疫復(fù)合物中存在的HBe抗原。另外，盡管HBc抗原的量與HBV DNA的量有關(guān)，但是因?yàn)樯鲜鲱A(yù)處理的復(fù)雜性和靈敏度不夠，所以HBc抗原測定法不適用于臨床研究。
另一方面，在HBV核心關(guān)連抗原測定和HBV p22cr抗原測定時，用表面活性劑和加熱(56℃～70℃)對樣本進(jìn)行預(yù)處理，以破壞抗體和病毒顆粒，然后測定HBV核心關(guān)連抗原或HBV p22cr抗原。
然而，這些方法也需要換地方(off-board)處理樣本，完全自動化的應(yīng)用頗為困難。
因此，本發(fā)明的目的是為篩選乙型肝炎、監(jiān)控慢性乙型肝炎患者的治療等，提供即使在抗HBV抗體存在時，檢測HBV核心關(guān)連抗原(HBe和HBc抗原)、HBV p22cr抗原等的預(yù)處理方法及應(yīng)用該預(yù)處理方法進(jìn)行測定的方法。換句話說，本發(fā)明的目的是提供檢測HBV抗原的系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在較短時間內(nèi)通過簡便的預(yù)處理，方便地應(yīng)用到自動化系統(tǒng)等大量處理系統(tǒng)中。
解決問題的手段作為深入研究解決上述問題的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人關(guān)注的是(a)含有HBV的樣本的處理方法，該方法僅僅通過短時間內(nèi)的簡單操作，就可使樣本中的HBV抗原轉(zhuǎn)化成適于用探針檢測的狀態(tài)，(b)檢測樣本中的HBV抗原的處理方法，該方法通過短時間內(nèi)的簡單操作，使來源于宿主的抗HBV抗原的抗體與捕捉或檢測探針競爭，同時使之失活。另外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，對于HBV抗原測定，樣本中存在的HBV抗原不僅可從病毒顆?；蛎庖邚?fù)合物釋放出來，而且樣本中存在的抗HBV抗原的人抗體還可用以下方法使之失活(c)樣本用酸化劑處理，(d)除了前述處理外，還用表面活性劑、蛋白質(zhì)變性劑和還原劑處理，(e)使用該處理方法后，可提供最適于用抗體等探針進(jìn)行免疫測定的樣本。而且，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可以提供(f)一種用處理劑處理樣本的步驟，該步驟會釋放含有來自病毒顆粒的HBV抗原樣本中存在的HBV抗原，同時還使樣本中存在的抗HBV的人抗體失活；一種通過包括處理步驟的免疫測定，檢測和定量測定HBV抗原的方法，(g)含有處理劑的HBV抗原測定試劑盒，發(fā)明人基于這些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供下述第1～3項(xiàng)1.一種含有HBV的樣本的處理方法，其特征在于用處理劑對含有HBV的樣本進(jìn)行處理，以釋放HBV抗原，并使與HBV抗原結(jié)合的抗體失活，所述處理劑包括(1)酸化劑，和(2)表面活性劑和/或蛋白質(zhì)變性劑。
2.一種HBV抗原的免疫學(xué)檢測方法，所述方法包括(1)前述第1項(xiàng)的含有HBV的樣本的處理方法的實(shí)施步驟，和(2)使用與HBV抗原結(jié)合的探針檢測HBV抗原的步驟。
3.一種診斷試劑或診斷試劑盒，所述試劑或試劑盒在用于處理樣本以檢測HBV抗原的處理劑中包括以下所述的酸化劑(1)和至少一種選自(2)的物質(zhì)(1)酸化劑；和(2)同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑、同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑和蛋白質(zhì)變性劑。
另外，含有HBV的樣本的處理方法的一個優(yōu)選的實(shí)施方案包括下述第1)項(xiàng)或第2)項(xiàng)1)一種含有HBV的樣本的處理方法，該方法用處理劑對含有HBV的樣本進(jìn)行處理，以釋放HBV抗原，并使與HBV抗原結(jié)合的抗體失活，所述處理劑包括(1)酸化劑，和(2)蛋白質(zhì)變性劑、同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑、同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑中的任一種。
