專利名稱：特異性抗hiv抗原的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及以雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體，特別是涉及產(chǎn)生一種獨特之單克隆抗體的細胞系，所說的單克隆抗體識別一組自不同地區(qū)分離的人免疫缺陷病毒(HIV)gag編碼蛋白的抗原決定基。
已經(jīng)認識到，目前大多稱為人免疫缺陷病毒(“HIV”)的Ⅲ型人T細胞白血病病毒(HTLVⅢ)是人類免疫缺陷綜合癥(即愛滋病，ADIS)的致病因子。鑒于愛滋病在美國和其它一些國家造成一定比例的流行這一慢性感染特征，而對其作了廣泛的研究并努力開發(fā)了檢測人外周血中愛滋病病毒抗原及相應抗體的可靠而穩(wěn)定的免疫診斷方法。在實際檢測中，也已反過來將單克隆抗體用于發(fā)展這類免疫檢測法。
HIV屬于還原病毒類。還原病毒攜帶一正鏈RNA并在其核心中有一特異的逆向轉(zhuǎn)錄酶，其被用于將病毒RNA轉(zhuǎn)化為DNA。與該過程相反的典型細胞轉(zhuǎn)錄過程則是將DNA轉(zhuǎn)化為RNA。
已知HIV結(jié)合于T4淋巴細胞上，因為T4淋巴細胞表面上的T4蛋白質(zhì)可作為HIV的受體或結(jié)合位點(DalgleishAG等，Nature321∶763-767(1985))。HIV還能結(jié)合并攻擊其他細胞，如單核細胞、組織巨噬細胞和腦、脊髓及外周神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞。HIV的生活史要求病毒通過性活動或輸血等途徑進入宿主病人的體內(nèi)，然后結(jié)合于單核細胞或淋巴細胞的受體上。病毒穿透細胞并脫去其被膜或蛋白衣殼，以使其病毒RNA核心暴露。逆轉(zhuǎn)錄酶使病毒RNA核心轉(zhuǎn)化為DNA，進而整合到宿主細胞基因組中。在其中大量產(chǎn)生新的病毒顆粒，直至宿主細胞膜被破壞，以向人血循環(huán)中釋放出新的病毒顆粒。
HIV系由形成封閉膜或被膜的蛋白質(zhì)及包被病毒RNA抗原的核心組成。膜上和核心材料中有被表達的抗原;核心具有大部分組成病毒的蛋白質(zhì)。雖然廣泛使用并在理論上了解了生成單克隆抗體的常規(guī)技術(shù)，但也充分認識到了生產(chǎn)特異性抗體的嘗試中所遇到的不少復雜情況和變化。涉及開發(fā)和生產(chǎn)特異性單克隆抗體的每項研究工作均會遇到各自不同的障礙而難于取得成功。任何一個特定課題能否取得成功，在很大程度上與所用抗原的性質(zhì)以及用于細胞融合和分離適宜雜交瘤細胞的技術(shù)有關(guān)。對于生產(chǎn)分泌抗HIV特異性單克隆抗體的細胞系來說，這些障礙特別明顯。HIV系由具有無數(shù)抗原決定基的被膜及表達無數(shù)抗原位點的核心蛋白所組成，由此便可很容易地了解到，骨髓瘤細胞與被免疫小鼠的脾細胞的尋常融合將產(chǎn)生多達用天文數(shù)字計數(shù)的雜交瘤細胞，且此后篩選特異性抗體的工作將更為繁復。
Ferns等人(J.Gen.Virol.，68∶1543-1551(1987-GreatBritain))研究了識別HIV分離物之病毒蛋白的單克隆抗體。制得了抗HIV之gag蛋白的單克隆抗體。用Western吸印法鑒定了一組單克隆抗體，證實由這些單克隆抗體識別的HIVgag蛋白是分子量為55，000道爾頓(p55)、24，000道爾頓(p24)、18，000道爾頓(p18)的蛋白質(zhì)，其均為核心抗原。
在Serki等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，80∶3618-3622(1983))的研究中，已測定了HIV整個基因組的核苷酸順序。這一研究表明，HIV被膜基因表達不同的糖基化蛋白，且核心蛋白不是糖基化的蛋白。Ferns等人(上述文獻)的研究則表明，HIV被膜基因的糖基化蛋白被鑒定為分子量為160，000道爾頓的gp160、分子量為120，000道爾頓的gp120和分子量為41，000道爾頓的gp41。
