專利名稱：農(nóng)作物抗病蛋白質(zhì)的檢出法的制作方法
據(jù)國際有關(guān)部門統(tǒng)計(jì)，因病害全世界每年損失的農(nóng)作物為總量的10%[1]，即每年約損失500億美元。這個(gè)巨大的損失還是在化費(fèi)了巨大的人力、物力的防治基礎(chǔ)上。病害不僅使農(nóng)作物減產(chǎn)，還常使農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降且防礙了國際上農(nóng)產(chǎn)品的貿(mào)易及帶來檢疫上的麻煩。目前，防治農(nóng)作物病害的最好方法之一就是利用基因工程技術(shù)培育出有良好性狀的抗病新品種。要實(shí)現(xiàn)這基因工程的前提之一就是檢出、分離抗病基因。如過果檢出了抗病蛋白質(zhì)就可以用常規(guī)方法從蛋白質(zhì)中檢出相應(yīng)的抗病基因。不僅如此，抗病蛋白質(zhì)的檢出還將大大促進(jìn)抗病分子生物學(xué)和抗病機(jī)理研究的發(fā)展。
雖經(jīng)人們多年來多方的努力，農(nóng)作物抗病蛋白質(zhì)或抗病基因至今尚未檢出成功。這個(gè)原因有方法學(xué)上的問題也有對抗病基因及抗病蛋白質(zhì)的看法不正確?，F(xiàn)就方法學(xué)上的問題加以述評。綜合起來，人們提出的或應(yīng)用于檢出抗病基因或抗病蛋白質(zhì)的方法大致有以下數(shù)種(a)克隆戰(zhàn)略。即把抗病品種的基因全部克隆，然后分批逐次轉(zhuǎn)化感病品種，根據(jù)轉(zhuǎn)化后代的表型求出抗病基因在哪一批中。已知半倍體植物的平均基因組約5×106Kb，按50Kb每克隆就得要106克隆才能得好的復(fù)蓋率。這么多的克隆，加上實(shí)際操作的問題，至今無成功的例子。(b)染色體步行法(Chromosome Walking)。由于農(nóng)作物基因組內(nèi)有眾多的重復(fù)順序DNA，走步又得雙向進(jìn)行;加上對抗病基因與附近的已知基因的認(rèn)識了解太少，使得本法在實(shí)際上是行不通的。(c)可動(dòng)元件標(biāo)簽法。應(yīng)用此法已從細(xì)菌和昆蟲中分離出未知基因。但對農(nóng)作物內(nèi)源可動(dòng)元件和可動(dòng)元件的形式、功能了解不多，加上測試手段的麻煩，至今未見成功的報(bào)導(dǎo)。人們對玉米的可動(dòng)元件情況了解較多，即便為此Bennetzen[2]等人對RP1基因的檢出研究就遇到了不少困難未獲成功。(C)差比法。即比較感、抗兩品種或誘導(dǎo)前后蛋白質(zhì)的差異來尋找抗病蛋白質(zhì)。農(nóng)作物受誘導(dǎo)后有許多保衛(wèi)基因的表達(dá)及與保衛(wèi)基因有關(guān)連的基因也得到表達(dá)，這個(gè)方法易把別的蛋白質(zhì)誤認(rèn)為抗病蛋白質(zhì)。又如果比較感、抗兩品種的蛋白質(zhì)差別來尋找抗病蛋白質(zhì)，按目前常規(guī)方法也是難以成功的。由于抗病蛋白質(zhì)與感病蛋白質(zhì)的高度相菩袁即使應(yīng)用等基因系的感、抗兩品種為材料也難以成功。Gabriel和Ellingboe[2]的工作就是一個(gè)例子。(e)激光法。此法是染色體工程加上激光技術(shù)的方法，在建立抗病附加系或置換系的基礎(chǔ)上利用激光逐步破壞載有抗病基因的染色體，再從表型求得抗病基因。此法構(gòu)思合理但費(fèi)時(shí)費(fèi)事，也未有成功的報(bào)導(dǎo)。