2)一種含有HBV的樣本的處理方法，其特征在于用處理劑對含有HBV的樣本進(jìn)行處理，以釋放HBV抗原，并使抗HBV抗原的抗體失活，所述處理劑包括(1)酸化劑，和(2)同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑、同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑、蛋白質(zhì)變性劑、非離子表面活性劑和還原劑中任何兩種以上的組合。
發(fā)明效果本發(fā)明使HBV抗原在短時間內(nèi)容易地從病毒顆粒中釋放出來并呈適于免疫測定法的狀態(tài)成為可能，該方法用抗體等探針檢測抗原并使抗HBV抗原的抗體失活。另外，根據(jù)本發(fā)明所述方法處理含有HBV的樣本，并通過用抗體等探針檢測抗原的免疫測定法，使得在短時間內(nèi)方便地檢測和定量測定HBV抗原成為可能，而且靈敏度高。此外，根據(jù)本發(fā)明，通過除使用酸化劑外，還使用表面活性劑等，解決了由酸處理引起的沉淀問題，有效地破壞蛋白質(zhì)，短時間內(nèi)容易地釋放出病毒抗原，帶來了極好的提高靈敏度的效果。
附圖簡述圖1是表示樣本處理中隨酸化劑(鹽酸)濃度而異的效果圖。
符號說明-▲-HBV抗原陽性樣本(#990277)。
-△-HBV抗原陽性樣本(#990544)。
-◆-HBV抗原陰性樣本(正常血清)。
-□-HBV抗原陰性樣本(正常血漿)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明含有HBV抗原的樣本的處理方法中所用的樣本包括全血、血漿、血清、尿液、唾液和腦脊液、肝組織等生物學(xué)體液。
一般認(rèn)為感染性HBV顆粒是一種Dane顆粒，具有直徑為42nm的結(jié)構(gòu)。包膜脂蛋白是HBs抗原，HBc抗原形成直徑為27nm的內(nèi)部核衣殼(核心顆粒)。另外，還有形成HBV核衣殼樣顆粒的HBV p22cr抗原，一般認(rèn)為這個分子形成核心樣顆粒，其外部具有HBs抗原。
一般通過檢測HBs抗原或HBe抗原，對乙型肝炎進(jìn)行診斷。然而，測定這些抗原無法準(zhǔn)確地反映出感染的時間和感染性顆粒的量。由于這一原因，有必要測定構(gòu)成病毒顆?；虿《緲宇w粒的HBc抗原、HBV核心關(guān)連抗原和HBV p22cr抗原。
樣本中，HBc抗原和p22cr抗原形成病毒顆粒，HBe抗原等與抗HBV抗體形成免疫復(fù)合物。為了檢測這些抗原中的HBc抗原、HBe抗原和HBV p22cr抗原，有必要的是I)通過破壞HBV顆粒不僅使HBc抗原和HBV p22cr抗原從HBV顆粒中釋放出來，而且盡量多地轉(zhuǎn)化成它們的單體形式，II)使來源于宿主的抗HBV的HBc抗原和HBe抗原的抗體失活或除去，III)從與除抗HBV抗原的抗體以外的血液成分的相互作用中，釋放HBc抗原、HBe抗原和HBV p22cr抗原。雖然可通過離心和親和層析除去抗HBV抗原的抗體，但是處理步驟增加，因此看來有需要使之失活。
檢測系統(tǒng)內(nèi)含量有限的樣本中所含的HBc抗原、HBe抗原和HBVp22cr抗原以其單體狀態(tài)最大量地從HBV顆粒、抗HBV抗原的抗體和其它血液成分中釋放出來，會導(dǎo)致可與探針反應(yīng)的抗原分子數(shù)量的增加。通過短時間和簡便的樣本處理，最大限度地釋放單體狀態(tài)的抗原，提高它們與探針的反應(yīng)性十分重要。
已知的使樣本中存在的抗體活性失活的條件有堿處理、酸處理等。當(dāng)血清等用酸進(jìn)行處理時，某些來自血清的蛋白質(zhì)會發(fā)生不可逆變性，某些情況下產(chǎn)生沉淀或渾濁。因此，當(dāng)用移液管吸取用酸處理后的樣本時，常常發(fā)生堵塞等問題。另外，測定中，纏繞在變性蛋白質(zhì)上的沉淀物可吸附在載體上，或吸附在與抗體等探針連接以捕捉目標(biāo)抗原的固相上，導(dǎo)致假陽性。另外，目標(biāo)抗原與那些沉淀物纏繞在一起，使可結(jié)合到探針上的抗原數(shù)量減少，因此存在靈敏度降低的問題。
本發(fā)明通過向酸化劑中加入另一種物質(zhì)，使防止由酸處理引起的沉淀和渾濁、防止假陽性、提高靈敏度成為可能。
