專利名稱：用于診斷肝癌的組合物及診斷方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷肝癌的組合物體系，一種用于診斷肝癌的制劑體系及診斷方法。
肝癌是世界性高發(fā)惡性腫瘤之一，人們進行了各種研究，以期能夠盡早發(fā)現(xiàn)肝癌，盡早進行治療，提高治愈率。
目前有許多診斷肝癌的方法，如B超、CT、核磁共振、γ-照相等定位診斷方法。但這些手段不僅難以鑒別良性與惡性占位性病變，而且設備昂貴，不便于普查。另外，作為主要定性診斷手段的眾多甲胎蛋白(AFP)檢測方法不僅對原發(fā)性肝癌的檢出率較低(70%左右)，而且對肝外惡性腫瘤的肝轉移不能做出診斷。在該方法中，同樣存在設備昂貴，不便普及的缺點。
早在1913-1923年間，就有人注意到人體在發(fā)生癌變時，肝內的一些酶的活力不同于一般正常組織。近幾十年來，由于新技術的建立和發(fā)展，腫瘤酶學的研究也在不斷發(fā)展，已日益引起人們的重視〔參見PotterV.R.etal，CancerMedicine，136，1982〕。目前，以γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)作為肝癌標記物的研究很活躍。大量的基礎研究和臨床實驗都表明，原發(fā)性肝癌和轉移性肝癌患者血清中的γ-GT活性升高〔參見TsuchidaS.etal，J.Biochem.89，775，1981，JumG.etal，Clin.Chem.18，358，1972，
SelvarajP.etal，Enzyme30，21，1983及GoldbergD.M.，Crit.Rev.inClin.Lab，Sci.12(1)，1，1980〕。
組織學研究表明肝癌前期病變和肝癌組織中γ-GT顯著增高，為最能反映肝臟癌變的指標，可作為肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和肝癌細胞形成的標志(參見TsuchidaS.etal，CancerRes.39(10)，4200，1979，PttersT.J.etal，Clin.Chem.，23(11)，2034，1977〕。然而，長期以來，由于特異性不強，使γ-GT對肝癌的診斷受到限制。近年來，血清特異性γ-GT同功酶被受到高度重視，盡管自七十年代以來人們從不同角度作了不懈的努力，但由于方法的不同，其結果不相一致。
為克服上述肝癌診斷方法的不足，本發(fā)明提供了一種新的診斷肝癌的方法，該方法是基于這樣的原理肝癌特異性γ-GT同功酶比其它γ-GT同功酶對特定溫度的耐受力強，對特定量的某種激活劑的敏感性高。通過一定的實驗條件，利用這些差異，以達到用γ-GT這一肝癌標志物診斷肝癌的目的。當然，本發(fā)明的范圍不受這些理論的限制。
本發(fā)明的一個方面是提供一種新的診斷肝癌的方法，該方法包括下述步驟(a)用常規(guī)方法采集受試者的一滴血，吸入一盛血管內;
(b)將上述盛血管封口，分離出血清;
(c)將一種膜在試劑A中充分浸泡;
(d)將血清點在經試劑A浸泡的膜上;
(e)將點有血清的膜置于一容器中，封閉后將該容器恒溫一定時間;
(f)將上述容器開蓋，用滴管取少量試劑B滴于膜上;
(g)再將上述容器加蓋，恒溫一定時間后開蓋，觀察實驗結果。
本發(fā)明的另一方面是提供一種新的用于診斷肝癌的組合物體系，該組合物體系含有組合物A和組合物B。其中組合物A主要由脫氧膽酸鈉、緩沖劑、底物、復合激活劑及穩(wěn)定劑組成;組合物B主要由乙酸和固紫蘭組成。
本發(fā)明的另一方面是提供一種新的用于診斷肝癌的試劑體系，該試劑體系含有試劑A和試劑B。其中試劑A由上述組合物A及溶劑組成;試劑B由上述組合物B及溶劑組成。