本發(fā)明提供了一個(gè)簡便、可行的檢出農(nóng)作物抗病蛋白質(zhì)的方法。從蛋白質(zhì)信息到基因的檢出已有常規(guī)方法可循。利用抗病或感病品種的蛋白質(zhì)提取物或部分純化的蛋白質(zhì)提取物與各不同的原生理小種(生理型或菌株)之間的特異相互作用檢出抗病蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了一個(gè)簡易的純化抗病蛋白質(zhì)的步驟。由于抗病蛋白質(zhì)或識別蛋白質(zhì)是處在細(xì)胞的膜壁上，膜壁組分一般均含有脂質(zhì)，可利用正辛醇的親脂性把膜壁的碎片從上清液中富集在正辛醇層內(nèi)，達(dá)到濃縮的目的。我們把上清液的蛋白質(zhì)收集起來，并證明它不再含有抗病蛋白質(zhì)。經(jīng)此一步純化后可使抗病蛋白質(zhì)或感病蛋白質(zhì)得到高度濃縮;這樣，抗病蛋白質(zhì)的檢出成為簡易可行。
本發(fā)明的內(nèi)容在以下的實(shí)施例具體敘述。
實(shí)施例1.
棉枯萎病抗病蛋白質(zhì)的檢出法。取50克棉花葉子加入150ml 0.5M Tris-Hcl，PH7.8的緩沖液(含1%Polyvinyl pyrolidone聚乙烯吡咯烷酮，1mM Phenyl Methyl sulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟)及2ml正辛醇。在搗碎機(jī)內(nèi)勻漿。此勻漿在4℃下25000g離心30分鐘。收集浮在離心液上的脂狀物。棄去上清液及殘?jiān)?，?jīng)分析此上清液中的蛋白質(zhì)已不含有抗病蛋白質(zhì)。在此脂狀物中加入約5ml 0.05M Tris-Hcl PH7.8-1mM苯甲基磺酰氟，放在0℃下30分鐘，時(shí)時(shí)振蕩，抽提脂狀物中的可溶物。再次離心收集上清液，此上清液中含有抗病蛋白質(zhì)(從抗病品種)或感病蛋白質(zhì)(從感病品種)。應(yīng)用等電聚焦方法可純化此抗病蛋白質(zhì)及感病蛋白質(zhì)。此抗病蛋白質(zhì)R在7μg/ml時(shí)即能抑制不親和病原菌孢子的萌發(fā)但不抑制親和病原菌孢子的萌發(fā)。感病蛋白質(zhì)S即使在40μg/ml的濃度下也不抑制孢子的萌發(fā)。蛋白質(zhì)R還有殺傷Hela細(xì)胞的能力，其活性與蓖麻毒蛋白(ricin)基本均等。
檢出抗病蛋白質(zhì)的關(guān)鍵在于把部分純化的制劑與孢子混合后，此蛋白質(zhì)R能與不親和的孢子相結(jié)合而在繼后的等電聚焦電泳圖譜上消失。但蛋白質(zhì)S與親和的孢子不相結(jié)合而仍出現(xiàn)在等電聚焦電泳圖譜上。
3072棉種為52-128(抗)DNA+江蘇1號(感)的選擇后的穩(wěn)定后代，我們也從3072中檢出蛋白質(zhì)R。
實(shí)施例2.
