專利名稱：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含蛋白質(zhì)A或G和一種帶標(biāo)記的植物血凝素作為主要成分的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷劑其用于醫(yī)藥領(lǐng)域診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
大家知道，稱作“類風(fēng)濕性因子”的自身抗體存在于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者(本說明書中簡寫為PA患者)血清中并能識別存在于人免疫球蛋白G(本說明書中簡寫為“IgG”)FC區(qū)中的抗原(參考文獻(xiàn)1)。近來已對RA患者血清IgG的FC區(qū)的碳水化合物鏈作了詳細(xì)分析。本發(fā)明中的一些發(fā)明人以前發(fā)現(xiàn)RA患者血清IgG的FC區(qū)的碳水化合物鏈的半乳糖含量比健康人要低許多(參考文獻(xiàn)2)。也即是說，業(yè)已發(fā)現(xiàn)健康人的血清IgG的FC區(qū)的碳水化合物鏈?zhǔn)怯筛鞣N具有微觀不均一性而其中的各部分無個(gè)體差異的碳水化合物部分組成的(參考文獻(xiàn)3)。另一方面，RA患者血清IgG的FC區(qū)的碳水化合物鏈總的來說具有的半乳糖的含量明顯降低了，但是同志愿參加的健康人一樣也是由具有微觀不均一性的而其各部分又無個(gè)體差異的各種碳水化合物鏈所組成的。具體講，已發(fā)現(xiàn)三種鏈，其含二個(gè)、一個(gè)或無半乳糖分子的每一種鏈以2∶2∶1的比例存在于自愿參加的健康人血清IgG的FC區(qū)中，而RA患者血清IgG的含兩個(gè)半乳糖分子的碳水化合物鏈的含量明顯減少了，且半乳糖缺失的碳水化合物鏈的總量增加了許多(參考文獻(xiàn)2)。這些結(jié)果告訴人們RA患者血清IgG的碳水化合物鏈?zhǔn)怯捎诮Y(jié)構(gòu)上引起的反常。這樣，如果能弄清楚其結(jié)構(gòu)上的反常，此IgG便可作為RA的標(biāo)志(參考文獻(xiàn)4)。
下述的四份參考文獻(xiàn)詳細(xì)披露了上述發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明考慮了這些參考文獻(xiàn)1)Kunkel，H.G.和Tan，E.M.(1964)自身抗體和疾病?，F(xiàn)代免疫學(xué)，第4期351頁。
2)Mizuochi，T，Taniguchi，T.，Matsuta，K.，等人(1985)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和原發(fā)骨關(guān)節(jié)炎同各種血清IgG糖基化作用類型變化之間的關(guān)系，Nature第316期，452-457頁。
3)Mizuochi，T.，等人(1982)免疫學(xué)雜志，第129期2016-2020頁。
4)Mizuochi，T。(1985)對類風(fēng)濕性因子的反應(yīng)物類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者IgG的糖鏈中的反常，臨床免疫學(xué)，第17期，977-984頁。
如上所述，大家已知道，如果能夠測定血清IgGFc區(qū)的碳水化合物中的半乳糖缺失便能對RA進(jìn)行診斷。然而，迄今為止還沒有測定半乳糖缺失的實(shí)用的診斷劑。
鑒于上述情況，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明要予解決的問題在于提供一種測定人血清中存在的IgG碳水化合物鏈中半乳糖缺失的診斷劑。
為了解決上述問題本發(fā)明的發(fā)明人已進(jìn)行了廣泛研究并發(fā)現(xiàn)在血清中加入蛋白質(zhì)A或G后再加入一種帶標(biāo)記的植物血凝素，所說目的便能達(dá)到。本發(fā)明的目的正是基于這一發(fā)現(xiàn)而實(shí)現(xiàn)的。也就是說，本發(fā)明涉及含蛋白質(zhì)A或G和一種帶標(biāo)記植物血凝素作為主要成分的診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎用診斷劑。即本發(fā)明涉及一組試劑(二種物質(zhì))，所說試劑為蛋白質(zhì)A或G和帶標(biāo)記的植物血凝素，此組試劑能用于測定半乳糖缺失。
本發(fā)明提供了用上面定義的診斷劑測定半乳糖缺失的方法，此方法包括將蛋白質(zhì)A或G同血清反應(yīng)，把所得反應(yīng)物同標(biāo)記植物血凝素反應(yīng)及進(jìn)行顯色這樣一些步驟。
