專利名稱：對激素及相關(guān)材料的改進的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及稱為魚促性腺素釋放激素(pGnRH)及有時稱為魚促黃體生成素釋放激素(pLHRH)之魚激素的延伸類似物。具體地說，本發(fā)明涉及在天然pGnRH氨基酸序列的C末端加上一個包括半胱氨酸或酪氨酸殘基的短氨基酸序列所形成的pGnRH的類似物，其在溶液中的構(gòu)象基本上無改變的情況下，使其多肽結(jié)合物適于生產(chǎn)抗pGnRH抗體，本發(fā)明還涉及免疫魚的方法。
商品魚養(yǎng)殖業(yè)是在世界各地迅速發(fā)展的工業(yè)。西歐、北美和南美、加拿大和東海岸都是魚類，特別是大麻哈魚主要生產(chǎn)地。例如，美國在1989年生產(chǎn)了185，000噸大麻哈魚，緊接其后的是鲇魚市場。另一方面，作為西歐大西洋大麻哈魚主要生產(chǎn)國的挪威，1989至1990年的產(chǎn)量為120，000噸。據(jù)估算，到本世紀末，世界大麻哈魚市場平均每年增長7.5%，每年營業(yè)額為20億英磅。雖然目前歐洲是海洋鳊魚和鱸魚的主要生產(chǎn)地區(qū)，且在東歐和非洲已在養(yǎng)殖鯉魚，但也設(shè)想對海洋鱸魚和大鯪鲆，以及較長時期內(nèi)對擬庸鰈魚和鱈魚的商業(yè)開發(fā)。
在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，特別需要控制魚的性成熟，以便阻止體細胞生長轉(zhuǎn)向生殖腺生長、降低魚的質(zhì)量、以及表現(xiàn)出商業(yè)上不期望的第二性征。特別是對于鮭科魚類，早熟幼鮭和未成熟幼鮭可因在幼鮭未達到產(chǎn)品大小時中止生產(chǎn)而帶來嚴重的經(jīng)濟影響，以及因為在短時期內(nèi)急于收獲幼鮭而降低其市場價值。此外，在魚由養(yǎng)殖場游走并貢獻于天然基因庫的情況下，期望抑制已養(yǎng)殖魚的繁殖力。
從邏輯上看，問題是與收獲性成熟的魚相關(guān)聯(lián)的。這些不能出售，并且總是有一定比例的有早成熟優(yōu)勢的雄性魚常在其他魚之前成熟。而從未成熟魚中分離出性成熟的魚要花費時間和經(jīng)費，一旦魚開始成熟，它們或多或少都要經(jīng)過同樣的時間和速度，從而給收獲造成困難。因此，找到一種同時控制魚成熟的方法無疑是有宜的。
例如，由于早熟，致使常常不能達到收獲魚的理想重量，即被迫在不太適宜的時期收獲，而控制成熟則將能避免錯過量適收獲時期并可使魚長到理想的大小。
迄今為止，確保不致于發(fā)生性成熟的最有效辦法是養(yǎng)殖不育魚。盡管進行了大量的實驗研究，但仍沒有就顯示兩態(tài)性的群體實現(xiàn)這一目的。
已有幾種方法用于控制魚的性成熟，如包括手術(shù)去雄、三倍體化和性控制(后兩種方法是屬遺傳學(xué)技術(shù))。過去曾嘗試了用外科方法使魚去雄，但終因它們帶來很大花費以及在進行這種程序后造成魚的損傷而放棄了。
三倍體方法是一種在魚個體內(nèi)造成三組染色體存在的方法，用以誘導(dǎo)三倍體雄性和雌性魚的不育。然而存在幾個與三倍體有關(guān)的缺點。首先，這是一種需要長時間才能完成的麻煩費時的方法。為使三倍體的卵存活，須進行高質(zhì)量的處理過程，雖然所得到的魚看來都是活的，但這一存活率包括了15-20%的平均損失量，同時在產(chǎn)卵季節(jié)以外三倍體魚的生長速率要比二倍體魚慢。在接近產(chǎn)卵期時，雄性和雌性三倍體之間有很大差異，其中雄性發(fā)育可接近正常檢驗標準及所有相關(guān)第二特征，而雌性三倍體則沒有發(fā)育明顯的卵巢，且在正常產(chǎn)卵時表現(xiàn)出未成熟的外觀。
成功地應(yīng)用誘導(dǎo)的三倍體要求合用唯雌性技術(shù)(female-only technique)，而這在商業(yè)上是不合算的。與三倍體有關(guān)的其他的缺點是，它們與二倍體在同一池內(nèi)競爭而導(dǎo)致生長不好，而且三倍體雌性魚的生長并沒有顯示出超過成熟二倍體雌性魚。
魚是高度二態(tài)的，即它們可在雄性和雌性間互變，并可以控制性別的改變。對于養(yǎng)殖目的，如從生長速度的觀點看，一種性別通常是更可取的。大菱鲆和鰻鱺便是雌性比雄性生長得更大的例子。在幼鮭中，幼年雄性和雌性魚有差不多同樣的生長速度，但后來雄性魚發(fā)育了不期望有的特征。在成熟期，雄性停止生長，漸漸褐色并變得愛尋釁，其作為食品和玩物的價值就很差。另外，飼養(yǎng)的硬頭鱒和大西洋大麻哈魚的成熟雄性，一旦放入海水培養(yǎng)池中，便不能夠適應(yīng)于鹽水而導(dǎo)致死亡?？蓱?yīng)用一種產(chǎn)生性別倒轉(zhuǎn)，以得到所有雌性群體的方法，但它包括了向魚飼料中摻入激素，使得魚不適于作為餐桌上的食品，其他控制魚能育性的方法如光照、化學(xué)絕育和給予激素也都不可靠，不經(jīng)濟或不適用于生產(chǎn)作為食品的魚。
