專利名稱：放射性免疫分析生物樣品的方法
專利說明 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)乙型肝炎表面抗原-抗體等生物活性分子樣品的放射性免疫分析方法，它包括固相載體的包被，標(biāo)記物的制備，非特異液地制備和自檢標(biāo)準(zhǔn)的制備。
自從放射性免疫分析進(jìn)入檢測(cè)病毒和激素等生物活性分子領(lǐng)域之后，檢測(cè)手段發(fā)生了根本的變化。如乙型肝炎的檢測(cè)就得到了很大發(fā)展，靈敏度大大提高，特異性顯著增強(qiáng)。特別是固相放射性免疫分析方法，使乙型肝炎的抗原檢測(cè)靈敏度達(dá)到1ng/ml的水平。
但是，抗原-抗體的檢測(cè)長(zhǎng)期采取兩個(gè)藥盒分別進(jìn)行。如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎表面抗體(HBsAb)的檢測(cè)采取兩個(gè)藥盒進(jìn)行(如C.M.Ling等在J.Immanol，109，834(1972)上公開的)。檢測(cè)HBsAg，采用固相載體上包被HBsAb，標(biāo)記物為125I-HBsAb的藥盒;相反，檢測(cè)HBsAb，采用固相載體上包被HBsAg，標(biāo)記物為125I-HBsAg的藥盒。因此，兩種指標(biāo)的檢測(cè)不能一次完成。要檢測(cè)一個(gè)人的這兩種指標(biāo)，得重復(fù)操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，血清用量多，很不經(jīng)濟(jì)。
因?yàn)椋倚透窝妆砻婵乖瓨?biāo)志乙型肝炎病毒感染，乙型肝炎表面抗體標(biāo)志患者克服了乙型肝炎病毒感染，獲得了免疫力。所以兩種指標(biāo)各表示不同的臨床意義，不論在流行病普查中，還是在臨床檢驗(yàn)上，兩種指標(biāo)都需要進(jìn)行測(cè)定。因此后來發(fā)展為將兩種藥盒的組分組裝在一個(gè)藥盒內(nèi)，參閱美國(guó)專利3867517和4012494。這樣，對(duì)一個(gè)人的兩種指標(biāo)的測(cè)定，仍需要操作兩次。與過去相比，操作次數(shù)、時(shí)間和血清用量沒有改善，唯一的進(jìn)步是兩次操作可以同時(shí)開始。
還有一種方法，如美國(guó)專利3826619所公開的，可以一次把兩種指標(biāo)測(cè)出。它是把兩種不同的包被物HBsAg和HBsAb分別包被在兩個(gè)相匹配的管子和插頭上。但是這種固相載體，制造加工和包被都有許多困難。
本發(fā)明的目的在于提供一種將抗原和抗體包被在一個(gè)固相載體上來實(shí)現(xiàn)通過一次檢測(cè)，同時(shí)分析出抗原和抗體(雙測(cè))，如HBsAg和HBsAb兩個(gè)指標(biāo)的新方法。
實(shí)現(xiàn)上述目的的方案是在固相載體上包被有抗原和抗體，讓固相載體與標(biāo)本反應(yīng)，然后檢測(cè)固相載體與放射性標(biāo)記物結(jié)合的程度，根據(jù)固相載體上的放射性強(qiáng)度大小，參照雙陰性基準(zhǔn)值。判定標(biāo)本是抗原陽性，或是抗體陽性，或是兩者均為陰性三種情況。
現(xiàn)在以同時(shí)檢測(cè)HBsAg和HBsAg兩個(gè)指標(biāo)為例，將本發(fā)明的內(nèi)容詳細(xì)描述于下 固相載體上包被有HBsAg和HBsAb。這種固相載體與標(biāo)本反應(yīng)，若標(biāo)本上有HBsAg，則固相載體與標(biāo)記物125I-HBsAb結(jié)合能力增強(qiáng)，固相載體上的放射性強(qiáng)度大。若標(biāo)本中有HBsAb，則固相載體與標(biāo)記物125I-HBsAg結(jié)合能力減弱，固相載體上的放射性強(qiáng)度小。若標(biāo)本為正常，即沒有HBsAg和HBsAb，則固相載體上放射性強(qiáng)度中等水平。所以，只要根據(jù)固相載體上的放射性強(qiáng)度的大小，就可以判別出標(biāo)本是HBsAg陽性，或HBsAb陽性或者兩者均為陰性三種情況，達(dá)到區(qū)別三種人的目的。