這期間利用單克隆抗體檢測人體是否患有愛滋病或是否與能被鑒定的病毒有過免疫學上的接觸，但這些商業(yè)上可行的診斷試驗尚未完全獲得成功。因為在疾病表現(xiàn)出癥狀之前，需要進行這期間的保溫處理，而使得對該病的診斷變得極為復雜。鑒于該病的高度感染性質(zhì)以及就目前的科學水平尚不能治療該疾病這一事實。也增加了研究活病毒及其對人類免疫系統(tǒng)之有害影響以發(fā)展成功的診斷試驗的困難。
為此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生能與病毒核心中選擇的主要蛋白結(jié)合的新的單克隆抗體的雜交瘤或雜交細胞系。該單克隆抗體可穩(wěn)定而可靠地識別某些HIV核心抗原的共同抗原決定基，故可將所說的抗體用于免疫檢測法中，以高度準確地追蹤人生理性血清樣品中的HIV病毒抗原。該單克隆抗體不與HIV被膜抗原結(jié)合。
另外，本發(fā)明描述了以雜交瘤技術(shù)制得的細胞系，該細胞系可產(chǎn)生與HIV核心抗原p55(其為gag基因編碼的前體蛋白)、核心蛋白p24及部分分解產(chǎn)物p39和p33結(jié)合的單克隆抗體。本發(fā)明的單克隆抗體不結(jié)合p18核心蛋白或任何HIV被膜抗原。單克隆抗體識別本文鑒定為“KC-57”抗原的p55、p24、p39和p33抗原上的共同抗原決定基。
本發(fā)明的細胞系是用獨特的免疫程序建立的，其中使用一組選擇的免疫原，經(jīng)一系列多點輸注免疫BALB/C小鼠并以常用的骨髓瘤細胞系與收獲的小鼠脾細胞進行融合。
寄存聲明產(chǎn)生本發(fā)明之KC-57單克隆抗體的細胞系已于1987年11月6日提交本專利申請的同時寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland20852)。該細胞系的寄存登記號為A.T.C.C.N.HB9585。
材料和方法病毒分離物由淋巴腺病毒(LAV)感染的細胞系中制備用于免疫小鼠的抗原。以分子排阻層析法由培養(yǎng)上清中分離全病毒。并用TritonX-100溶解LAV，然后過小扁豆植物凝血素親合柱吸附之，以由培養(yǎng)上清中制備病毒提取物。經(jīng)Western印跡分析顯示由甲基-α，D-吡喃甘露糖苷洗脫的抗原主要是病毒被膜蛋白(gp160/120)，另外存在某些核心抗原(p55、p24)。
雜交瘤細胞系的生產(chǎn)將分離的LAV感染的細胞系與完全弗氏佐劑乳化后用于腹腔內(nèi)免疫雄性BALB/C小鼠。然后再給小鼠腹腔內(nèi)注射三次純化的病毒(在不完全弗氏佐劑的乳懸液中)，每次間隔一周。經(jīng)這些注射后使小鼠每隔一周接受一次gp160/120病毒提取物免疫，共三次。第三次注射gp160/120后三天，切除一只小鼠的脾臟并制備脾細胞懸液。然后在使脾細胞在聚乙二醇1500存在下與骨髓瘤細胞融合。將融合的細胞鋪敷于96小井組織培養(yǎng)板上，并用HAT(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)培養(yǎng)基選擇抗體生成雜交瘤細胞(Nature256∶495-497，1975)。
細胞群落的篩選用俘獲ELISA法鑒定產(chǎn)生抗HIV核心抗原之抗體的細胞群落。將識別HIV核心抗原的人抗體吸附于96小井聚苯乙烯檢測板上。用牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點后，將去污劑破壞的LAV與檢測板一起保溫。然后洗滌平板并在檢測平板之小井內(nèi)加入各雜交瘤細胞群落的條件培養(yǎng)基。保溫后，洗滌平板，加入過氧化物酶連接的羊抗小鼠IgG+IgA+IgM并保溫。再次洗滌各小井，并加入底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。用H2SO4終止反應并測定450nm處吸光率。經(jīng)鑒定，含KC-57的陽性細胞群落之吸光率比陰性細胞群落的吸光率至少高3倍?？寺〉杰洯傊z中以擴充陽性細胞群落，然后注入姥鮫烷(pristane)刺激的BALB/C小鼠體內(nèi)，以使之產(chǎn)生含抗體的腹水液。