控制性成熟的免疫學(xué)方法已在哺乳動物身上取得某些成功。然而，對哺乳動物激素和免疫學(xué)反應(yīng)的研究并不能成為研究魚生理學(xué)的堅實基礎(chǔ)。魚是冷血動物，而且它們的免疫系統(tǒng)可在不同條件下有所變異。溫度即對魚的免疫反應(yīng)具有顯著影響，以致在生理范圍內(nèi)有較高溫度時即表現(xiàn)較高的免疫反應(yīng)水平。生理上的低溫度可延遲抗體產(chǎn)生的速率并可抑制免疫記憶的建立，對此T淋巴細胞似乎特別敏感。
此外，魚的免疫系統(tǒng)受到可能合理變動之激素的影響。激素水平可因搬運和抓捕等壓力或水質(zhì)量如氧含量低等的影響而改變。在小鮭魚由河入海和性成熟期(為兩個基本的激素改變時期)，魚由于體內(nèi)淋巴細胞數(shù)目減少而對疾病尤為敏感。
再者，魚只產(chǎn)生一種類型的抗體分子，即IgM，而已確定哺乳動物體內(nèi)有五大類抗體。
還有就是魚的內(nèi)分泌系統(tǒng)實質(zhì)上不同于哺乳動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)，例如由鮭科魚如大麻哈魚和南乳魚產(chǎn)生的魚促性腺素釋放具有下列序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Pro-Gly-NH2(Sherwood et al，1983;“Characterisation of a teleost GnRH”，PNAS USA802794-2798)，其第7和8位上的氨基酸不同于哺乳動物L(fēng)HRH。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，可將一類魚GnRH的類似物連接到適當?shù)妮d體分子上并用于免疫魚，如此即可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗交叉反應(yīng)性免疫原的抗體，后者對GnRH有高親和力并可中和內(nèi)源性GnRH。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，我們提供了有下列氨基酸序列的魚GnRH的類似物pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z其中W代表Gly或一個D-氨基酸X代表一個鍵，或一個或多個相同或不同的氨基酸，Y代表Cys或Tyr或沒有Y，且Z不存在或代表1個或多個相同或不同的氨基酸，或1個連續(xù)或不連續(xù)的肽鏈，各間斷處存在非α氨基酸多功能接頭部分或反向轉(zhuǎn)換氨基酸，條件是當W是Gly，X和Y不存在時，存在Z。
位置W處的殘基最好是Gly，其為天然存在的殘基;位置Y處的殘基最好是Cys，因為它常常更特異，且比以C末端Tyr得到者更易于接到載體蛋白上。
X最好代表相對小數(shù)目的殘基，如1至15個，較好是1至8個，更好是1至3個，最好是只有一個。雖然X位上可以存在任何一個或多個氨基酸，但這個氨基酸殘基最好是Gly。當然，其他氨基酸，較好是有小側(cè)鏈的氨基酸如Ala、Ser、Asn和Val也可以存在于X位上，且這個位置上的任何氨基酸殘基均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。還應(yīng)該注意的是，X位上可包括一個以上的相同或不同的殘基，例如在下列序列中pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Ala-Y-Z。
應(yīng)明確的是，X位上沒有氨基酸殘基的pGnRH也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
在根據(jù)本發(fā)明之pGnRH的優(yōu)選實例中，Z位上沒有氨基酸殘基，且根據(jù)本發(fā)明的類似物之特別優(yōu)選的實例具有下列序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys。