本方法還可以將標(biāo)記物125I-HBsAb換成125I-HBsAg。這樣，固相載體上放射性大的是HBsAb陽性，而放射性小的是HBsAg陽性，放射性中等的仍是HBsAg和HBsAb均為陰性。
在放射免疫分析生物樣品中，制備雙測(cè)藥盒，同時(shí)檢測(cè)抗原和抗體具有臨床意義，特別對(duì)同時(shí)檢測(cè)HBsAg和HBsAb更有臨床意義。對(duì)于地處乙型肝炎高發(fā)區(qū)的我國(guó)，成年人約不80%的人感染過乙型肝炎病毒(HBV)，其中90%的人自然轉(zhuǎn)陰，少數(shù)(約10%)成為HBV攜帶者。在流行病調(diào)查中，迫切希望把乙型肝炎的傳染源(HBsAg陽性)，未感染者(HBsAg陰性、HBsAb陰性)和感染過而獲得免疫力者(HBsAb陽性)，三種人區(qū)別開來。而HBsAg和HBsAb是區(qū)別三種人的重要標(biāo)志物。
在感染普遍存在的情況下，人們都希望知道自身的HBsAb存在情況，更多的人想獲得這種免疫力-HBsAb。
部分乙型肝炎患者希望了解自己的予后情況。
乙型肝炎藥物的篩選研究，要檢測(cè)HBsAg和HBsAb這兩種指標(biāo)，觀察藥物的治療效果。
對(duì)許多HBV攜帶者追蹤隨訪，需要觀察HBsAg和HBsAb的消長(zhǎng)情況。
這些工作都需要頻繁檢測(cè)這兩種指標(biāo)，本發(fā)明正是為此應(yīng)運(yùn)而生。
根據(jù)本發(fā)明提供的方法，還可以制成甲型肝炎雙檢測(cè)藥盒，乙型肝炎E抗原-抗體雙檢測(cè)藥盒，D型肝炎雙檢測(cè)藥盒，胰島素和抗胰島素雙測(cè)定藥盒。及凡由病毒引起，康復(fù)后產(chǎn)生抗體的各病毒的雙檢測(cè)藥盒。
實(shí)施例1.HBsAg和HBsAb的雙測(cè) 1.雙測(cè)定藥盒的制備 a.固相塑料小球的包被首先將固相載體-塑料小球經(jīng)予處理，在磷酸緩沖液配制的包被液中，包被上HBsAg和HBsAb。包被過的塑料小球用封閉液封閉空位。然后將小球保存在磷酸緩沖液中，或者濕態(tài)保存在4℃，備組裝藥盒用; b.標(biāo)記物125I-HBsAb的制備標(biāo)記用抗體為高純制品，標(biāo)記方法為氯胺丁法。標(biāo)記混合物的純化用葡聚糖凝膠G50(Sephadex-G50)柱分離。純分后加入保護(hù)劑和防腐劑。然后分裝，凍干，密封，貯存?zhèn)浣M裝藥盒用; c.非特異液的制備為求塑料小球?qū)?biāo)記物125I-HBsAb的非特異吸附而設(shè)，即阻斷塑料小球上的HBsAg與125I-HBsAb結(jié)合。
正常人血清加適量阻斷劑。正好阻止正常的特異結(jié)合。
d.雙陰性液的制備為求塑料小球的雙陰性基準(zhǔn)而設(shè)。用不含HBsAg和HBsAb的正常人血清配制而成。
e.藥盒自檢標(biāo)準(zhǔn)的制備為用戶檢驗(yàn)藥盒質(zhì)量而設(shè)，其中有HBsAg陽性對(duì)照，HBsAb陽性對(duì)照。均系病人的血清制成，即HBsAg陽性病人和HBsAb陽性病人血清配制而成，并含有防腐劑和保護(hù)劑。
2.實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)在圓底玻璃試管中進(jìn)行，檢測(cè)中溫育采用水浴。
取φ10×80的圓底玻璃試管若干支，設(shè)置3管非特異管，3管雙陰性管，2管HBsAg陽性對(duì)照管，2管HBsAb陽性對(duì)照管，其余的為標(biāo)本管。