在此，鹽酸、硫酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸等作為酸化劑是合適的。具體地講，處理時酸化劑的濃度優(yōu)選0.05N～1N，更優(yōu)選濃度為0.25N～1N。在這種情況下，加入酸化劑的樣本在pH2.5以下進(jìn)行處理，大多數(shù)樣本則在pH2.0以下。
處理劑中，向酸化劑添加的物質(zhì)之一包括表面活性劑。已知各種各樣具有破壞蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的作用，以及發(fā)揮破壞病毒顆粒膜、使抗體變性和使不溶性蛋白質(zhì)增溶等效果的表面活性劑。然而，這種表面活性劑存在時，目標(biāo)抗原的構(gòu)象表位也遭到破壞，導(dǎo)致與捕捉抗原的抗體等探針的結(jié)合減弱，這就產(chǎn)生了靈敏度降低的嚴(yán)重問題。
另一方面，表面活性劑的變性作用常常是可逆的，通過稀釋或透析降低表面活性劑的濃度，暫時的變性結(jié)構(gòu)有時會回復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)。因此，樣本中產(chǎn)生的抗體可與測定用的探針競爭，結(jié)果，靈敏度可能降低是顯而易見的。因此，添加表面活性劑有上述這種兩面性。表面活性劑可根據(jù)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分為不同的類型。例如，有離子表面活性劑和非離子表面活性劑，離子表面活性劑進(jìn)一步包括陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性表面活性劑等。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與酸處理有關(guān)的問題例如產(chǎn)生沉淀，以及與表面活性劑處理有關(guān)的問題例如樣本中抗體的再活化，可通過聯(lián)合使用酸化劑與表面活性劑加以解決，對于HBV抗原檢測，兩者的聯(lián)用顯示出靈敏度顯著提高的效果。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)尤其在表面活性劑中使用同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑，能取得顯著的效果。
另外，酸化劑與同一分子中有12個以上碳原子的直鏈烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑，或同一分子中有12個以上碳原子的直鏈烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑聯(lián)用，能取得相當(dāng)顯著的效果。
而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)更優(yōu)選的是向含有酸化劑和表面活性劑的處理劑中添加非離子表面活性劑，例如Triton X-100等聚氧乙烯異辛基苯基醚或吐溫20(Tween 20)等聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯，添加蛋白質(zhì)變性劑例如尿素或硫脲，以及添加還原劑例如半胱氨酸、半胱胺、二甲基氨基乙硫醇、二乙基氨基乙硫醇、二異丙基氨基乙硫醇或二硫蘇糖醇。
本發(fā)明提供含有HBV的樣本的處理方法，其特征在于用處理劑對含有HBV的樣本進(jìn)行處理，以釋放HBV抗原，并使與HBV抗原結(jié)合的抗體失活，所述處理劑含有(1)酸化劑，(2)同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑和另外的蛋白質(zhì)變性劑，(3)還原劑。
作為同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑，以下分子是合適的N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、N-十四烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、N-十八烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽等。