然而，我們的研究顯示，Z位上包括附加氨基酸時一般對分子其余部分的構(gòu)象選擇并沒有明顯影響。如果Z位包括了這樣一個延伸，那么在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，此延伸將包括能作為T細胞抗原決定基之蛋白序列的一個或多個小片段。例如，通式1-2-3-4之氨基酸序列的小片段，其中1是Gly或帶電荷的氨基酸(如Lys、His、Arg、Asp或Glu)，2是疏水氨基酸(如Ile、Leu、Val、Met、Tyr、Phe、Trp、Ala)，3是疏水氨基酸(如上限定的)或不帶電荷的極性氨基酸(如Asn、Ser、Thr、Pro、Gln、Gly)，且4是極性氨基酸(如Lys、Arg、His、Glu、Asp、Asn、Gln、Ser、Thr、Pro)，至少在某些例子中似乎可作為T細胞抗原決定基(Rothbard，J.B.& Taylor，W.R，(1988)，A sequence pattern in common to T-cell epitopes，The EMBO Journal7(1)93-100)。相似的小片段可以是序列1′-2′-3′-4′-5′，其中1′相當于上面限定的1，2′相當2，3′和4′相當于3，5′相當于4(出處同上)。兩種形式均包括于下面限定的通式中pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-S-T-S′，其中T代表含有一個或多個T細胞抗原決定基的肽序列小片段(最好少于5個氨基酸)，其可以是上一段中限定的類型或者是其他結(jié)構(gòu)的，且可被有任何長度或組成的間隔基小片段分隔開，而S和S′(其中每個可適當?shù)睾蛦为毜乇粍h去)則代表有任何長度和組成之氨基酸序列的間隔基小片段。S的長度最好少于5個氨基酸殘基，并包含例如選自Gly、Ala、Pro、Asn、Thr、Ser或多功能接頭如非α氨基酸的殘基。S′最好少于10個氨基酸殘基且可包含如非α氨基酸這樣的多功能接頭;S′部分最好從上面給出的S代表的氨基酸中得出。有可能S′代表一完整蛋白質(zhì)，因此便不一定要連接到載體蛋白上。
應(yīng)注意的是，當Z不存在時，可以在X位置上提供上面提到的T細胞抗原決定基。
基本類似物的衍生物也包括于本發(fā)明范圍內(nèi)，其中Z是或包括“反向倒轉(zhuǎn)”氨基酸。即具有相當于某氨基酸之官能團的雙官能胺。例如一個根據(jù)本發(fā)明并包含反向倒轉(zhuǎn)氨基酸的類似物可具有下列通式
其中R是任何官能團，更好是Gly，A1和A2各自更好是由其C末端連接的本文限定之類似物之一的拷貝(但不一定是相同的)。在特別優(yōu)選的實施方案中，A1或A2之一中Y位置上的Tyr或Cys應(yīng)被另一拷貝之相應(yīng)位置之上殘基以外的任何類型的氨基酸所取代，或者其可被刪去。因此該二聚體的連接是通過Y位上殘基之一(也可以是兩殘基)的側(cè)鏈實現(xiàn)的。另外，A1和/或A2可以是天然pGnRH的，且反向倒轉(zhuǎn)氨基酸的R可以是Cys或Tyr。如前面所討論的，T細胞抗原決定基也可以被包括在小片段Z中。
類似物可具有下列通式
其中B是反向倒轉(zhuǎn)氨基酸，A1和A2是相同或不同的，且具有下示序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z′
其中W、X和Y的定義同上，Z′與前述的Z相同。只是它不包括反向倒轉(zhuǎn)氨基酸。
對肽的反向倒轉(zhuǎn)修飾包括倒轉(zhuǎn)一個或多個肽鍵以產(chǎn)生比原始分子對酶降解有更大抗性的類似物，并為產(chǎn)生分支免疫原提供了一種方便的途徑，對于中等到大的免疫原來說，該分支免疫原將含有高濃度的抗原決定基。在短鏈生物學(xué)活性肽之反向倒轉(zhuǎn)類似物的大批量溶液合成中，使用這些化合物具有很大的潛在價值。
本發(fā)明的另一方面提供了制造具有下列氨基酸序列之魚GnRH類似物的方法pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z，其中W代表Gly或D-氨基酸，X代表一個鍵，或一個或多個相同或不同的氨基酸，Y代表Cys或Tyr，或不存在，且Z不存在，或代表一個或多個相同或不同的氨基酸，或連續(xù)或不連續(xù)的肽鏈，各間斷處存在非α氨基酸多官能接頭部分或反向倒轉(zhuǎn)氨基酸，條件是當W為Gly，且X和Y不存在時，存在Z，該方法包括使用已知的化學(xué)、生物學(xué)和/或重組技術(shù)偶聯(lián)各殘基并分離該類似物。