KC-57的特性經(jīng)Ouchterlony免疫雙擴散法測知KC-57的免疫球蛋白亞類為IgGl。完成Western吸印實驗以測定被KC-57識別的抗原的分子量。用LAV感染之細胞的溶胞產(chǎn)物作為這一分析的抗原來源?？乖幮詫φ帐俏锤腥綯細胞的溶胞產(chǎn)物。證明對照制劑與KC-57無反應活性。使用的內(nèi)部分子量標志物有血纖維蛋白原(340，000)、纖維結(jié)合素(440，000)、肌球蛋白(200，000)、β-半乳糖苷酶(116，000)、磷酸化酶B(92，500)、牛白蛋白(66，000)、卵白蛋白(43，000)、碳酸酐酶(30，000)、胰蛋白酶抑制劑(20，100)和α-乳清蛋白(14，000)。將硝化纖維素濾膜條與KC-57一起保溫后，用125I標記的羊抗小鼠抗體檢測被單克隆抗體識別的HIV抗原。KC-57可識別HIV相關(guān)核心抗原p55和p24，以及可能是p55之裂解產(chǎn)物的p39和p31。沒有檢出與p18及各HIV被膜抗原的反應活性。
用EPICS流動細胞計數(shù)裝置(Coulter公司，Healeah，F(xiàn)lorida)分析KC-57識別的HIV相關(guān)抗原在細胞表面的表達。LAV感染的細胞與KC-57一起保溫，然后與羊抗小鼠FITC結(jié)合物保溫。結(jié)果證明KC-57與活的HIV感染的細胞表面上的抗原決定基無反應活性。
使用丙酮固定的LAV感染的細胞完成脆質(zhì)HIV核心相關(guān)抗原的表達。另外，得到并以相同方式制備未感染的、HTLV-Ⅰ感染的和HTLV-Ⅱ感染的淋巴細胞。與KC-57保溫后，用羊抗小鼠FITC結(jié)合物檢測特異反應活性。結(jié)果證明KC-57與未感染的、HTLV-Ⅰ感染的或HTLV-Ⅱ感染的細胞無反應活性，而只與存在于固定的HIV感染的淋巴細胞胞質(zhì)中的核心相關(guān)抗原產(chǎn)生特異性反應。
建立一使用KC-57作俘獲抗體的抗原俘獲酶免疫檢測法(EIA)。在96小井檢測平板上將純化的KC-57制成固相并用BSA封閉。以去污劑溶解的LAV感染之淋巴細胞的培養(yǎng)物上清作為HIV抗原來源。保溫并洗滌后，加入生物素標記的人抗HIV核心抗體，再次保溫并洗滌。加入抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)過氧化物酶并繼續(xù)保溫。末次洗滌后加入TMB并保溫。加硫酸終止反應。讀出450nm處的吸光率。使用這一分析方法，生長于組織培養(yǎng)物中的9個個別的HIV分離物均獲得陽性結(jié)果。用以檢測這一反應活性的抗原是去污劑溶解的培養(yǎng)物上清。與未感染之細胞的上清未見有反應活性。下列表3中給出了分析數(shù)據(jù)。
KC-57單克隆抗體特別適用于固相免疫檢測，其中所說的單克隆抗體包被于固相表面(如微量滴定板的小井)上并在一控制的程序中與人生理體液樣品反應。檢測法可以是酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)，其中所檢測的是與樣品中HIV抗原結(jié)合的KC-57單克隆抗體。
表3KC-57HIV抗原俘獲ELISAHIV分離物分離病毒的地區(qū)結(jié)果LAV法國+BAGAL紐約城+1265D13亞特蘭大+Z34托伊爾+SDR舊金山+2153D16紐約城+121886-1Bethesda+1272D21芝加哥+
表3所示的結(jié)果表明，用KC-57單克隆抗體作俘獲相、人抗HIV抗體作檢測相的HIV抗原檢測法，鑒定上列所有病毒株結(jié)果均呈陽性反應。