下面將對本發(fā)明作較詳細(xì)的介紹。
本說明書中所用的術(shù)語“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”屬于自體免疫疾病，而其在早晨出現(xiàn)的特殊癥狀是僵硬。
本說明書中所用的術(shù)語“蛋白質(zhì)A”是從金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜中分離出來的蛋白質(zhì)，它是由分子量為42，000的單多肽所構(gòu)成的并且其內(nèi)部結(jié)構(gòu)彼此類似的若干部分所組成。
蛋白質(zhì)A有與IgG的Fc區(qū)結(jié)合的性質(zhì)。這樣便可以利用這一性質(zhì)來純化IgG，事實(shí)上這已是一公知的技術(shù)。
同蛋白質(zhì)A一樣，蛋白質(zhì)G是從金黃色葡萄球菌中分離出來的一種蛋白質(zhì)，它具有與IgG的Fc區(qū)結(jié)合的性質(zhì)，利用這一性質(zhì)來純化IgG，事實(shí)上這也是一公知技術(shù)。
其中的術(shù)語“植物血凝素”是結(jié)合碳水化合物蛋白質(zhì)的通用術(shù)語。雖然植物血凝素最初是從蓖麻種子中得到的，但是在許多動(dòng)物(包括細(xì)菌)中廣泛存在著諸種植物血凝素，所以不同來源的各種植物血凝素均可獲得。從任何源得到的任何植物血凝素都能與結(jié)構(gòu)上彼此不同形式的各種糖鏈結(jié)合以識別它們。例如，來源不同的許多植物血凝素能識別半乳糖缺失的甘露糖鏈。因此，要在本發(fā)明中使用的植物血凝素不受來源的限制，可以是任何來源的任何一種植物血凝素。而其最優(yōu)先選用的是伴刀豆球蛋白A和兵豆(LensCulinaris)凝集素。
對作探針檢測碳水化合物的植物血凝素的標(biāo)記可采用慣常的方法來進(jìn)行，即從用酶標(biāo)記法，放射性同位素法等方法中選出一種適宜的方法來進(jìn)行標(biāo)記，這樣本發(fā)明不受標(biāo)記方法的限制。用酶標(biāo)記時(shí)，既可將酶直接與植物血凝素結(jié)合也可通過諸如生物素和抗生物素蛋白一類適宜的分子與其結(jié)合。
用本發(fā)明的診斷劑測定半乳糖缺失時(shí)基本按下述步驟進(jìn)行先將蛋白質(zhì)A固定在硝化纖維素膜上，然后再加入經(jīng)緩沖液稀釋的血清，再于所得到的膜上加入生物素伴刀豆球蛋白A溶液以檢測其碳水化合物部分，再于其上加入抗生物素蛋白過氧化物酶溶液以進(jìn)行另一反應(yīng)。洗滌得到的膜后用對此過氧化物顯色的底物溶液對其進(jìn)行處理。雖然用于上述方法的診斷劑包括蛋白質(zhì)A和生物素伴刀豆球蛋白A(已標(biāo)記的植物血凝素)作為主要成分，但為方便用戶起見，根據(jù)本發(fā)明的診斷劑在測定操作過程中還可適當(dāng)?shù)嘏c其他成分混合成為一組診斷劑，這些成分的實(shí)際例子有如磷酸鹽緩沖液、封阻溶液、硝化纖維素膜、抗生物素蛋白-過氧化物酶、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、底物溶液和反應(yīng)終止劑溶液。本發(fā)明包括如上所述的那樣一組的診斷劑。
雖然大家已經(jīng)知道能用蛋白質(zhì)A或G純化IgG，也知道植物血凝素能識別碳水化合物鏈，但將蛋白質(zhì)A或G與植物血凝素混合成為診斷劑的組合物是新穎的，正如下面的實(shí)驗(yàn)例將要說明的那樣，利用這種組合物則實(shí)現(xiàn)了對RA方便而準(zhǔn)確地進(jìn)行診斷的目的，盡管截至目前為止。這一直認(rèn)為是難于作到的。


圖1把RA患者的血清IgG用伴刀豆球蛋白A染色后所得到的信號強(qiáng)度同自愿參加的健康人的強(qiáng)度進(jìn)行了比較。信號的強(qiáng)度是用飛點(diǎn)掃描器CS9000進(jìn)行測定的。
圖2把RA患者的血清IgG用血凝素LCA染色后產(chǎn)生的信號強(qiáng)度因健康人的強(qiáng)度進(jìn)行了比較，其信號強(qiáng)度是用飛點(diǎn)掃描器CS9000進(jìn)行測定的。
圖3示出了每種疾病的患者的血清中缺失半乳糖的IgG的量，水平軸上數(shù)據(jù)是用多井眼微平板進(jìn)行顯色后在405毫微米及490毫微米波長下測定的。每種疾病的病名載于實(shí)施例2中。表1列出了根據(jù)如圖3所示的結(jié)果的陽性百分率。
制備和使用例1.將市售蛋白質(zhì)A(如Sigma或Pharmacia產(chǎn)品)或蛋白質(zhì)G(如Sigma或Pharmacia)與帶標(biāo)記的植物血凝素(如過氧化物酶或生物素標(biāo)記的)(市售品，如6或SeikagakuKogyo的產(chǎn)品)混合便可得到本發(fā)明所述的診斷劑。