本發(fā)明的新的診斷肝癌的方法具有操作簡便易行、設備簡單、成本低廉的優(yōu)點，而且本發(fā)明的方法準確率高，特異性強。另外，本發(fā)明的試劑也很容易得到，無需復雜的合成。
本發(fā)明的一個方面是提供一種新的診斷肝癌的方法，該方法包括下述步驟(a)用常規(guī)方法采集受試者的一滴血，吸入一盛血管內;
(b)將上述盛血管封口，分離出血清;
(c)將一種膜在試劑A中充分浸泡;
(d)將血清點在經試劑A浸泡的膜上;
(e)將點有血清的膜置于一容器中，封閉后將該容器恒溫一定時間;
(f)將上述容器開蓋，用滴管取少量試劑B滴于膜上;
(g)再將上述容器加蓋，恒溫一定時間后開蓋，觀察實驗結果。
在上述方法的步驟(a)中，采血的部位不限，如耳垂、指尖等部位。血樣可為靜脈、動脈血或靜脈、動脈混合血。盛血管可為小塑料管、毛細玻璃管或試管。采血的量僅需一滴或幾滴。采血的方法可為常規(guī)的采血方法，如點刺等。
在上述方法的步驟(b)中，分離血清的步驟一般在離心機上進行。離心機的轉速一般約為1000rpm，操作時間一般為2-3分鐘。但操作時間和轉速都可以改變，只要能達到分離血清的目的。當然，可以采用任何其他達到上述目的的分離方法，如靜置等。
在上述(a)、(b)的操作中，應當小心操作，以避免溶血，因為溶血會影響實驗結果的判定。
在上述方法的步驟(c)中所述的膜可為吸水性較強、質地均勻、韌性好的任何膜，如醋酸纖維素膜、硝酸纖維素膜等。也可以采用聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠等。也可以采用濾紙等材料。優(yōu)選的膜為醋酸纖維素膜。
步驟(c)中的試劑A將在下面詳細描述。
膜在試劑A中的浸泡時間沒有嚴格的限制，一般在10分鐘左右。浸泡時間要根據膜的不同而變化，只要能夠充分浸泡就可以。
因為在步驟(b)中已經將血清分離出來，所以在步驟(d)中，可直接將血清從盛血管中滴在經試劑A浸泡的膜上。這一操作可在室溫下，于空氣中進行。
在上述方法的步驟(e)中所述的容器為塑料、玻璃或金屬盒，也可為任何有機或無機材料制成的容器，其形狀不限。
步驟(e)中的恒溫操作一般通過水浴實現(xiàn)。水浴溫度一般為37-70℃，較好的是55-65℃。水浴時間為至少5分鐘。該恒溫操作也可通過其它方式實現(xiàn)，如恒溫箱、油浴等。
在上述方法的步驟(f)中所用的試劑B將在下面詳細描述。
在上述方法的步驟(g)中，恒溫操作同樣可在水浴中進行。恒溫溫度可以與上述步驟(e)中的恒溫溫度相同，也可以不同。恒溫時間為至少3分鐘。
恒溫后將膜取出，用肉眼觀察判定結果。如點血清處出現(xiàn)紫紅色斑點，即為特異性γ-GT同工酶反應陽性，如點血清處的顏色與膜背景相同，即為特異性γ-G同工酶反應陰性。
在附

圖1中，給出了典型的特異性γ-GT同工酶反應陽性和陰性的圖樣。在該圖中，同時檢測了多份血樣，其中的小點為用鉛筆所做的標記，以區(qū)別不同受試者的血清。
在上述方法的步驟(c)中所用的試劑A為組合物A的水溶液，該組合物A主要由下列組分組成脫氧膽酸鈉、緩沖劑、底物、復合激活劑和穩(wěn)定劑。其中所述的緩沖劑可為任何能夠調節(jié)溶液pH值的試劑，如三羥甲基氨基甲烷等。在本發(fā)明中，所述緩沖劑包括緩沖對，如巴比妥與巴比妥鈉、磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀等，其中，優(yōu)選的緩沖劑為三羥甲基氨基甲烷。所述的底物是指氨基酰氨基酸化合物，如甘氨酰甘氨酸、賴氨酰賴氨酸、組氨酰組氨酸等，其中，優(yōu)選甘氨酰甘氨酸。所述的復合激活劑包括選自鈉、鎂、鈣、銫鹽中的至少二種。所述鈉、鎂、鈣、銫鹽的實例有氯化鈉、硫酸鈉、醋酸鈉、磷酸鈉、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈣、氯化銫等，只要能夠在水溶液中電離出上述金屬離子的鹽都可以使用。在上述鹽中，優(yōu)選上述金屬的鹽酸鹽。所述的穩(wěn)定劑是指γ-L-谷氨?；衔?，如γ-L-谷氨酰-α-萘胺、γ-L-谷氨酰-硝基苯胺、γ-L-谷氨酰-β-萘胺等，其中，優(yōu)選γ-L-谷氨酰-α-萘胺。