可使用標準的肽合成技術(shù)，如Merrifield于1963年(J.Am.Chem，Soc.85，2149)介紹的固相肽合成法(SPPS)合成本發(fā)明的類似物。該方法中，生長的肽鏈通過其C末端共價連接到不溶性固相載體上。通過在預(yù)期序列中連續(xù)加入氨基酸進行合成。在這種情況下，所有純化的中間步驟(這些步驟對于溶液中合成是必不可少的)均簡化為簡單的沖洗，因為大多數(shù)反應(yīng)的降解作用的付產(chǎn)物都被溶在了反應(yīng)混合物中。SPPS的優(yōu)點是迅速、相對容易完成而且是一種可以部分或全部自動化的方法，使用SPPS有可能產(chǎn)生出幾十克的肽。
簡單地說，1963年由Merrifield發(fā)展的SPPS包括下述四個階段(A)通過在整個合成過程中均保持穩(wěn)定的共價鍵，將第一個被保護的氨基酸連接到固相載體上;
(B)在任何側(cè)鏈官能團的保護基團均穩(wěn)定的條件下，通過去保護而重新產(chǎn)生被連接之殘基的游離氨基酸基團;
(C)通過縮合形成酰胺鍵，使下一個被保護的氨基酸與第一個氨基酸偶聯(lián)。重復(fù)步驟B和C，直到合成過程完成;
(D)在合成完成時，由固相載體上釋放出肽并除去任何的氨基酸側(cè)鏈保護基團。
文獻中已描述了許許多多氨基酸保護基團的組合，但目前常用的只有其中兩種組合。第一種是叔丁氧基碳酰(Boc)/芐基組合物，其從1963年就已由Merriifield使用，而且至今仍被廣泛采用。最近已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，由Sheppard等人發(fā)展的芴基甲氧基碳酰(Fmoc)/叔丁基系統(tǒng)也得到了廣泛的應(yīng)用(Sheppard，R.C，1986，Science Tools，The LKB Instrument Journal33，9)。進一步的例子包括由Arsady，R.等人建立的使用固相樹脂的Fmoc-聚酰胺方法(J.Chem，Soc.Perkin Trans，1981，1，529-537)，用芴基甲氧基碳酰(Fmoc)保護被摻入的個別氨基酸(Atherton，E.et al，J.Chem，Soc.Perkin Trans，1983，1，65-73)及9-芴基甲氧基碳酰(Fmoc)化學(xué)法(如參見Atherton，E.et al，1985，J.Chem.Soc.Chem，Comm，165)。
此外，通過遺傳密碼編碼本文所述各肽類似物之序列的DNA和RNA分子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。可在適當?shù)奈⑸锘蛘婧思毎囵B(yǎng)物表達系統(tǒng)中使用這些DNA分子，用以產(chǎn)生本文所述的類似物。已在這樣的系統(tǒng)中合成了相似分子并已在本文獻中述及(如參見歐洲專利申請85307311.2號)。
應(yīng)注意的是，不能使用這樣的系統(tǒng)直接制得摻入反向倒轉(zhuǎn)氨基酸衍生物的類似物。但可以進一步純化基本類似物并使用標準的肽/有機化學(xué)方法將其連接到反向倒轉(zhuǎn)氨基酸上。最近已描述了在聚酰胺型樹脂上固相合成反向倒轉(zhuǎn)肽的實用而且方便的新方法[Gazerro，H，Pinori，M.&Verdini，A.S.(1990)，A new general Procedure for the solid-phase synthesis of retro-inverso peptides，In“Innovation and Perspective in Solid Phase Synthesis”Ed.Roger Epton.SPC(UK)Ltd.Birmingham，UK]。
最好將類似物連接到載體分子上，以得到類似物結(jié)合物。任何小分子或大分子載體或微生物都可以使用，但優(yōu)選的是下列常用的載體鑰孔 血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、雞γ球蛋白(CGG)、破傷風(fēng)類毒素(TT)、白喉類毒素(DPT)、純化的結(jié)核菌素蛋白微生物(PPD)、胞壁酰二肽(MDP)、大豆胰蛋白酶抑制物(STT)及霍亂毒素或其B亞單位。值得注意的是，在使用PPD的情況下，用BCG疫苗引發(fā)更為有利(Lachmann，P.et al，1986，In“Synthetic Peptides as Antigens”，Ciba Foundation Symposium119，pp.25-40)。
作為自家免疫接種魚時所用LHRH類似物的載體，特別優(yōu)選的是下列作為疫苗成分的微生物或大分子抗原殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salm onici da)(癤瘍病)、Yersinia ruckeri(ERM)和鰻弧菌(Vibrio anguillarium)與Vibrio ordalii(弧菌病)的混合物。