2.把上述各成分再與一種固定(結(jié)合)蛋白質(zhì)A的固體成分(如硝化纖維素膜或聚苯乙烯微平板)、封閉緩沖液(如磷酸鹽或含BSA(牛血清白蛋白)或明膠的三羥甲基氨基甲烷緩沖液)、一種標(biāo)記酶(如鏈球菌抗生物素蛋白-過氧化物酶)和一種酶的底物(如4-氯萘酚)即可得到根據(jù)本發(fā)明的診斷劑。
3.將固定于一固體成分表面上的蛋白質(zhì)A或G與人血漿或血清反應(yīng)以特異性地選擇IgG。用帶標(biāo)記的植物血凝素(如過氧化物酶植物血凝素)對存在于所說IgG中的碳水化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記后再利用此植物血凝素特異的識別所說碳水化合物鏈結(jié)構(gòu)的活性來檢測此IgG碳水化合物鏈中結(jié)構(gòu)的反常。此檢測是根據(jù)諸如顯色信號的強(qiáng)度來測定與IgG鏈結(jié)合的此植物血凝素的量來進(jìn)行的。具體講，因?yàn)橥ㄟ^對RA患者血清IgG碳水化合物鏈的結(jié)構(gòu)分析揭示了此碳水化合物鏈的半乳糖含量明顯降低了，所以這就篩選出了與這種缺半乳糖的IgG具有反應(yīng)性的植物血凝素。從而發(fā)現(xiàn)識別甘露糖的植物血凝素如ConA(伴刀豆球蛋白A)或兵豆(Lensculinaris)凝集素(LCA)一類植物血凝素對于缺半乳糖的IgG具有很強(qiáng)的反應(yīng)性。所以用這些植物血凝素來檢查RA患者的血清IgG。
實(shí)施例1〔樣品〕下述實(shí)驗(yàn)中用的血清取自于RA患者及健康的自愿參加者。
〔方法〕把蛋白質(zhì)A(250μg/ml)溶解在磷酸鹽緩沖溶液(50mM磷酸鹽、0.15MNaCl.PH7.4)中，將10μl此溶液滴于硝化纖維素膜(劃園點(diǎn))上，再把此膜預(yù)以干燥并用封閉緩沖液(50mM三羥甲基氨基甲烷-Hcl，0.15MNaCl，0.05%NP-40，2.5%明膠(W/V)，pH＝7.4)封閉。
把所得到的此膜(俘獲IgG的膜，下面簡稱為“IGGTM”)用于分析RA患者或健康的自愿參加者血清IgG的糖鏈。用封閉緩沖溶液稀釋RA患者或健康自愿參加者的血清，再將其加到IGGTM上以使此IgG與所說的膜結(jié)合(室溫下，60分鐘)。反應(yīng)后，對IGGTM進(jìn)行溫和輕洗，再對其洗滌5分鐘。然后此IGGTM上加入500μg/ml生物素-ConA(20μg/ml)以進(jìn)行反應(yīng)(室溫下，60分鐘)。反應(yīng)后，溫和輕洗IGGTM，再對其洗滌2次，每次5分鐘。爾后再于所得的IGGTM上加入500μl連球菌抗生物素蛋白-過氧化物酶以進(jìn)行另一反應(yīng)。反應(yīng)后，溫和輕洗所得的IGGTM，再洗滌2次，每次5分鐘。洗滌后，用TBS(20mM三羥甲基氨基甲烷-Hcl，0.5MNaCl，pH＝7.4)溫和輕洗。于此IGGTM上加入500μg/ml過氧化物酶底物溶液以引發(fā)顯色(5-10分鐘)，顯色完全后，用蒸餾水對所得的IGGTM進(jìn)行充分洗滌，干燥后用雙波長飛點(diǎn)掃描器CS9000(Shimadzu制，λ＝540毫微米)測定此IGGTM顯色信號的強(qiáng)度。
結(jié)果1.檢查RA患者組(4個(gè)人)和自愿參加的健康組(4人)每一個(gè)人血清IgG與ConA的反應(yīng)性。健康組的平均計(jì)數(shù)為7603.85，而RA患者組的平均計(jì)數(shù)為43906.22。這表明RA患者組比健康組的計(jì)數(shù)高(圖1)。
2.檢查RA患者(一組10人)和健康人(一組4人)血清IgG與LCA的反應(yīng)性。健康組的平均計(jì)數(shù)為0，而RA患者組為24501.8。這表明RA患者組的平均計(jì)數(shù)高于健康組(圖2)。
實(shí)施例2〔樣品〕下述實(shí)驗(yàn)使用如下所述的疫病患者及健康的自愿參加者的血清(樣品)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)20早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(E-RA)27血清陰性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(S-N-RA)