可用常規(guī)的方法(如用水溶解)酰制上述組合物的制劑。
為便于貯存，還可以在試劑A中加入防腐劑，如苯甲酸。
在試劑A中，脫氧膽酸鈉的含量一般為0.5-1.8%，較佳的是0.9-1.5%。緩沖劑的含量一般為5-20%，較佳的是8-15%，最佳的是9-13%。底物的含量一般為1-10%，較佳的是3-9%，最佳的是4-6%。復合激活劑的含量一般為1.4-16.5%，較佳的是2.8-13%，最佳的是4-9.8%。穩(wěn)定劑的含量一般為0.2-3.0%，較佳的是0.3-1.5%，最佳的是0.5-1.2%。如果在試劑A中加入防腐劑，則其含量一般為0.5-2.0%。上述含量范圍均以該組分占整個溶劑的重量百分比表示。
在上述方法的步驟(f)中使用的試劑B為組合物B的水溶液，該組合物B主要由乙酸和固紫蘭B組成。
可用常規(guī)的方法(如用水溶解)將上述組合物配制成制劑。
在試劑B中，還可以加入防腐劑，如苯甲酸等。
在試劑B中，乙酸的含量一般為5-30%，較佳的是10-25%，最佳的是15-20%。固紫蘭B的含量一般為5-20%，較佳的是10-15%。
如果在試劑B中加入防腐劑，其含量一般為0.2-3%。上述含量范圍均以該組分占整個溶劑的重量百分比表示。
經實驗證明，組合物A和組合物B具有良好的穩(wěn)定性，如于室溫下避光貯存，至少三年內有效。試劑A和試劑B在室溫條件下放置15天內有效，如于4℃冰箱內貯存，至少一個月內有效。
本發(fā)明的方法不僅對原發(fā)性肝癌具有較高的檢出率，而且對轉移性肝癌也具有一定的診斷意義;不僅對肝癌和非肝癌具有較好的鑒別診斷作用，而且對AFP假陰性和低濃度的原發(fā)性肝癌也有較好的補診作用;不僅能評估原發(fā)性肝癌的療效和監(jiān)測肝外惡性肝癌的轉移，而且對早期肝癌的發(fā)現(xiàn)有較大的價值;不僅能對當地患者就近進行檢測，而且能對外地郵寄的樣品郵報結果。
實施例試劑A的配制在一個100ml的燒杯中，加入1.8g脫氧膽酸鈉、4g甘氨酰甘氨酸、3g氯化鈉、3g氯化鎂、1.5g氯化鈣、0.5g氯化銫、2g苯甲酸、0.5gr-L-谷氨酰-α-萘胺，加入蒸餾水，使其體積達到100ml。攪拌后溶解，配得試劑A。
試劑B的配制在一個100ml的燒杯中，加入30ml乙酸(98wt%)、10g固紫蘭B、2g苯甲酸，加入蒸餾水，使其體積達到100ml。攪拌后溶解，配得試劑B。
將尺寸為5×4cm的醋酸纖維素膜(市售)浸泡在試劑A中10分鐘。用常規(guī)點刺法采集受試者一滴耳垂血，盛入內徑為3mm、長為5cm的塑料小管，用火在一端加封。將小管放入離心機內，于1000rpm下離心3分鐘，在管內分離出血清。將醋酸纖維素膜從試劑A中取出，鋪放在濾紙上。將血清滴加在該膜上，然后將該膜盛入一塑料盒內。將該盒在水浴下于50℃恒溫，然后取出小盒，在其中的膜上滴加數滴試劑B。再次于58℃下水溶恒溫3分鐘。將膜取出，觀察結果。
進行了一系列的實驗，來評價本發(fā)明方法的可靠性、敏感性和特異性。
實驗1取30份不同血清，進行同次重復和非同次重復檢測，結果如表1所示。
在表1中，“+”表示特異性γ-GT同工酶反應陽性(即在膜上呈現(xiàn)紫紅色斑點)，“-”表示特異性γ-GT同工酶反應陰性(即膜的顏色與背景相同)。