最近，已試驗了下列五個基本類型疫苗的抗癤瘍病效果(后者是由革蘭氏陰性非游動菌殺鮭氣單胞菌引起的)整個被殺死或破壞的細胞(菌苗)，細胞外產(chǎn)物(ECP)和ECP類毒素，整個被殺死的細胞ECP合用，活減毒疫苗及純化的抗原。此外，也已將在魚和哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生的抗某些抗原的超免疫血清用于被動保護。另外，已成功地生產(chǎn)出了抗大口水牛魚腸炎(enteric redmouth ERM)(該病是由革蘭氏陰性游動細菌Yersinia rukeri引起的)的疫苗(或菌苗)，其包含福爾馬林滅活的全細菌培養(yǎng)物。最近在北半球國家使用的商品弧菌病疫苗包含最常見菌種鰻弧菌和V.ordalii的混合物。這些疫苗是含有全細胞和ECP之混合物的簡單滅活的培養(yǎng)物。
本發(fā)明的再一個方面，提供了含有根據(jù)本發(fā)明之pGnRH類似物或類似物結(jié)合物以及獸藥用賦形劑的疫苗。
這些疫苗可用于自家免疫魚，且本發(fā)明的再一方面是提供一種抑制魚性發(fā)育的方法，該方法包括給所說的魚使用有效量的pGnRH類似物或類似物結(jié)合物，以使所產(chǎn)生的抗pGnRH抗體滴度足以顯著降低內(nèi)源性pGnRH的生物學(xué)效能。
可使用文獻中已充分描述的試劑和方法，很容易地制得Y位上含有Cys或Tyr之類似物的結(jié)合物。例如，可使用N-γ-順丁烯二酰亞氨基丁酰氧基琥珀酰亞胺(Calbiochem)，通過硫酯鍵將Y位上含有Cys殘基的魚GnRH類似物連接到載體蛋白質(zhì)的賴氨酸側(cè)鏈上，同時可與N-(4-重氮苯基)-順丁烯二酰亞胺形成連接Y位置含Tyr殘基之類似物的重氮鍵。
可使用本領(lǐng)域已知的方法很容易將肽和結(jié)合物純化到必要的程度，這些方法如包括高效液相層析，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及快速液相層析。
本發(fā)明的肽-載體結(jié)合物可用于下列目的(1)免疫任何動物，以產(chǎn)生用于下面所述特定需要的抗魚GnRH抗體
(2)對魚進行抗魚GnRH的自家免疫，以便-減慢、停止或消退性發(fā)育-控制、限制或消除生殖力-治療GnRH依賴性魚腫瘤-進行魚生理學(xué)/獸醫(yī)學(xué)研究;
(3)用作檢測如血清樣品中是否存在抗魚GnRH抗體的診斷試劑。
針對類似物的抗魚GnRH抗體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。例如它們可以1)用作研究魚生理學(xué)/免疫學(xué)的研究工具2)作為產(chǎn)生抗同種異型抗體的免疫原;
3)進行被動免疫，以便-實現(xiàn)在短期內(nèi)減慢、停止或消退性發(fā)育-達到短期內(nèi)控制生殖力-治療GnRH依賴性魚腫瘤-另外干擾魚GnRH的活性。
(可通過給予在魚或哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生的多克隆、單克隆或單一區(qū)域抗體進行被動免疫)4)作為檢測例如血清樣品內(nèi)是否存在魚GnRH的診斷劑。
很顯然，上面2)中提到的抗同種異型抗體也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
可按照常規(guī)方法制備能與本發(fā)明的合成多肽特異結(jié)合的多克隆或單克隆抗體、這些抗體的嵌合形式或魚類特有的形式(如參見Morrison et al，(1984)PNAS(USA)81，6851-6855;Riech-mann et al，(1988)Nature 332，323-327)，及單一區(qū)域抗體(如參見Ward，E.S，Gussow，D.Griffiths，A.D.，Jones，P.and Winter，G.(1989)Nature 341，544-546)。如上所述，這些抗體也被認為是本發(fā)明的一部分。
在檢測抗魚GnRH抗體或魚GnRH方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用各種已知的免疫檢測技術(shù)，如可使用競爭或競爭性抑制檢測法或直接和間接標記法。一種優(yōu)選的檢測抗魚GnRH抗體的藥盒包括了本發(fā)明的類似物或類似物結(jié)合物、標記工具及固相載體。相似地，一種檢測魚GnRH的藥盒包含了可與本發(fā)明之類似物特異結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段、標記工具及固相載體。