(RA實(shí)驗(yàn)-，玫瑰紅，8或更小)13骨關(guān)節(jié)炎(OA)18早期骨關(guān)節(jié)炎(E-OA)20系統(tǒng)紅斑狼瘡(SLE)12健康的自愿參加者87〔方法〕于微平板的每一井眼中放入100μl蛋白質(zhì)A(2.5μg/ml)并蓋上。用100μl封閉緩沖液(1%BSA(牛血清白蛋白)、50mM磷酸鹽緩沖液、0.15MNaCl，pH＝7.4)封閉，于每一井眼中加入100μl明膠緩沖液(50mM三羥甲基氨基甲烷-HCl、0.15MNaCl、0.05%NP-40、2.5%(W/V)明膠、pH＝7.4)后再于其中加入1μl樣品。然后再于每一井眼中加入100μl所說明膠緩沖液。于25℃下，把全部井眼孵育60分鐘。反應(yīng)后，用緩沖溶液(50ml三羥甲基氨基甲烷-Hcl、0.15MNaCl0.05%NP-40。pH＝7.4)洗滌每一井眼。然后再于其中加入100μl生物素-ConA溶液(0.0625μg/ml)，在25℃下進(jìn)行反應(yīng)60分鐘。
用所說洗滌緩沖液洗滌此反應(yīng)產(chǎn)物。然后再加入100μl鏈球菌抗生物素蛋白一過氧化物酶溶液。于25℃下反應(yīng)60分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)所說洗滌緩沖液洗滌后加入100μl底物溶液(3%H2O2，10μl+ABTS6mg/4ml，檸檬酸緩沖液，pH4.2)以在37℃下反應(yīng)60分鐘。
于每一井眼中加入100μl疊氮化鈉溶液以終止反應(yīng)，用雙波長分光光度計(jì)測定所得的樣品，在波長為405毫微米和490毫微米處的吸收值。
結(jié)果圖3表示(1)規(guī)定吸光度為0.14的值為截止值;當(dāng)測定的樣品的吸光度大于此截止值時(shí)，所識別的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎為RA，每種疾病的陽性百分率列于表1中。
(2)對于除RA之外的那些疾病如SLE、OA和LD來說，識別的高的陽性百分率是根據(jù)文獻(xiàn)(TatsuABE，GeneralClinic(SogoRinsho)34，1915(1985))中介紹的貫常RA實(shí)驗(yàn)(如血凝反應(yīng)法和膠乳凝固作用法)進(jìn)行的。對于這些疾病來說，采用本發(fā)明測定方法所得到的陽性百分率是很低的，但本發(fā)明的方法對于RA疾病卻有極高的選擇性。
表1疾病CUP(A405/490)百分率(%)RA0.155±0.04875(15/20)E-RA0.158±0.04853.8(14/27)S-N-RA0.092±0.0277.7(1/13)OA0.086±0.0355.6(1/18)E-OA0.057±0.0180(0/20)SLE0.09±0.0320(0/12)LIVERD.0.087±0.04617.2(5/29)對照組0.081±0.034.6(4/87)
權(quán)利要求
1.一種包含蛋白質(zhì)A或G和一帶標(biāo)記的植物血凝素作為主要成分的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷劑。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷劑，其中所說標(biāo)記血凝素是識別半乳糖缺失糖鏈的血凝素。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷劑，其中所說的識別半乳糖缺失糖鏈的標(biāo)記血凝素是伴刀豆球蛋白A。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求2的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎診斷劑，其中所說的識別半乳糖缺失糖鏈的標(biāo)記血凝素是兵豆(Lens Culinaris)凝集素。
5.一種利用權(quán)利要求1定義的診斷劑測定半乳糖缺失的方法，所說方法包括下述步驟蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G與血清反應(yīng);所得的反應(yīng)產(chǎn)物與一種標(biāo)記植物血凝素反應(yīng);使之顯色。
全文摘要
一種利用權(quán)利要求1定義的診斷劑測定半乳糖缺失的方法來診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所說方法包括下述步驟將蛋白質(zhì)A或G與血清反應(yīng)；所得產(chǎn)物與一種標(biāo)記植物血凝素反應(yīng)；使之顯色。
文檔編號G01N33/53GK1047392SQ9010372
公開日1990年11月28日 申請日期1990年5月19日 優(yōu)先權(quán)日1989年5月19日
發(fā)明者山田雄二, 楢木徹, 小出醇, 水落次男 申請人:衛(wèi)材株式會(huì)社