實驗2對15例受試者分別采取靜脈血和毛細血管血(耳血)，其檢測結果如表2所示。
實驗結果表明，用靜脈血與用毛細血管血進行檢測，得到相同的結果。
實驗3用本方法檢測了233例原發(fā)性肝癌患者和27例轉移性肝癌患者，得到的結果列于表3。
表3表明，本發(fā)明的方法對原發(fā)性肝癌和轉移性肝癌的檢出率都很高。
實驗4對194例慢性肝病患者、116例肝外惡性腫瘤患者和28例肝內良性占位性病變患者用本發(fā)明方法進行檢測，其結果如表4所示。
表4 非肝癌病例檢測結果
<p>＊(手術例數)為經手術和/或病理診斷證實的病例數。
＊＊在肝硬化組中有12例經本法檢測為γ-GT反應陽性(當時AFP均小于25ng/ml)，半年內有4例肝臟癌變。
對表3和表4中所得結果進行統(tǒng)計學處理(X2-檢驗)，所得結果如表5所示。
由表5可見，不論與手術和/或病理診斷結果比較，還是與手術和/或病理與臨床診斷結果比較，本發(fā)明方法對原發(fā)性肝癌和轉移性肝癌的檢測結果分別與非肝癌比較均有非常顯著的差異。
實驗5共收集158例具有AFP檢測結果的確診的原發(fā)性肝癌。現(xiàn)將用本發(fā)明方法所得檢測結果與用AFP方法所得檢測結果列于表6。
表6 用本發(fā)明方法與AFP法對158例原發(fā)性肝癌的檢測結果
<p>對上述結果的統(tǒng)計學比較(X2-檢驗)表明，本發(fā)明方法與AFP對原發(fā)性肝癌的檢出率具有顯著差異(P＜0.001)。
實驗6共收集到16例癌塊直徑小于3cm的原發(fā)性小肝癌(經B超、CT或直接測量確定)，用AFP法對其中13例進行了檢測，用本發(fā)明方法對其中16例進行了檢測，所得結果如表7所示。
表7的結果表明，AFP法與本發(fā)明方法對小肝癌的檢出率分別為53.85%和81.25%。
上述實驗表明，本發(fā)明的方法具有很好的可靠性、敏感性和特異性。
(4)文件名稱頁行補正前補正后說明書12的制劑體系的試劑體系59、10同工酶同功酶11同工酶同功酶65酰制上述組合物制劑配制上述組合物試劑614溶劑的重溶液的重18配制成制劑配制成試劑最后溶劑的重量溶液的重量101、2同工酶同功酶
權利要求
1.一種用于診斷肝癌的組合物體系，該組合物體系含有組合物A和組合物B，其中組合物A主要由脫氧膽酸鈉、緩沖劑、底物、復合激活劑及穩(wěn)定劑組成，組合物B主要由乙酸、固紫蘭B組成。
2.權利要求1所述的組合物體系，其中在組合物A中所述的緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷、巴比妥與巴比妥鈉、磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀。
3.權利要求1所述的組合物體系，其中在組合物A中所述的緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷。
4.權利要求1所述的組合物體系，其中在組合物A中所述的底物為氨基酰氨基酸化合物。
5.權利要求1所述的組合物體系，其中在組合物A中所述的復活激活劑為選自鈉、鎂、鈣、銫鹽中的至少二種。
6.權利要求1所述的組合物體系，其中在組合物A中所述的復活激活劑為選自鈉、鎂、鈣、銫鹽酸鹽中的至少二種。
7.權利要求1所述的組合物體系，其中在組合物A中所述的穩(wěn)定劑選自γ-L-谷氨?；衔?。
8.權利要求1所述的組合物體系，其中在組合物A中所述的穩(wěn)定劑選自γ-L-谷氨酰-α-萘胺。
9.一種用于診斷肝癌的試劑體系，該試劑體系含有試劑A和試劑B，其中試劑A主要由脫氧膽酸鈉、緩沖劑、底物、復合激活劑、穩(wěn)定劑及溶劑組成，試劑B主要由乙酸、固紫蘭B及溶劑組成。