可經(jīng)幾種方法使用魚疫苗，如注射、經(jīng)口服途徑及通過浸沒等。
腹控內(nèi)注射是疫苗接種的最有效方法，同時便于使用可提高免疫反應(yīng)程度的佐劑。缺點是魚需要麻醉的相應(yīng)處理，這樣就會使魚經(jīng)受壓力并且加大勞動強度。但如果使用重復(fù)利用的注射器和生產(chǎn)線系統(tǒng)，每小時可以注射1000條魚。不過這不適于小于15克的魚。
口服疫苗接種適合于對大批量各種大小的魚給藥，而且沒有因操作造成的壓力。缺點是需要使用大量的疫苗，從而提高了成本，而且不好控制每條魚的使用劑量。口服疫苗效力差，導(dǎo)致保護作用的水平低而且不恒定，大多數(shù)口服給藥都是針對弧菌病疫苗的。
優(yōu)選的直接浸沒法(D.I)是一種簡單而快速的方法，只需要與疫苗接觸幾秒鐘。這種方法現(xiàn)已實現(xiàn)了自動化并已針對弧菌病和ERM疫苗建立了“浴”和“水洗”變換的操作程序，且只簡單地包括將疫苗倒入存貯罐中。雖然這種方法要消耗更多的疫苗并需要較長的接觸時間(約一小時，包括水的氧合作用及密切監(jiān)測魚受到的壓力)，但其勞動強度比注射法要小。
用含有(Ⅰ)與一種以上類型載體分子結(jié)合的已知類似物，和/或(Ⅱ)一種以上與同樣載體分子結(jié)合之類似物的混合疫苗浸沒可能更為有利。此外，可將任何肽類似物，它們的結(jié)合物及其混合物加在任何適當?shù)淖魟┗蜥尫畔到y(tǒng)中使用，并且可將一種以上的佐劑和釋放系統(tǒng)合在一起，形成所謂“超級混合物”。優(yōu)選的佐劑和釋放系統(tǒng)包括氫氧化鋁(明礬)、微球體、脂質(zhì)體、膠束、核糖體、ISCOMS、Brauns脂蛋白及全細胞或微生物魚疫苗成分。
下面借助非限制性實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例1使用標準固相Fmoc方法合成本發(fā)明的pGnRH的羧基端延伸形式。在三氟乙酸存在下由樹脂上裂解肽，然后用凝膠過濾、離子交換層析及反向高效液相層析法進行純化。借助MBS(m-順丁烯二酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺苯酯)將肽連接到各種載體上。
已證明雞γ球蛋白(CGG)對于硬頭鱒魚的其他疫苗是一種很好的載體，并被用于本實施例中。還使用了PPD，因為這是一種已在哺乳動物的實驗研究中被證實的載體(盡管在免疫前需要用BCG)。
以肽∶蛋白質(zhì)為30-40∶1的摩爾比例，將pGnRH類似物偶聯(lián)到載體上，并以三個不同的濃度給硬頭鱒作腹腔內(nèi)注射。
然而使用棘根過氧化物酶(HRP)連接的單克隆抗鱒魚免疫球蛋白以酶聯(lián)免疫法(ELISA)監(jiān)測血清抗體反應(yīng)，每周測一次共10周。在本實施例的某些試驗中，用載體預(yù)免疫或使用佐劑，或進行加強注射。以確定產(chǎn)生抗pGnRH抗體的最佳免疫程序。
實施例2按實施例1中確定的最佳免疫程序免疫一組待成熟的硬頭鱒魚。用實施例1中所述方法監(jiān)測抗體反應(yīng)，同時監(jiān)測生長速度及性類固醇(如睪酮)的產(chǎn)生。實驗結(jié)束時將魚殺死，除去性腺并稱重，以確定性腺體指數(shù)(GSI)。然后固定性腺，以便用光學(xué)顯微鏡進行組織學(xué)研究。免疫過的魚比未處理的對照組魚有明顯好的GSI。
實施例3用偶聯(lián)到結(jié)核菌素純化之蛋白質(zhì)衍生物上的鮭魚性腺素釋放激素延伸類似物(sGnRHa-PPD)免疫成熟的硬頭鱒。
方法
a)將sGnRH-Gly-Cys連接到PPD上在苯甲?；w維素管中使結(jié)核菌素PPD(1.008mg/ml+苯酚防腐劑，Evans Limited)對0.9%NaCl于12℃下透析過液，以除去苯酚。然后用聚乙二醇(pG20000)處理1.5小時，將PPD濃縮到4.032mg/ml。在室溫下使PPD溶液(2.5ml，含10.08mg PPD在5.04ul二甲基甲酰胺(DMF)中與1.08mgN-γ-順丁烯二酰亞氨基丁酰氧基琥珀酰亞胺(GMBS)混合1小時，然后上Sephadex G-25M PD-10柱，并用3.5ml緩沖液A(0.05M NaH2PO4、0.14M NaCl，pH7.0)洗脫。將溶解在蒸餾水中的4.687ml濃度為3mg/ml的sGnRH-Gly-Cys及緩沖液A(即，14，0616mg SGnRH-Gly-Cys逐滴地加到PPD中。在氮氣環(huán)境下將溶液室溫混合2小時，并自始至終估測游離硫羥含量。在苯甲?；w維素管中使結(jié)合物對蒸餾水12℃透析過液，然后儲存于-20℃下備用。