另外，作為同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑，以下分子是合適的氯化癸基三甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨、氯化十六烷基三甲基銨、溴化癸基三甲基銨、溴化十二烷基三甲基銨、溴化十四烷基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨、氯化月桂基吡啶、氯化十四烷基吡啶、氯化十六烷基吡啶。
這種同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或陽離子表面活性劑的處理濃度優(yōu)選為0.1％ ～15％，更優(yōu)選為0.5％～10％。
作為添加到酸化劑和同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或陽離子表面活性劑中的非離子表面活性劑，Triton X-100等聚氧乙烯異辛基苯基醚、NP40等聚氧乙烯壬基苯基醚或吐溫80等聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯是合適的，處理時的濃度優(yōu)選為1％～7.5％，更優(yōu)選為1％～5％。
作為添加到酸化劑和同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或陽離子表面活性劑的蛋白質(zhì)變性劑，尿素、硫脲等是合適的，處理時的濃度優(yōu)選為0.5M以上，更優(yōu)選為介于1M和8M之間。然而，在溶解性不成問題的情況下，例如預(yù)先在處理樣本的試管加入粉狀尿素時，使用多至10M的濃度是可行的。
作為添加到酸化劑和同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或陽離子表面活性劑的還原劑，半胱氨酸、半胱胺、二甲基氨基乙硫醇、二乙基氨基乙硫醇、二異丙基氨基乙硫醇、二硫蘇糖醇等是合適的，處理時的濃度優(yōu)選為介于0.25mM和1000mM之間，更優(yōu)選為介于1.5mM和200mM之間。
如上所述，另外添加到酸化劑中的物質(zhì)包括尿素等蛋白質(zhì)變性劑。已知這類蛋白質(zhì)變性劑具有通過削弱氫鍵，部分破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象的作用，它能破壞病毒顆粒膜，并使樣本中抗目標(biāo)抗原的抗體發(fā)生變性。它還有使不溶性沉淀物增溶的效果，例如，使在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)的重組蛋白從其不溶性部分的包含體中溶解。然而在尿素等蛋白質(zhì)變性劑存在時，目標(biāo)抗原的構(gòu)象表位也會遭到破壞，導(dǎo)致與捕捉抗原的探針例如抗體的結(jié)合減弱，這就出現(xiàn)靈敏度降低的問題。
另一方面，尿素等蛋白質(zhì)變性劑的變性作用常常是可逆的，通過稀釋或透析使蛋白質(zhì)變性劑的濃度降低，暫時的變性結(jié)構(gòu)有時會回復(fù)到原來的結(jié)構(gòu)。這導(dǎo)致一種狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，來源于樣本的抗體可與測定用的探針競爭，結(jié)果，靈敏度可能降低是顯而易見的。因此添加尿素等蛋白質(zhì)變性劑會有上述這種兩面性。
本發(fā)明的發(fā)明人通過發(fā)現(xiàn)與酸處理有關(guān)的問題例如沉淀的產(chǎn)生和與蛋白質(zhì)變性劑處理有關(guān)的問題例如樣本中抗體的再活化，可通過酸處理與蛋白質(zhì)變性劑處理聯(lián)用加以解決，從而完成了本發(fā)明的另一個發(fā)明。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過加入蛋白質(zhì)變性劑之一的尿素，處理時的濃度為1M以上，經(jīng)酸處理形成的沉淀可顯著減少。對于這種蛋白質(zhì)變性劑，尿素、硫脲等是合適的。另外，處理時蛋白質(zhì)變性劑的濃度優(yōu)選為1M以上，更優(yōu)選介于1.5M和8M之間。而且，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，向含有酸化劑和蛋白質(zhì)變性劑的處理劑中加入非離子表面活性劑，例如Triton X 100等聚氧乙烯異辛基苯基醚和吐溫20等聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯，可發(fā)揮提高靈敏度的效果。另外，向含有酸化劑和蛋白質(zhì)變性劑的處理劑中加入還原劑是可行的。