具體操作步驟 a.加樣在3管非特異管中各加200μl非特異液，在3管雙陰性管中各加100μl非特異液和100μl雙陰性液，在2管HBsAg陽性對(duì)照管中各進(jìn)100μl雙陰性液和100μlHBsAg陽性對(duì)照液，在2管HBsAb陽性對(duì)照管中各加100μl雙陰性液和100μlHBsAb陽性對(duì)照油，在各標(biāo)本管中加100μl雙陰性液和100μl標(biāo)本。加畢后振蕩2～3分鐘; b.在每個(gè)試管中各加1粒包被的塑料小球，加后振蕩3分鐘; c.第一次溫育在45℃水溶中進(jìn)行2小時(shí); d.第一次洗滌吸出反應(yīng)殘液后洗4次，每次用～1ml生理鹽水洗滌。對(duì)標(biāo)本管特別要求，在吸出反應(yīng)殘液后，要立即洗一次，然后才能取下一個(gè)標(biāo)本管殘液，總洗滌也是每管四次。
e.在每個(gè)試管中各加標(biāo)記物200μl，加后振蕩3分鐘; f.第二次溫育在45℃水浴中進(jìn)行1～2小時(shí); g.第二次洗滌吸出標(biāo)記物后洗4次，每次用1ml生理鹽水; h.擦球?qū)⑾礈焱戤叺乃芰闲∏?，?～5粒倒在多層吸水紙折成的折縫中擦干，即可裝入測(cè)量管測(cè)量放射性計(jì)數(shù)。
3.結(jié)果判定 設(shè)三個(gè)非特異管的平均每分鐘的計(jì)數(shù)為b，3個(gè)雙陰性管的平均每分鐘計(jì)數(shù)為N，陽性對(duì)照管的平均每分鐘計(jì)數(shù)為P，則自檢結(jié)果從下列的表中可見雙測(cè)定法不但靈敏度遠(yuǎn)比RPHA法要高，而且能檢測(cè)出HBsAb陽性(1＃)和雙陰性(3＃)。
對(duì)HBsAg陽性對(duì)照有P-B/N-b≥1.5 對(duì)HBsAb陽性對(duì)照有P-b/N-b≤0.5 此時(shí)藥盒為正常，測(cè)定結(jié)果有效。
要求125I-放免儀的本底計(jì)數(shù)B0小于非特異計(jì)數(shù)b0。若B0和b0相當(dāng)，則要延長(zhǎng)計(jì)數(shù)時(shí)間。
標(biāo)本管的每分鐘計(jì)數(shù)視同P.則 P-b/N-b≥1.5判標(biāo)本HBsAg陽性; P-b/N-b≤0.5判標(biāo)本HBsAb陽性; 0.75＜P-b/N-b＜1.25判標(biāo)本HBsAg和HBsAb均陰性。
本方法與反向被血凝法(RPHA)作了8份樣品的比較，將比較結(jié)果列于下表
實(shí)施例2.乙型肝炎“E”抗原(HBeAg)-抗體(抗-HBe)雙測(cè)定藥盒的制備 1.標(biāo)記物 125I-抗-HB的制備從125I標(biāo)記抗-HBe而制得; 2.包被固相載體以HBeAg和抗-HBe包被固相載體; 3.雙陰性標(biāo)準(zhǔn)由HBeAg和抗-HBe均陰性的血清制備，作為藥盒測(cè)定的基準(zhǔn)值; 4.HBeg陽性對(duì)照藥盒的自檢標(biāo)準(zhǔn)由病人HBeAg陽性血清制備; 5.抗-HBe陽性對(duì)照藥盒的自檢標(biāo)準(zhǔn)由病人HBeAb陽性血清制備。
藥盒特性本藥盒一次可以檢測(cè)出HBeAg陽性，抗-HBe陽性，兩種結(jié)果，對(duì)于區(qū)別乙型肝炎患者的傳染性有重要意義。
如果病人血清中含有HBeAg，則固相表面吸收HBeAg，再與125I-抗-HBe反應(yīng)，則固相表面帶有大量的放射性，其數(shù)值顯著大于雙陰性值。相反，則固相表面不帶或很少帶放射性，其值顯著地小于雙陰性值。可以把HBeAg陽性，抗-HBe陽性的人清楚地區(qū)分開。
實(shí)施例3.胰島素及其抗體的雙測(cè)定藥盒的制備。
胰島素(INS)是調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝的激素。正常人體有固定的水平。分泌不足將發(fā)生糖尿病。但一部分患者中，同時(shí)患有自身免疫病，其血清中，INS測(cè)不到，而血清中反而存在有大量的胰島素抗體(抗-INS)。這種情況下，胰島素測(cè)定藥盒，只能報(bào)出，INS含量低下不能正確判定結(jié)果，造成誤判、誤治，給患者帶來災(zāi)難。