b)游離硫羥分析使用試劑5，5′一二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNS)及還原態(tài)谷胱甘肽標準品估測結(jié)合物的游離硫羥含量。使用按比例縮小的Ell-man氏測定法的微量滴定板變體，其中向50μl樣品中加入2μl10mMDTNB和250μl PBS(pH8)，10分鐘后在405nm處測定吸光率。
C)硬頭鱒魚和免疫程序使用各種組合的冷凍打印工具分別標記130條成熟硬頭鱒(長度約30cm)。記錄每條魚的長度和重量并取600μl血樣測定預(yù)免疫血清抗體水平。另外，檢測血清類固醇水平，以確定魚的性別。將魚分成兩組，分別予以加在弗氏完全佐劑(FCA)內(nèi)的sGnRH-Gly-Cys-PPD或鹽水作腹腔內(nèi)注射。再將處理組和對照組分別分出雄性和雌性。雄性魚放在光線和溫度條件下。雌性再進一步分成兩組一組放在環(huán)境光線和溫度條件下(溫度可在14℃或較低溫度間變動)，另一組則置于環(huán)境光線和14℃條件下。用后一組魚估計溫度對抗sGnRH-Gly-Cys抗體滴度的影響及在魚成熟中造成的任何差異。整個實驗中，以四周間隔對各條打印記的魚進行稱重檢測和放血。用ELISA法檢測血清中的抗sGnRH-Gly-Cys抗體(使用sGnRH-Gly-Cys-BSA)，并使用RIA法檢測類固醇激素17-β-雌二醇和/或11-酮睪甾酮(11-ketotestosterone)。
d)類固醇分析用放射免疫法檢測成熟魚血清中17-β-雌二醇(E2)和11-酮睪甾酮(11-KT)的濃度。該項分析中，使放射活性標記的類固醇結(jié)合到有限量的類固醇特異性抗體上，這一相互作用可因加入未標記的類固醇而部分地受到抑制。
e)抗sGnRH-Gly-Cys ELISA分析的最佳化將結(jié)合到牛血清白蛋白(BSA)上的鮭魚類GnRH-Gly-Cys用于ELISA分析法。將加在0.5ml緩沖液A中的10mgBSA與加在5μlDMF中的1mgGMBS合并，最后偶聯(lián)到6.246mgsGnRH-Gly-Cys上。ELISA方格盤檢測法可以在成熟實驗中選擇適于進行抗sGnRH-Gly-CysELISA分析的sGnRH-Gly-Cys-BSA包被濃度。
結(jié)果ⅰ)抗sGnRH-Gly-Cys抗體滴度如表1所示(雄性和雌性)在用sGnRH-Gly-Cys-PPD免疫(2μg sGnRH-Gly-Cys/魚，加在FCA中腹腔內(nèi)注射)后8周，相對于對照組增加了抗sGnRH-Gly-Cys抗體滴度。
ⅱ)硬頭鱒成熟期間血清17-β雌二醇的水平用sGnRH-Gly-Cys-PPD免疫的影響如表2中所示，直到免疫后4周，處理組和對照組成熟雌性鱒魚的血清17-β雌二醇水平以同樣速度增加。到免疫后第8周，對照組的17-β雌二醇水平仍以同樣速度繼續(xù)增加。但在免疫后8周，成熟雌魚中的sGnRH-Gly-Cys-PPD組則比對照組成熟雌魚具有低得多的17-β雌二醇水平(P<0.05t試驗)。
ⅲ)抗體滴度和類固醇水平間的相互關(guān)系很顯然，用sGnRH-Gly-Cys-PPD免疫后，抗體滴度的增加是與成熟硬頭鱒血清17-β-雌二醇水平的少量增加相互關(guān)聯(lián)的，數(shù)據(jù)表明，pGnRH-Gly-Cys-PPD在延遲雌性硬頭鱒性成熟中是積極有效的。
權(quán)利要求
1.制造有下列氨基酸序列之魚GnRH類似物的方法pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z其中W代表Gly或D-氨基酸，X代表一個鍵，或一個或多個相同或不同的氨基酸，Y代表Cys或Tyr或不存在，且Z不存在或代表一個或多個可以相同或不同的氨基酸，或連續(xù)或不連續(xù)的肽鏈，各間斷處存在非α氨基酸多官能接頭部分或反向倒轉(zhuǎn)氨基酸，條件是當W是Gly，X和Y沒有時，Z存在，該方法包括使用已知的化學(xué)、生物學(xué)和/或重組技術(shù)偶聯(lián)各殘基并分離該類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中W是Gly。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中Y是Cys。