我們選用五個(gè)水稻品種(IR26，TN1，NG15，IR1545及DV85)和九個(gè)白葉枯病病原菌(Xanthomonas Campestris PV.Oxyzae)為試驗(yàn)材料，經(jīng)反復(fù)交叉測試證明(1)在不親和關(guān)系時(shí)(即寄主呈抗性，病原菌無毒)，各水稻中有一個(gè)蛋白質(zhì)(多肽)能與菌體相結(jié)合而在親和關(guān)系時(shí)(寄主感病，病原菌有毒)無此特異吸附作用。(2)NG15為一成株期抗性品種，即在成株期呈抗病而在幼苗期(或10葉期以下)呈感病。而我們的實(shí)驗(yàn)表明NG15中的此特異性蛋白質(zhì)僅在成株期表達(dá)出來，在幼苗期不表達(dá)。(3)經(jīng)典遺傳學(xué)證明DV85含有二個(gè)抗病基因。而我們的體外檢測也證明有二個(gè)特疫抗病蛋白質(zhì)。由于體外檢測(1)與抗病表型完全一致(無一例外)。(2)與不同生理發(fā)育時(shí)期的抗性表型一致。(3)與經(jīng)典遺傳學(xué)數(shù)據(jù)一致;因此我們認(rèn)為由此法檢出的抗病蛋白質(zhì)是抗病基因的產(chǎn)物。
實(shí)施例3應(yīng)用與實(shí)施例1及2的相同方法正辛醇純化法及樣品制劑與病原菌(或孢子)相作用的方法]檢測出小麥赤霉病(ear scab of wheat)的抗病蛋白質(zhì)和感病蛋白質(zhì)。抗病品種的制劑能抑制病原菌的生長而感病品種的無此抑制現(xiàn)象。我們所采用的抗病小麥品種為蘇麥3號及望水白，感病品種為寧麥6號。所用的菌株為F15(大豐)及F22(無錫)。
實(shí)施例4.
又應(yīng)用上述方法，檢測出棉花黃萎病(Verticillum-wilt in cotton)的抗病蛋白質(zhì)。結(jié)果與實(shí)施例3相同。
實(shí)施例1、2是不親和結(jié)合(Incompatible combination)模式，即宿主的抗病蛋白質(zhì)(抗病基因產(chǎn)物)與無毒的病原菌相結(jié)合生成不親和反應(yīng);反之生成親和反應(yīng)(即宿主感病、病原菌有毒)。實(shí)施例之3、4是屬于親和結(jié)合(compatible combination)模式，即宿主的感病蛋白質(zhì)與有毒的病原菌相結(jié)合生成親和反應(yīng);反之生成親和反應(yīng)(即宿主抗病、病原菌無毒)。因此，我們的抗病方法對農(nóng)作物兩個(gè)抗病模式均為適用。
參考文獻(xiàn)[1]James e.Seed.Sci & Technol.(1981)G679-685.Bennetzen，J.L.etal.Nature(1988)332369-370)。Gabriel，D.W.& Ellingboe，A.H.Physiol Plant Pathology(1982)20349-357.倪萬潮等小麥霉病品種特異性抗病蛋白質(zhì)的初步鑒定。
中國農(nóng)業(yè)科學(xué)(1990)，23第3期(出版中)。
權(quán)利要求
1.一種農(nóng)作物抗病品種的檢出方法，其特征在于用抗病或感病器種的蛋白質(zhì)提取物或部分純化的蛋白質(zhì)提取物制劑與各不同的病原生理小種(生理性或菌株)之間的特異性相互作用，檢出抗病蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1中的抗病或感病蛋白質(zhì)提取物或部分純化的蛋白質(zhì)提取物制劑，其特征在于用正辛醇的純化步驟，使抗病或感病品種的蛋白質(zhì)富集于正辛醇，達(dá)到檢出方法簡便可行。
全文摘要
本發(fā)明是一種農(nóng)作物抗病蛋白質(zhì)的檢出方法。用簡便有效的步驟使抗病蛋白質(zhì)富集于制劑中，并將制劑與各不同的病原生理小種(生理型或菌株)產(chǎn)生特異性的相互作用，檢出抗病蛋白質(zhì)，用常規(guī)的方法可從抗病蛋白質(zhì)檢出相應(yīng)的抗病基因。本發(fā)明可大大促進(jìn)抗病新品種的培育和分子生物學(xué)的研究。
文檔編號G01N33/50GK1054313SQ9010097
公開日1991年9月4日 申請日期1990年2月23日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月23日
發(fā)明者曾以申 申請人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所