專利名稱：對一種吞噬細胞表面蛋白的粘附功能域有特異性的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產生單克隆抗體的雜交瘤細胞系，該單克隆抗體與在吞噬細胞表面表達的特異抗原區(qū)相結合。尤其是，此單克隆抗體與CD11b糖蛋白的一個特定區(qū)域結合，并使該區(qū)域失活，從而阻止該吞噬細胞的由于粘附所產生的功能，但并不影響其它吞噬功能，人的循環(huán)系統中的外周血液主要含有紅血細胞，血小板，白血細胞。白血細胞族包括淋巴細胞，嗜中性白細胞，單核白細胞，嗜曙紅細胞和嗜堿細胞。淋巴細胞主要有T細胞和B細胞兩種亞型;淋巴細胞的其它亞型也是已知的?？茖W界對于白細胞的多種功能及其臨床相關性已產生很大興趣。
嗜中性白細胞，嗜曙紅細胞和嗜堿細胞統稱為“粒細胞”，因為它們含有細胞質的顆粒。粒細胞和單核白細胞統稱為“吞噬細胞”，因為它們能夠吞噬或消化細菌，其它微生物，及稱之為“抗原”的其它類型的外源物質。這種吞噬作用對于宿主防御多種感染及各類發(fā)炎病癥是很重要的。吞噬細胞是從骨髓中的普通先祖細胞產生的，它們在外周血液中循環(huán)，最后作為控制感染或反抗發(fā)炎反應的必需物進入組織。這種應答功能是在人類和動物(即靈長類動物和犬齒類動物)的吞噬細胞中發(fā)現的。
嗜中性白細胞在人類和動物外周血液中是最普通的白細胞。每微升正常人的全血平均含有5×103個白細胞，其中3，975個嗜中性白細胞，150個嗜曙紅細胞，25個嗜堿細胞，250個單核白細胞，1，500個淋巴細胞。
在粒細胞或單核細胞對任一類感染或發(fā)炎的免疫應答中，這些出于對“化學引誘劑因子”，例如某些細菌產物，補體成傷等的響應，首先被激活，遷移至適當的區(qū)域。這種吸引過程稱為“趨化性”。一旦位于發(fā)炎或感染的區(qū)域，粒細胞和單核白細胞就與它們的靶物緊緊結合。為此目的，這些細胞具有大量特定的細胞表面受體糖蛋白例如補體，Fc，及粘連蛋白(fibronectin)受體，用以促進這些相互作用。
在吞噬粘附中的一類最重要的細胞表面受體糖蛋白是白細胞粘附分子族，被稱為“CAM”或CD11/CD18。這種糖蛋白至少含有3種細胞表面蛋白，其各具有2個亞基，它們具有共同的β亞基CD18，分子量是94，000道爾頓，并具有不同的α亞基。此類糖蛋白的已知成員被命名為LFA-1(CD11a/CD18)，Mol(CD11b/CD18)，和P150，94(CD11c/CD18)。這些糖蛋白具有的α亞基分子量分別為180，000，155，000和150，000道爾頓。每一種這類細胞表面蛋白都已應用單克隆抗體進行了特異性鑒定。通過鑒定一種人類疾病，其中白細胞從遺傳上缺少這類抗原，人們認識到這類表面糖蛋白的生物學重要性。該疾病特征為復發(fā)的嚴重細菌感染和缺乏由于粘附所產生的功能，例如，吞噬作用，趨化性，白細胞凝集作用，以及嗜中性白細胞在塑料制品上的擴散作用。
Mol是一種細胞表面糖蛋白，出現于粒細胞，單核吞噬細胞和表面無標志細胞(Todd，R.F.Ⅲ，Nadler，L.M.，&Schlossman，S.F.，Antigensonhumanmonocytes，JournalofImmunology，1261435-1442，1981)。人當中的這種分子含有兩個非共價連接的蛋白質，分子量分別為155，000和94，000道爾頓(Todd，R.F.Ⅲ，VanAgthoven，A.，Schlossman，S.F.，andTerhorst，D.，StructureanalysisofdifferentiationantigensMo1andMo2onhumanmonocytes，Hybridoma1329-337，1982)。已證明這個復合物能將細胞粘附到多種表面，包括其它的粒細胞，內皮細胞及惰性底物。這些分子的遺傳缺乏，將由于粒細胞不能介異抗微生物炎癥應答而引起復發(fā)細菌感染。缺乏這些分子的病人表現出白細胞數目升高(稱之為“白細胞增多”)，及吞噬細胞活力出現功能性缺陷，這些特征是在體外測量對底物凝集粘附，趨向性，和調理粒子吞噬作用的降低或消失而得到證實的?？扇苄园l(fā)炎介質對于粒細胞和單核細胞的激活作用增加了這些分子的表達(Todd，R.F.Ⅲ，Arnaout，M.A.，Rosin.R.E.，Crowley，C.A.，Peters，W，A.