4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的方法，其中X是一個或多個甘氨基酸殘基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其中X或Z包含至少一個T細胞抗原決定基。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中之任一項的方法，其中Z包含反向倒轉(zhuǎn)氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中類似物具有下列通式A1-B-A2其中B是反向倒轉(zhuǎn)氨基酸，A1和A2是相同或不同的，且具有下列序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-W-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-X-Y-Z′其中W、X和Y如權(quán)利要求1中限定的，Z′同權(quán)利要求1中限定的Z，但它不包括反向倒轉(zhuǎn)氨基酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中類似物具有序列pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-Gly-Cys。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中之任一項的方法，其包括將類似物連接到載體分子上。
10.制造疫苗的方法，其中將權(quán)利要求1至8中任一項所限定的類似物或權(quán)利要求9中限定的類似物結(jié)合物與獸藥用賦形劑混合。
11.檢測樣品中抗魚GnRH抗體的藥盒，所說的藥盒包含上述權(quán)利要求1至8之任一項中限定的類似物，或權(quán)利要求9中限定的類似物結(jié)合物、標記工具及固相載體。
12.使用權(quán)利要求1至9之任一項中限定的類似物制備減緩、停止或消退魚性發(fā)育或控制魚生殖力的藥物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至5中之任一項或權(quán)利要求8的方法，其中類似物是以重組技術(shù)作為連續(xù)肽鏈產(chǎn)生的。
14.制造特異地結(jié)合權(quán)利要求1至7中之任一項限定的類似物之抗體或抗原結(jié)合片段的方法，該方法包括用權(quán)利要求1至8中之任一項限定的類似物或權(quán)利要求9限定的類似物結(jié)合物免疫被免疫對象，并分離所形成的抗體或產(chǎn)生抗體的細胞。
15.檢測樣品中魚GnRH的藥盒，所說的藥盒包含權(quán)利要求14中限定的抗體或抗原結(jié)合片段、標記工具和固相載體。
16.如權(quán)利要求15中限定的抗體或抗原結(jié)合片段用于制造減緩、停止或消退魚的性發(fā)育或控制魚生殖力的藥物。
17.制造對權(quán)利要求14中限定的抗體或抗原結(jié)合片段特異之抗同種異型抗體的方法，該方法包括用按照權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生的抗體或抗原結(jié)合片段免疫被免疫對象并分離所形成的抗體。
18.對魚進行抗魚GnRH免疫，以減緩、停止或消退性發(fā)育，或控制、限制或消除生殖力的方法，該方法包括給魚投予有效量權(quán)利要求1至8中之任一項限定的類似物或權(quán)利要求9限定的類似物結(jié)合物或權(quán)利要求14限定的抗體或抗原結(jié)合片段。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中魚被浸沒在含有權(quán)利要求1至8中之任一項限定的類似物或權(quán)利要求9限定的類似物結(jié)合物或權(quán)利要求14限定的抗體或抗原結(jié)合片段的水中。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中權(quán)利要求1至8中任一項所限定的類似物或權(quán)利要求9限定的類似物結(jié)合物或權(quán)利要求15限定的抗體或抗原結(jié)合片段是經(jīng)口服給予的。
全文摘要
本發(fā)明公開了制造魚GnRH類似物的方法，所說的類似物具有下列序列pGlu—His—Trp—Ser—Tyr—W—Trp—Leu—Arg—Pro—Gly-X-Y-Z其中W，X，Y，Z的定義見說明書?？蓪㈩愃莆镞B接到載體上并用以例如延遲發(fā)動性成熟及提高生長率。
文檔編號G01N33/74GK1063109SQ9210014
公開日1992年7月29日 申請日期1992年1月9日 優(yōu)先權(quán)日1991年1月9日
發(fā)明者R·V·菲什雷利, B·羅布桑 申請人:普羅托斯分子設(shè)計有限公司