綜上所述，本發(fā)明提供含有乙型肝炎病毒(HBV)的樣本的處理方法，其特征在于用處理劑對含有HBV的樣本進(jìn)行處理，以釋放HBV抗原，并使與HBV抗原結(jié)合的抗體失活，所述處理劑含有(1)酸化劑和(2)同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或陽離子表面活性劑，或者蛋白質(zhì)變性劑。
另外根據(jù)本發(fā)明，含有HBV的樣本的處理方法中處理溫度可較高，但優(yōu)選20℃～50℃，更優(yōu)選25℃～42℃。
本發(fā)明與酸化劑聯(lián)用的處理劑中，最優(yōu)選的表面活性劑是同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑，另一種處理劑是蛋白質(zhì)變性劑。向這兩種處理劑中加入非離子表面活性劑，除此之外，還添加還原劑，發(fā)現(xiàn)這樣做會提高處理效果(參見實(shí)施例4)。這表明處理劑聯(lián)用導(dǎo)致處理效果提高。作為與酸化劑聯(lián)用的處理劑，有例如同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑、同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑、蛋白質(zhì)變性劑、非離子表面活性劑、還原劑、或者陰離子表面活性劑等。通過這些處理劑中兩種以上的組合，同時用酸化劑處理，使高效處理含有HBV的樣本成為可能。
本發(fā)明HBV抗原的免疫學(xué)檢測法包括下述步驟將含有HBV的樣本與含有酸化劑和表面活性劑和/或蛋白質(zhì)變性劑的處理劑接觸(步驟1)，使用與HBV抗原結(jié)合的探針，檢測HBV抗原(步驟2)，以釋放出HBV抗原和使與HBV抗原結(jié)合的抗體失活。
在步驟2中，作為用于檢測的探針，可使用例如與HBV抗原特異性結(jié)合的抗體、對HBV抗原表現(xiàn)出高親和性的任何分子。需要一種以捕捉經(jīng)過步驟1處理的樣本中HBV核心關(guān)連抗原的探針，例如HB44、HB114或HB61等單克隆抗體。
本文所用的探針是例如通過對小鼠、大鼠、豚鼠、兔、雞、山羊、綿羊或牛等實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行免疫而獲得的多克隆抗體，從通過使自免疫個體分離的脾臟細(xì)胞等和骨髓瘤細(xì)胞融合而獲得的雜交瘤所產(chǎn)生的單克隆抗體，或者用EB病毒使免疫個體的脾臟細(xì)胞或血液中的白細(xì)胞無限增殖而獲得的細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體，感染HBV的人、黑猩猩等所產(chǎn)生的多克隆抗體，或者對HBV抗原表現(xiàn)出特異性和親和性都高的分子，該HBV抗原是通過重組技術(shù)從小鼠、人等的免疫球蛋白的cDNA或染色體DNA獲得的可變區(qū)基因片段，或者是將免疫球蛋白的部分cDNA或染色體DNA與人工制備的序列組合而構(gòu)建的可變區(qū)基因片段產(chǎn)生的。
根據(jù)本發(fā)明HBV抗原的免疫學(xué)檢測法，HBV抗原與上述單克隆抗體經(jīng)過抗原-抗體反應(yīng)形成免疫復(fù)合物。這一免疫復(fù)合物是用兩種以上抗體由夾心法免疫測定系統(tǒng)(sandwich immunoassay system)形成的?？捎眠@一免疫復(fù)合物中存在的標(biāo)記酶作為信號，通過顯色法或化學(xué)發(fā)光法，檢測HBV抗原的存在。另外，可使抗體與熒光物質(zhì)等直接結(jié)合，使熒光物質(zhì)摻入免疫復(fù)合物作為熒光信號，檢測HBV抗原。
而且，本發(fā)明提供應(yīng)用上述免疫檢測法診斷HBV感染的試劑盒。該診斷試劑盒在處理含有HBV的樣本的處理劑中包括酸化劑和蛋白質(zhì)變性劑和/或表面活性劑。優(yōu)選試劑盒中含有探針，例如與HBV抗原結(jié)合的抗體。