10.權利要求9所述的試劑體系，其中在試劑A中所述的緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷、巴比妥與巴比妥鈉、磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀與磷酸二氫鉀。
11.權利要求9所述的試劑體系，其中在試劑A中所述的緩沖劑選自三羥甲基氨基甲烷。
12.權利要求9所述的試劑體系，其中在試劑A中所述的底物為氨基酰氨基酸化合物。
13.權利要求9所述的試劑體系，其中在試劑A中所述的復合激活劑為選自鈉、鎂、鈣、銫鹽中的至少二種。
14.權利要求9所述的試劑體系，其中在試劑A中所述的復合激活劑為選自鈉、鎂、鈣、銫鹽酸鹽中的至少二種。
15.權利要求9所述的試劑體系，其中在試劑A中所述的穩(wěn)定劑選自γ-L-谷氨?；衔铩?br> 16.權利要求9所述的試劑體系，其中在試劑A中所述的穩(wěn)定劑選自γ-L-谷氨酰-α-萘胺。
17.權利要求9所述的試劑體系，其中所述的溶劑為水。
18.權利要求9所述的試劑體系，在其中所述的試劑A中，脫氧膽酸鈉的含量為0.5-1.8wt%，緩沖劑的含量為5-20wt%，底物的含量為1-10wt%，復合激活劑的含量為1.4-16.5wt%，穩(wěn)定劑的含量為0.2-3.0wt%。
19.權利要求9所述的試劑體系，在其中所述的試劑B中，乙酸的含量為5-30wt%，固紫蘭B的含量為5-20wt%。
20.權利要求9所述的試劑體系，在其中所述的試劑A中，脫氧膽酸鈉的含量為0.9-1.5wt%，緩沖劑的含量為9-13wt%，底物的含量為4-6wt%，復合激活劑的含量為4-9.8wt%，穩(wěn)定劑的含量為0.5-1.2wt%。
21.權利要求9所述的試劑體系，在其中所述的試劑B中，乙酸的含量為15-20wt%，固紫蘭B的含量為10-15wt%。
22.權利要求9-21所述的試劑體系，其中含有防腐劑。
23.權利要求22所述的試劑體系，其中的防腐劑為苯甲酸。
24.一種診斷肝癌的方法，該方法包括下述步驟(a)用常規(guī)方法采集受試者的一滴血，吸入一盛血管內;(b)將上述盛血管封口，分離出血清;(c)將一種膜在權利要求9-23中所述的試劑體系的試劑A中充分浸泡;(d)將血清點在經試劑A浸泡的膜上;(e)將點有血清的膜置于一容器中，封閉后將該容器恒溫一定時間;(f)將上述容器開蓋，用滴管取少量權利要求9-23中所述的試劑B滴于膜上;(g)再將上述容器加蓋，恒溫一定時間后開蓋，觀察實驗結果。
25.權利要求24所述的診斷方法，其中所用的膜為醋酸纖維素膜。
26.權利要求24所述的診斷方法，其中的步驟(e)中的恒溫操作是在55-65℃下進行的，恒溫時間為至少5分鐘。
27.權利要求24所述的診斷方法，其中的步驟(g)中的恒溫操作是在45-65℃下進行的，恒溫時間為至少3分鐘。
全文摘要
一種新的診斷肝癌的方法，包括步驟(a)采集受試者的一滴血，吸入一盛血管內；(b)將盛血管封口，分離出血清；(c)將一種膜在試劑A中充分浸泡；(d)將血清點在上述膜上；(e)將膜置于一容器中，封閉后恒溫一定時間；(f)開蓋，取少量試劑B滴于膜上；(g)加蓋，恒溫一定時間后開蓋，觀察實驗結果。本發(fā)明還涉及一種含有組合物A和B的用于診斷肝癌的組合物體系，其中組合物A主要由脫氧膽酸鈉、緩沖劑、底物、復合激活劑及穩(wěn)定劑組成；組合物B主要由乙酸和固紫蘭B組成。
文檔編號G01N33/50GK1043392SQ8810847
公開日1990年6月27日 申請日期1988年12月10日 優(yōu)先權日1988年12月10日
發(fā)明者王映強 申請人:中國人民解放軍獸醫(yī)大學