表4KC-57單克隆抗體的特異性感染因子檢測數(shù)陽性數(shù)EBV20HTLVⅠ20HTLVⅡ20HSVⅠ20HSVⅡ20CMV20Chlamydia20上表數(shù)荼礱髁說苯猩鮮齙腍IV抗原檢測時KC-57抗體與被測的其他感染因子均未見有陽性反應活性。
上表證明KC-57單克隆抗體在所說的HIV抗原檢測法中用作俘獲抗體時的抗其他感染因子的反應活性。
權(quán)利要求
1.以雜交瘤技術(shù)建立的細胞系，其可產(chǎn)生識別一組有共同抗原決定基的HIV核心抗原，且基本上不識別HIV被膜抗原的KC-57單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系，其中所說的核心抗原包括P55、P24及其他分解的抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞系，其中單克隆抗體是由小鼠脾細胞制得的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細胞系，其中所說的脾細胞是經(jīng)一系列不同的免疫原免疫后制備的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的細胞系，其中所說的免疫原包括依次輸注的分離的LAV感染的細胞系、純化的HIV病毒及gp160/120。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的細胞系，其中所說的脾細胞是與小鼠骨髓瘤細胞融合的。
7.寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)且登記號為A.T.C.C.N.HB9585的雜交細胞系樣品。
8.由寄存于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)且登記號為A.T.C.C.N.HB9585的雜交瘤樣品產(chǎn)生的單克隆抗體。
9.得自以雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)之細胞系的單克隆抗體，其特征是A.將由多種病毒分離物制備的抗原注射到小鼠體內(nèi)，收獲小鼠脾細胞以與小鼠骨髓瘤細胞系融合;B.篩選融合的細胞以分離可與包括P55、P24及某些分解的核心抗原在內(nèi)的一組HIV核心抗原之KC-57抗原產(chǎn)生特異結(jié)合的單克隆抗體;以及C.KC-57抗原的同型免疫球蛋白是小鼠IgG1。
10.與一組HIV核心抗原之KC-57抗原結(jié)合但基本上不與HIV被膜抗原結(jié)合的單克隆抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的單克隆抗體，其中所說的核心抗原包括P55和P24抗原。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的單克隆抗體，其中所說的核心抗原包括P39和P33抗原。
全文摘要
提供了產(chǎn)生能與HIV核心抗原P55即gag基因編碼之前體蛋白、核心蛋白P24及部分分解產(chǎn)物P39和P33結(jié)合的單克隆抗體的雜交細胞系。本發(fā)明的單克隆抗體并不與P18核心蛋白或任何HIV被膜抗原結(jié)合。本發(fā)明的細胞系是經(jīng)特殊的免疫程序建立的，其中使用一組選擇的免疫原經(jīng)一系列多重輸注免疫BALB/C小鼠，并用一常規(guī)使用的骨髓瘤細胞系與收獲的小鼠脾細胞融合。
文檔編號G01N33/574GK1033071SQ88106729
公開日1989年5月24日 申請日期1988年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月6日
發(fā)明者肯尼斯·H·柯特里特, 大衛(wèi)·E·霍夫漢茲, 卡羅琳·蘇利萬, 加里·P·托德特 申請人:科特公司