實(shí)施例下面將通過下述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地說明。然而，應(yīng)該理解這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1酸化劑的濃度向100μl HBV抗原陰性樣本或各HBV抗原陽性樣本(#990277、#990544)中分別加入100μl不同濃度的鹽酸水溶液，混合物在室溫下孵育10分鐘。然后將100μl混合物作為測試樣本，按下述測定方法進(jìn)行測定。
向96孔微量培養(yǎng)板(FluoroNunc Module，Maxisoap surface)各孔中，加入100μl抗HBV核心關(guān)連抗原的單克隆抗體混合物(HB44、HB114和HB61按2∶1∶1的比率混合)，濃度4μg/ml，將該板在4℃下孵育過夜。
用含有0.15M NaCl的10mM磷酸緩沖液，pH7.3，洗滌2次后，向各孔中加入350μl含有0.5％酪蛋白鈉的10mM磷酸緩沖液，pH7.1，將該板孵育2小時。除去封閉溶液后，向各孔中加入100μl含有中和劑的反應(yīng)緩沖液及用樣本處理方法得到的各測試樣本，將板在室溫下振蕩孵育2小時，用350μl含有0.05％吐溫20的10mM磷酸緩沖液(洗滌溶液)，pH7.3，洗滌6次，然后向各孔中加入100μl堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記的單克隆抗體(HB91和HB110等量混合)，將板在室溫下孵育30分鐘。用洗滌溶液洗滌6次后，加入100μl底物溶液(TROPIX，CDP-star with Emerald II)，將板孵育20分鐘。
用發(fā)光計(jì)(DIA-IATRON，Luminous CT-9000D)測量發(fā)光強(qiáng)度，結(jié)果見圖1。應(yīng)當(dāng)注意的是，圖1所示的鹽酸濃度是用樣本與處理劑混合后處理時的濃度表示的。
室溫下，在不合鹽酸的溶液中孵育10分鐘的HBV抗原陽性樣本(#990277、#990544)中，幾乎檢測不出HBV核心關(guān)連抗原的免疫反應(yīng)性。然而，當(dāng)處理時的鹽酸濃度為0.05N以上時，開始測到HBV核心關(guān)連抗原的免疫反應(yīng)性，并在0.25N～1.0N時達(dá)到峰值。另外，當(dāng)用硫酸代替鹽酸進(jìn)行研究時，得到幾乎相同的結(jié)果。
實(shí)施例2酸化劑存在時各種表面活性劑的濃度向100μl HBV抗原陰性樣本或各HBV抗原陽性樣本(#990277、#990544、#990768)中，加入100μl溶解在1.0N鹽酸水溶液的各種表面活性劑，使混合物在室溫下孵育10分鐘。將100μl處理樣本用于測試，用實(shí)施例1所述方法進(jìn)行測定。結(jié)果見表1～表5。各表中，測定值的加下劃線部分表示超出各判斷標(biāo)準(zhǔn)的情況。
根據(jù)表1～表5，3個樣本中至少1個樣本顯示反應(yīng)性大于各自樣本標(biāo)準(zhǔn)的表面活性劑，被認(rèn)定為HBV核心關(guān)連抗原的檢測效果靈敏。結(jié)果，當(dāng)不同表面活性劑與鹽酸或硫酸等酸化劑一起添加時，發(fā)現(xiàn)表面活性劑在HBV抗原陽性樣本中，可大大提高HBV核心關(guān)連抗原的免疫反應(yīng)性。觀察到有添加效果的表面活性劑是同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑和同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑。
另外，還發(fā)現(xiàn)Triton X100和吐溫20等非離子表面活性劑也有相加效果。雖然陰離子表面活性劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)和十二烷基硫酸鋰(LDS)的濃度等于或大于0.5％時，在與樣本的反應(yīng)中會產(chǎn)生渾濁，但是其效果通過添加含有中和劑的反應(yīng)緩沖液使之溶解而得到證實(shí)。具有CHAPS等類固醇骨架的表面活性劑的反應(yīng)性未顯示出提高。另外，對N-月桂?；“彼徕c、脫氧膽酸等進(jìn)行測試，但是在酸化劑存在時，溶解不充分。
酸化劑中加入同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑或同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑時，發(fā)現(xiàn)靈敏度提高。當(dāng)從這種含有酸化劑和表面活性劑的處理劑中除去酸化劑，樣本只用有效的表面活性劑處理時，靈敏度顯著下降。因此認(rèn)為靈敏度提高是以酸化劑為基礎(chǔ)的，而且酸化劑中加入表面活性劑時，靈敏度顯著提高。