，and Babior，B.M.，The subcellular localization of Mol(Mol alpha;formerly gP110)，a surface of glycoprotein asso ciated with neutrophil adhesion，J.Clin，Invest.，741280-1290，1984;Arnaout，M.A.，Hakim.R.M.Todd，R.F.，Dana，N.and Colten，H.R.Increased expression of an adhes sion-promotion surface glycoprotein in the granulocytopenia of hemodialysis.New Egnl.J.Med.，312457-462，1985)。抗Mo1糖蛋白的單克隆抗體能在體外有效地阻止嗜中性白細胞的凝集作用和吞噬作用。
Mo1糖蛋白特別令人感興趣，因為這個特殊的分子結構能結合一稱之為“ic3b”的成份，其為補體的第三成份的一個片段(Arnaout，M.A.，Todd，R.F.Ⅲ，DanaN.，Melamed，J.，Schlossman，S.F.，andColten，H.R.InhibitionofPhagocytosisofcomplementC3orIgG-coatedParticlesandofic3bbindingbymonoclonalantibodiestoamonocyte-granulocytemembraneglycoprotein(Mo1)，J.Clin.Invest.，72171-179，1983)，此外，Mo1糖蛋白在所有由于粘附所產生的吞噬細胞功能中是極其重要的。已證明不同的單克隆抗體能夠阻礙Mo1糖蛋白起作用。
從本發(fā)明例舉的新雜交細胞系中得到的單克隆抗體能抑制嗜中性白細胞的由于粘附所產生的功能，但不與補體第三組份的ic3b片段結合。此單克隆抗體用“MY904”來表示。它專門與嗜中性白細胞結合，即結合于CD11b/CD吞噬細胞表面蛋白質的抗原區(qū)，而此表面蛋白特異性地參與粒細胞粘附。吞噬細胞加進MY904單克隆抗體后會抑制吞噬細胞的由于粘附所產生的功能，但并不抑制CD11b/CD18分子的其它功能，例如與補體成份ic3b結合;也不抑制其它類型的嗜中性白細胞或單核細胞的功能，例如Fc受體激活，用趨化性肽段或佛波醇二酯激活呼吸釋放，及其它功能。
此種特異的單克隆抗體得到廣泛應用。MY904單克隆抗體結合嗜中性白細胞后可特異性地阻止嗜中性白細胞遷移至感染或發(fā)炎的區(qū)域。這種與嗜中性白細胞的結合可抑制已經位于發(fā)炎或感染區(qū)域的激活的嗜中性白細胞的粘附和擴散，然后阻斷嗜中性白細胞釋放毒素物質。單克隆抗體MY904可以用合適的標志物標記，以對CD11b/CD18分子進行免疫檢測，或與適當底物相結合，用熒光激活細胞分類方法或磁珠分離方法排除結合細胞。MY904單克隆抗體阻止某些吞噬細胞功能的能力，對深入研究吞噬細胞功能，尤其是當有過量的或有害的吞噬細胞功能存在于臨床病癥時特別有用。此外，此單克隆抗體在CD11b/CD18表面表達的定量中極為有用，因此可用來診斷這里提到的Mo1缺乏癥。
簡而言之，本文將敘述一種雜交細胞系，其產生一種對Mo1抗原的由于粘附所產生的區(qū)域有特異性的單克隆抗體，該抗原表達于人類和動物吞噬細胞表面。該單克隆抗體對參與與嗜中性白細胞和單核細胞粘附的那部分CD11b/CD18吞噬細胞表面蛋白質是特異的，因此，該單克隆抗體阻斷由于粘附所產生的吞噬細胞功能，例如對于發(fā)炎或感染區(qū)域的趨化性和吞噬細胞作用，而不影響某些其它的吞噬細胞作用。此單克隆抗體由一雜交細胞系產生，其中一個融合參與者是用人的慢性粒細胞白血病細胞免疫的。
本發(fā)明所述單克隆抗體稱為MY904。它是由用純化的慢性粒細胞白血病(CGL)免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞按照Kohler和的。