雙測(cè)藥盒正是在這種情況下誕生的。它可正確報(bào)出INS含量，而且可以正確報(bào)出抗-INS的含量。
藥盒各組分的制備。
1.標(biāo)記物 I-抗-INS，用125I標(biāo)記抗-INS制得。
2.固相載體的包被 固相載體表面包被INS和抗-INS。
3.基準(zhǔn)值(雙陰性液) 用不含INS和抗-DNS的正常人血清制備，本品為藥盒的測(cè)定基準(zhǔn)。
4.INS標(biāo)準(zhǔn)6瓶，分別為6個(gè)不同濃度點(diǎn)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線用。正常值可由曲線給出。
5.抗-INS標(biāo)準(zhǔn)6瓶，分別為6個(gè)不同滴度。
檢測(cè)方法當(dāng)患者血清中含有INS，則固相表面吸附大量的INS，再與125I-抗-INS反應(yīng)，則固相表面上吸附大量125I-抗-INS，放射性很大，其值遠(yuǎn)高于基準(zhǔn)值，可在INS標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出含量，判定患者是否正常。當(dāng)患者血清中含有抗-INS，則固相表面帶有很少或不帶放射性，其值顯著小于基準(zhǔn)值。這就把患有自身免疫病的患者清楚的分別出來，避免了胰島素測(cè)定藥盒的缺點(diǎn)。
權(quán)利要求
1、一種放射性免疫分析生物樣品的方法，包括固相載體的包被，標(biāo)記物的制備，非特異液的制備和自檢標(biāo)準(zhǔn)的制備，本發(fā)明的特征在于固相載體上包被有抗原和抗體，其固相載體與標(biāo)本反應(yīng)后，檢測(cè)其固相載體與放射性標(biāo)記物結(jié)合的程度，據(jù)此參照雙陰性基準(zhǔn)值，判定標(biāo)本為抗原陽性，或抗體陰性，或雙陰性三種情況，并制備有雙陰性液。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的固相載體為塑料小球。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于固相載體上包被有HBs Ag和HBsAb，其標(biāo)記物為I-HBsAb或I-HBsAg，雙陰性液由HBsAg和HBsAb均為陰性的血清制備。
4、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于固相載體上色被有HBeAg和抗-HBe，其標(biāo)記物為以I-標(biāo)記抗-HBe，其雙陰性液由HBeAg和抗-HBe均為陰性的血清制備。
5、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于固相載體上包被有INS和抗-INS，其標(biāo)記物由I標(biāo)記抗-INS制得，其雙陰性液由不含INS和抗-INS的血清制備。
全文摘要
一種檢測(cè)生物活性物質(zhì)抗原-抗體活性分子的放射性免疫分析方法。在固相載體上包被有抗原和抗體，讓固相載體與標(biāo)本反應(yīng)，然后檢測(cè)固相載體與放射性標(biāo)記物結(jié)合的程度。據(jù)此，判定標(biāo)本為抗原陽性，或抗體陽性，或雙陰性三種情況。應(yīng)用本方法可制成乙型肝炎表面抗原-抗體雙檢測(cè)藥盒，乙型肝炎E抗原-抗體雙檢測(cè)藥盒，甲型肝炎病毒-抗體雙檢測(cè)藥盒，D型肝炎病毒-抗體雙檢測(cè)藥盒，胰島素和抗胰島素雙測(cè)定藥盒。及凡由病毒引起，康復(fù)后產(chǎn)生抗體的各病癥的雙檢藥盒。
文檔編號(hào)G01N33/576GK1041041SQ8810642
公開日1990年4月4日 申請(qǐng)日期1988年9月9日 優(yōu)先權(quán)日1988年9月9日
發(fā)明者楊樹斌 申請(qǐng)人:中國(guó)原子能科學(xué)研究院