TAC系列
TAB系列
表[3]APS系列
非離子表面活性劑系列
陰離子表面活性劑系列
實(shí)施例3酸化劑存在下的蛋白質(zhì)變性劑向100μl HBV抗原陰性樣本或HBV抗原陽性樣本(#990277、#990544、#990768)中，加入100μl溶解在1.0N鹽酸水溶液的蛋白質(zhì)變性劑之一的尿素，使混合物在室溫下孵育10分鐘。將100μl處理樣本用于測試，按實(shí)施例1所述方法對樣本進(jìn)行測定。求出各HBV抗原陽性樣本的免疫反應(yīng)性與HBV抗原陰性樣本的免疫反應(yīng)性的比率(HBV抗原陽性樣本的發(fā)光強(qiáng)度/HBV抗原陰性樣本的發(fā)光強(qiáng)度，用S/N比表示)，結(jié)果見表6。
結(jié)果證實(shí)，樣本在添加尿素時，與只加入含有酸化劑的處理劑的樣本相比，S/N比高出約1.5～3倍。只用酸化劑處理時，因?yàn)檠宓鞍踪|(zhì)等變性，所以在某些情況下產(chǎn)生沉淀或渾濁，這常常引起移液操作困難，且沉淀物也是假陽性的主要原因。另外，目標(biāo)抗原與這些沉淀物纏繞在一起，有可能導(dǎo)致靈敏度降低。在處理時添加超過1M尿素時，發(fā)現(xiàn)可大大減少這些沉淀物的形成，尤其發(fā)現(xiàn)在處理時添加1.5M～8M的尿素時會更有效。雖然尿素溶解高達(dá)約10M，但是隨貯存等條件的變化，仍可能產(chǎn)生沉淀。因此，處理時溶液中尿素的濃度取決于處理溶液和樣本的體積比。
S/N比
實(shí)施例4酸化劑、蛋白質(zhì)變性劑、非離子表面活性劑和同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑存在時對還原劑的研究向100μl HBV抗原陰性樣本(正常血清)或3個HBV抗原陽性樣本(#990277、#990544、#990768)的各個樣本中，加入100μl與含有1.0N鹽酸、1.5M尿素、5.0％Triton X100和1.5％N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽(C16APS)的溶液混合的二硫蘇糖醇、半胱胺鹽酸鹽或二乙基氨基乙硫醇鹽酸鹽溶液，其中二硫蘇糖醇、半胱胺鹽酸鹽或二乙基氨基乙硫醇鹽酸鹽是還原劑，使混合物在室溫下孵育10分鐘。將100μl處理樣本用于測試，按實(shí)施例1所述方法進(jìn)行測定(表7)。
還原劑的濃度分別用樣本處理時的濃度表示。即使將還原劑添加到HBV抗原陰性樣本(正常血清)中，也幾乎觀察不到樣本信號的變化，然而，在樣本處理時還原劑的濃度達(dá)5mM以上時，發(fā)現(xiàn)HBV抗原陽性樣本#990544信號增強(qiáng)，而二乙基氨基乙硫醇鹽酸鹽濃度為10mM時，則發(fā)現(xiàn)兩個樣本(#990544、#990768)信號的增強(qiáng)大于30％。
還原劑 [表7]
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供一種簡便和用戶極易掌握的用于以高靈敏度檢測或定量測定血液中HBV抗原樣本的處理方法，以及應(yīng)用該處理方法檢測或定量測定HBV的方法，可以診斷血液是否感染了HBV，迅速準(zhǔn)確地篩選出輸血用血液。本發(fā)明還提供診斷試劑盒，極大地提高了HBV抗原檢測的效率。
權(quán)利要求
1.一種含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其特征在于用處理劑對含有乙型肝炎病毒的樣本進(jìn)行處理，以釋放乙型肝炎病毒抗原，并使與乙型肝炎病毒抗原結(jié)合的抗體失活，所述處理劑包括(1)酸化劑，和(2)表面活性劑和/或蛋白質(zhì)變性劑。
2.權(quán)利要求
1的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中還向所述表面活性劑和/或蛋白質(zhì)變性劑中加入還原劑。
3.權(quán)利要求
1或2的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述表面活性劑是至少一種選自以下的表面活性劑同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑、同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑。