用于免疫的CGL細胞很獨特，是專門制備的。從患有慢性粒細胞白血病(其CGL細胞處于胚細胞狀態(tài))的一位病人身上，用靜脈穿刺方法取血進行例行診斷研究。單核細胞用Ficoll-Hypaque梯度密度沉淀方法制備，1.077g/cc。使用前將單核細胞在液氮汽化相低溫保存于10%二甲亞砜中。免疫時，將CGL細胞試樣融化，懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，將10×106細胞注射入Balb/c小鼠的腹腔和皮下。每周注射一次，共一個月。再過一個月，該小鼠用從同一患者體內得到的10×106細胞靜脈注射入尾靜脈進行加強。3天后，殺鼠取脾，用常規(guī)技術收集脾細胞。
接下來進行融合，以形成雜交瘤。沖洗脾細胞，將脾細胞與NS-1漿細胞瘤細胞系以8比1的比例在無血清培養(yǎng)基中混合。將這些細胞離心成小球狀，懸浮于0.5ml30%聚乙二醇(PEG)溶液中，8分鐘，25℃。傾析PEG，用次黃嘌呤-氨基嘌呤-胸苷培養(yǎng)基稀釋細胞，分散于微滴板中。用間接免疫熒光和流動細胞計數檢測該單克隆抗體MY904與取自病人的CGL細胞的反應性。MY904單克隆抗體是根據下述特性篩選的其與用于免疫的CGL細胞反應而不與正常人的T淋巴細胞及B淋巴細胞反應。
MY904單克隆抗體表現出下列反應性與所測10/10正常供體的純化的單核細胞，10/10正常粒細胞，10/10正常骨髓單細胞樣品反應。它不與純化的B淋巴細胞反應。在外周血液大粒淋巴細胞的一個亞型上檢測到低抗原密度，這個亞型已證明包括天然殺傷細胞。檢測供養(yǎng)于組織培養(yǎng)物中的細胞系KG-1，其對MY904抗原決定基顯示陽性。檢測HL-60和U937髓細胞系，結果顯示陰性，但如果在體外加入沸波醇二酯使之分化，則這兩個細胞系都表達MY904抗原決定基。檢測下述細胞系，結果顯示陰性K562，Daudi，Nalm-1，Nalm-6，JB，Raji，CEM，HSB及5個Epstein-Barr轉化的B淋巴細胞系(Laz-221，-388，-156，-471，-509)。正常紅細胞和血小板缺乏MY904表達，植物血凝素激活的T淋巴細胞即是如此。
曾研究過MY904抗原決定基在人類白血病細胞上的表達。該抗體與來自患有穩(wěn)定狀態(tài)的慢性粒細胞白血病(CGL)的患者的粒細胞都起反應。研究過患有處于胚細胞期的慢性粒細胞白血病的30位病人。其中9位患者的胚細胞為陽性。還研究過193例急性骨髓細胞白血病病例;其中56%患者的白細胞與MY904單克隆抗體反應。
該單克隆抗體屬于IgG1亞類，免疫沉淀物屬于糖蛋白，其含有來自表面標記的正常人類粒細胞中的分子量為155，000道爾頓和94，000道爾頓的2個亞基(Dana，N.，etal.TwofunctionaldomainsinthephagocytemembraneglycoproteinMo1identifiedwithmonoclonalantibodies.J.Immunol.1373259-3263，1986).單克隆抗體MY904的反應性分布并不抑制ic3b的結合，但卻是由于粘附所產生的過程，粒細胞在塑料表面的擴散，以及趨化性的潛在抑制劑。(Danaetal.，出處同上)。與其它抗-Mo1單克隆抗體相比較，MY904單克隆抗體的獨特性在于它只抑制由于粘附所產生的功能而不抑制ic3b的結合。所測其它抗體包括單克隆抗體44，903，94，17，OKM10，Leu15.(Danaetal.，出處同上)因此，單克隆抗體MY904可鑒定Mo1粒細胞單核細胞表面糖蛋白，進而特異地與該糖蛋白上的一抗原決定基相結合，該抗原決定基參與粒細胞/單核細胞活性的由于粘附所產生的過程。
一種能產生MY904單克隆抗體的雜交細胞系樣品于1987年8月19日貯存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(A.T.C.C.)(12301ParklawnDrive，Rockville，Maryland20852)，登錄號為A.T.C.C.No.HB9510。
體外研究表明，人類，犬齒類和亞人類靈長類白細胞具有相同的Mo1糖蛋白(Letvin，N.L.，Todd，R.F.Ⅲ，Palley.L.S.，andGriffin，J.D.靈長類和犬齒類動物粒細胞上的MY904骨髓表面抗原的保守性已被證實(Blood61408-410，1983)。此外，MY904單克隆抗體與正常狗的嗜中性白細胞的結合已表明可在用佛波醇酯PMA刺激后有效地抑制嗜中性白細胞體外凝集。(Giger，U.，Boxer，L.A.，Simpson，P.A.，Lucchesi，B.R.，andTodd，R.F.Ⅲ.DefficiencyofleukocytesurfaceglycoproteinsMo1，LFA-1andLeu-M5inadogwithrecurrentbacterialinfectionananimalmodel，Blood691622-1630，1987)。
MY904單克隆抗體的獨特性是因為其對CD11b/CD18吞噬細胞表面蛋白質粘附區(qū)域特別地有效。此外，此抗體具有完全阻止吞噬細胞功能的能力，這些功能需要關鍵的細胞表面結構的表達才能實現。
權利要求
1.一種用雜交瘤技術生產的細胞系，其產生一種單克隆抗體，此抗體特異地與吞噬細胞膜糖蛋白Mol結合，以便只抑制粒細胞和單核細胞由于粘附所產生的功能，而不與補體成份ic3b相結合。
2.權利要求1所述細胞系，其中所述產生單克隆抗體的細胞是從用人類慢性粒細胞白血病(CGL)細胞免疫的小鼠得到的。
3.權利要求1所述細胞系，其中所述產生單克隆抗體的細胞是用人類慢性粒細胞白血病(CGL)細胞免疫的小鼠的脾細胞。
4.權利要求1所述細胞系，其中所述單克隆抗體的進一步的特征為，與人類T淋巴細胞和B淋巴細胞顯示無反應性。
5.權利要求1所述細胞系，其中所述單克隆抗體表現出對來自慢性粒細胞白血病患者的外周血樣的粒細胞的反應性。
6.權利要求1所述細胞系，其中單克隆抗體表現出對正常單核細胞，正常粒細胞和正常骨髓單核細胞的反應性。
7.權利要求1所述細胞系，其中單克隆抗體對正常紅細胞和血小板無反應性。
8.用一種雜交瘤技術生產的細胞系，其具有貯存在ATCC的樣品HB9510的基本特征，其產生對CD11b/CD18吞噬細胞表面蛋白質的粘附區(qū)域有特異性的MY904抗體。
9.一種單克隆抗體，其特異地結合于CD11b/CD18吞噬細胞表面蛋白的粘附區(qū)域，而并不表現出對補體成份ic3b的結合。
10.權利要求9所述單克隆抗體，其與人類T或B淋巴細胞顯示無反應性。
11.權利要求9所述單克隆抗體，其顯示與來自慢性粒細胞白血病患者外周血樣的粒細胞的反應性。
12.權利要求9所述單克隆抗體，其顯示對正常單核細胞，正常粒細胞和正常骨髓單核細胞的反應性。
13.權利要求9所述單克隆抗體，其與正常紅細胞和血小板無反應性。
14.權利要求9所述單克隆抗體，其與人類和犬齒類動物的正常嗜中性細胞具有反應性。
15.權利要求9所述單克隆抗體，其由一具有A.T.C.C.貯存號為HB9510樣品的基本特征的雜交細胞系所產生。
16.一種單克隆抗體，其特異地結合于Mol粒細胞和單核細胞表面蛋白的抗原決定基，以抑制正常粒細胞和單核細胞由于粘附所產生的功能的激活，且不與補體成份ic3b結合。
17.權利要求16所述單克隆抗體，其與人類正常嗜中性白細胞特異地結合。
18.權利要求16所述單克隆抗體，其與正常人類嗜中性細胞的一種表面糖蛋白結合，該糖蛋白具有2個亞基，分子量分別為155，000道爾頓和94，000道爾頓。
19.一種單克隆抗體，用作實驗室體外診斷免疫檢測中的一種反應物，在此檢測中，該單克隆抗體主要結合于正常人類嗜中性白細胞表面的抗原區(qū)，該抗原區(qū)的特征是是CD11/CD18吞噬細胞表面蛋白的粘附區(qū)域，其進一步的特征是不與補體成份ic3b結合。
20.權利要求19所述單克隆抗體，其中該表面蛋白質特征為具有2個分子量分別為155，000道爾頓和94，000道爾頓的亞基，并與人類T淋巴細胞和B淋巴細胞無反應性。
21.權利要求19所述單克隆抗體，其通過雜交瘤技術從用人類慢性粒細胞白血病細胞免疫的小鼠獲得，并對正常單核細胞，正常粒細胞和正常骨髓單核細胞顯示反應性。
全文摘要
研制出一種雜交細胞系，其產生一種能與表達在吞噬細胞表面的獨特的抗原區(qū)域結合的單克隆抗體。該單克隆抗體結合于CD11b糖蛋白的特定區(qū)域，并激活該區(qū)域，以便抑制吞噬細胞的由于粘附所產生的功能，但并不影響吞噬細胞的其它功能。此單克隆抗體可在體外診斷免疫檢測中作為反應物，以檢測正常人類嗜中性白細胞表面的獨特的抗原區(qū)域。
文檔編號G01N33/577GK1030611SQ88104150
公開日1989年1月25日 申請日期1988年7月4日 優(yōu)先權日1987年7月6日
發(fā)明者斯托爾特·F·施魯斯曼, 詹姆斯·D·格里芬 申請人:達娜-法勃腫瘤研究所