4.權(quán)利要求
3的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述表面活性劑的烷基碳原子數(shù)是12個以上。
5.權(quán)利要求
1的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述酸化劑是鹽酸、硫酸、乙酸、三氯乙酸或三氟乙酸。
6.權(quán)利要求
4的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述同一分子中有12個以上碳原子的烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑是N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、N-十四烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽或N-十八烷基-N，N-二甲基-3-銨基-1-丙磺酸鹽。
7.權(quán)利要求
4的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述分子中有12個以上碳原子的烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑是氯化癸基三甲基銨、氯化十二烷基三甲基銨、氯化十四烷基三甲基銨、氯化十六烷基三甲基銨、溴化癸基三甲基銨、溴化十二烷基三甲基銨、溴化十四烷基三甲基銨、溴化十六烷基三甲基銨、氯化月桂基吡啶、氯化十四烷基吡啶或氯化十六烷基吡啶。
8.權(quán)利要求
3的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述非離子表面活性劑是聚氧乙烯異辛基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚或聚氧乙烯脫水山梨醇烷基酯、Bridj35、聚氧乙烯十二烷基醚、MEGA-10或癸?；?N-甲基萄糖酰胺。
9.權(quán)利要求
1的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述蛋白質(zhì)變性劑是尿素或硫脲。
10.權(quán)利要求
2的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法，其中所述還原劑是半胱氨酸、半胱胺、二甲基氨基乙硫醇、二乙基氨基乙硫醇、二異丙基氨基乙硫醇或二硫蘇糖醇。
11.一種乙型肝炎病毒抗原的免疫學(xué)檢測方法，所述方法包括(1)權(quán)利要求
1或2的含有乙型肝炎病毒的樣本的處理方法的實(shí)施步驟；和(2)使用與乙型肝炎病毒抗原結(jié)合的探針，檢測乙型肝炎病毒抗原的步驟。
12.一種診斷試劑或診斷試劑盒，所述試劑或試劑盒在用于處理樣本以檢測乙型肝炎病毒抗原的處理劑中包括如下所述的酸化劑(1)和至少一種選自(2)的物質(zhì)(1)酸化劑；和(2)同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑、同一分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑和蛋白質(zhì)變性劑。
13.權(quán)利要求
12的診斷試劑或診斷試劑盒，其中還向所述物質(zhì)(2)中加入還原劑。
專利摘要
本發(fā)明提供血清中乙型肝炎病毒(HBV)抗原的檢測或定量方法，以及非常簡便有效地處理上述檢測和定量測定所用樣本的方法。含有乙型肝炎病毒(HBV)的樣本的處理方法的特征在于用處理劑對含有HBV的樣本進(jìn)行處理，從而釋放HBV抗原并破壞與HBV抗原結(jié)合的抗體，所述處理劑包括(1)酸化劑，(2)蛋白質(zhì)變性劑、分子中有烷基和叔胺或季銨鹽的兩性表面活性劑、或陽離子表面活性劑。
文檔編號G01N33/576GK1997895SQ200580023708
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月19日
發(fā)明者大植千春, 槇升, 木村達(dá)治 申請人:株式會社先端生命科學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan