專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于體液直接進(jìn)樣分析高效液相色譜固定相的合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于高效液相色譜固定的合成方法。
用于體液直接進(jìn)樣分析的高效液相色譜固定相對(duì)于體液中的蛋白質(zhì)不保留，而分析物能被其保留，進(jìn)行色譜分離，這種固定相能廣泛用于藥物分析和臨床分析，具有重要的商業(yè)價(jià)值。
美國(guó)4544485號(hào)專(zhuān)利介紹了一種內(nèi)表面反相填料(ISRP)。其制備方法是，硅膠(5μm，80
)首先和γ-縮水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)，引入縮水甘油氧基丙基鍵合相，然后用羰基二咪唑活化，通過(guò)氨基甲酸酯鍵合，將肽Gly-L-Phe或Gly-L-Phe-L-Phe的N端連到縮水甘油氧基丙基上，最后用羧基肽酶A使肽鏈上的苯丙氨酸殘基從硅膠外表面上斷裂。這種固定相的不足之處是，由于使用酶反應(yīng)，產(chǎn)品成本高，且每批產(chǎn)品之間的重現(xiàn)性難以得到保證。
一個(gè)正在審理的，屬于Feibush和Gisch的美國(guó)專(zhuān)利中，制備了一種體液直接進(jìn)樣用固定相，稱(chēng)作屏蔽疏水固定相(SHP)。SHP的載體上鍵合有一個(gè)親水性聚氧化乙烯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包裹在其內(nèi)部的是疏水的苯基。體液中的小分子溶質(zhì)可以通過(guò)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，滲入內(nèi)部，與疏水基團(tuán)作用而被保留。大分子，如蛋白質(zhì)，則被親水屏蔽網(wǎng)所阻攔，不被保留從柱上洗脫下來(lái)。SHP柱的應(yīng)用研究也報(bào)告在J.Chromatogr.，433(1988)264。
美國(guó)專(zhuān)利(U.S.Pat.Appl.Ser.No.07/488681，1990)介紹了半透表面反相柱填料的合成。該填料以100
硅膠為基體，疏水的鍵合相之外共價(jià)鍵合聚乙二醇，形成一個(gè)親水高聚物半透層。由于半透層的阻擋，生物試樣中的蛋白質(zhì)不能與疏水相接觸，而小分子卻能通過(guò)半透表面實(shí)現(xiàn)色譜分離。
Haginaka和Wakai為提高制備填料的重復(fù)性和避免使用酶反應(yīng)，發(fā)展了混合功能團(tuán)固定相(MFP)，合成MFP包括三個(gè)基本步驟引入γ-縮水甘油氧基丙基，引入疏水基團(tuán)，環(huán)氧鍵轉(zhuǎn)化為雙醇基，MFP硅膠載體的內(nèi)外表面含有相同的親水和疏水基團(tuán)。在新制備的MFP柱上，將人血清試樣幾次進(jìn)樣后，血清白蛋白的回收率就可達(dá)到100%。這表明，外表面的吸附部位被蛋白質(zhì)封閉后，MFP就可用于直接進(jìn)樣分析。
半透表面反相柱填料和混合功能團(tuán)固定相都是通過(guò)γ-縮水甘油氧基引入親水基團(tuán)。由于該基團(tuán)和疏水基團(tuán)都是通過(guò)硅烷和硅膠上的硅羥基反應(yīng)被鍵合，在硅膠上難以同時(shí)保持較多的親水和疏水基團(tuán)存在。
與本發(fā)明有關(guān)的已有技術(shù)可在下列文獻(xiàn)中找到T.O.Pinkerton，J.Chromatogr.，544(1991)13.J.A.Perry，J.Liq.Chromatogr.，13(1990)1047.D.J.Gisch;B.T.Hunter;B.Feibush，J.Chromatogr.，433(1988)264.C.P.Desilets;M.A.Rounds;F.E.Regnier，J.Chromatogr.，544(1991)25.J.Haginaka;J.Wakai，Chromatographia，29(1990)223.
本發(fā)明的目的是提出用于體液直接進(jìn)樣分析固定相的新合成方法。該法有如下特點(diǎn)1.合成路線簡(jiǎn)單;2.成本最低;3.不同批次的產(chǎn)品之間重現(xiàn)性好;4.由于采用新的合成路線，使鍵合相同時(shí)具有較多可與小分子相互作用的基團(tuán)和親水基團(tuán)，前者對(duì)藥物等小分子的保留是至關(guān)重要的，而后者的存在使體液中的蛋白質(zhì)不被或較少程度地保留在色譜柱上。
本發(fā)明的基本構(gòu)思是，含三個(gè)烷氧基的硅烷與硅膠反應(yīng)后，在鍵合相的硅烷分子中，未與硅羥基作用的剩余烷氧基可進(jìn)一步和聚乙二醇反應(yīng)，增加鍵合相的親水性。引入親水基團(tuán)并不是通過(guò)和硅膠載體上羥基的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的，因此，不存在和原有的鍵合反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)硅羥基的問(wèn)題。這是增加鍵合相親水性簡(jiǎn)單且合理的途徑。在所有已有技術(shù)文獻(xiàn)中，其研究方法均與本發(fā)明構(gòu)思不同，本發(fā)明的構(gòu)思已通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)展成為實(shí)用技術(shù)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法包括兩個(gè)步驟，第一步是把R基三烷氧基硅烷R-Si-(OR′)3鍵合到硅膠上。根據(jù)分析物的性質(zhì)，可選擇不同R基的硅烷進(jìn)行鍵合反應(yīng)。R可以是苯基、烷基，或含氨基、氰基、巰基的基團(tuán)。第二步是利用第一步反應(yīng)產(chǎn)物和聚乙二醇反應(yīng)，增加鍵合相的親水性。根據(jù)分析物的性質(zhì)，R基可以是極性的，非極性的或具有離子交換性質(zhì)的基團(tuán)。因此，可按上述合成途徑，制備出一系列的體液直接進(jìn)樣分析用固定相。
聚乙二醇的引入，除增加親水性外，還使鍵合相具有一些新的性質(zhì)，如親核基團(tuán)的存在，可抑制硅膠基體上殘余的硅羥基效應(yīng)。
對(duì)人血清中一些藥物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明合成的固定相，可以用于體液中疏水性和親水性藥物的色譜分析。
本發(fā)明的技術(shù)實(shí)施過(guò)程為1.鍵合反應(yīng)使R-Si-(OR′)3和硅膠反應(yīng)，R基可以是苯基、烷基，或含氨基、氰基、巰基的基團(tuán)，烷氧基可以是甲氧基或乙氧基。反應(yīng)溶劑為甲苯，反應(yīng)溫度為溶劑沸點(diǎn)溫度。根據(jù)R基的性質(zhì)，可在堿性催化劑(如三乙胺)存在下，或無(wú)催化劑進(jìn)行反應(yīng)。
2.將鍵合反應(yīng)產(chǎn)物和聚乙二醇反應(yīng)，增加鍵合相的親水性。該反應(yīng)是酯交換反應(yīng)，所考慮的反應(yīng)條件包括溶劑的選擇、反應(yīng)物的濃度、催化劑、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等。
3.基體硅膠的選擇考慮到色譜分析效率和對(duì)體液中大分子的排阻作用，使用粒徑為5-40μm，孔徑為60-100
的多孔硅膠。
4.反應(yīng)溶劑鍵合相與聚乙二醇之間的反應(yīng)，可選用甲苯或二甲亞砜、四氯化碳等為溶劑。
5.反應(yīng)物濃度酯交換反應(yīng)為可逆反應(yīng)。為了促使反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，一般聚乙二醇和鍵合相上的硅烷基的配比為5-10∶1。根據(jù)不同分子量聚乙二醇的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇分子量范圍為200-1000的聚乙二醇作為交聯(lián)劑。分子量過(guò)大，在反應(yīng)溶劑中不易溶解;小分子量的聚乙二醇含較少的氧化乙烯單元，不利于增加鍵合相的親水性。
6.催化劑堿性物質(zhì)的存在對(duì)酯交換反應(yīng)有促進(jìn)作用，三乙胺、吡啶、三甲胺、乙二胺等均可作為催化劑。
7.反應(yīng)溫度在70℃到溶劑沸點(diǎn)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行鍵合相和聚乙二醇之間的反應(yīng)。
8.反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，對(duì)鍵合相和聚乙二醇之間的反應(yīng)有利，一般在2-9小時(shí)內(nèi)完成反應(yīng)。
本發(fā)明有六個(gè)實(shí)施例如下1.制備含苯基直接進(jìn)樣用固定相。
5μm60-80 的硅膠，經(jīng)酸處理，水洗，在100℃真空干燥后備用。
取上述硅膠3g于園底燒瓶中，依次加入40ml甲苯、1ml苯基三乙氧基硅烷和0.5ml三乙胺。在攪拌條件下，沸點(diǎn)溫度回流反應(yīng)4小時(shí)。吸濾，依次用甲苯和甲醇洗滌，在85℃真空干燥8小時(shí)，得苯基鍵合相。
取0.5g苯基鍵合相于園底燒瓶中，加30ml甲苯、1ml四聚乙二醇和0.5ml三乙胺。在攪拌下，沸點(diǎn)溫度回流反應(yīng)8小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)吸濾，依次用甲苯、甲醇洗滌，在85℃真空干燥8小時(shí)，得含苯基體液直接進(jìn)樣分析用鍵合相。
產(chǎn)品的元素分析結(jié)果如下(基體硅膠比表面為272M2/g)C%H%苯基鍵合相8.591.06含苯基直接進(jìn)樣分析用鍵合相10.041.212.
苯基鍵合相制備方法同實(shí)施例1。
取0.5g苯基鍵合相于園底燒瓶中，加30ml甲苯、8.5ml吡啶1ml四聚乙二醇。在攪拌下，沸點(diǎn)溫度回流反應(yīng)8小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)吸濾，依次用甲苯、甲醇洗滌，在85℃真空干燥8小時(shí)。產(chǎn)品的元素分析結(jié)果為C%9.64;H%1.12。
3.
以小比表面的硅膠為原料，反應(yīng)條件和步驟同實(shí)施例1。產(chǎn)品元素分析結(jié)果如下C%H%苯基鍵合相3.420.32含苯基直接進(jìn)樣分析用鍵合相5.000.584.制備含氨基直接進(jìn)樣分析用固定相取2.5g5μm60-80 硅膠于100ml園底燒瓶中，加30ml甲苯、1.7mlγ-氨基丙基三乙氧基硅烷。在攪拌下，沸點(diǎn)溫度回流5小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)吸濾，依次用甲苯、甲醇洗滌，在80℃真空干燥12小時(shí)，得氨基鍵合相。
取氨基鍵合相2.5g于100ml園底燒瓶中。加60ml甲苯、2ml四聚乙二醇和0.3ml三乙胺。在攪拌下，沸點(diǎn)溫度回流4小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)吸濾，依次用甲苯、甲醇洗滌，在80℃真空干燥12小時(shí)，得含氨基直接進(jìn)樣分析用固定相。產(chǎn)品的元素分析結(jié)果如下(硅膠比表面為165M2/g)C%H%N%氨基鍵合相3.760.650.81含氨基直接進(jìn)樣分析用鍵合相4.640.800.985.
以大比表面硅膠(372M2/g)為原料，在實(shí)施例4條件下得到如下結(jié)果C%H%N%氨基鍵合相6.361.451.75含氨基直接進(jìn)樣分析用鍵合相8.941.831.546.
取實(shí)施例5中的氨基鍵合相1g于園底燒瓶中，加入25ml甲苯、5ml吡啶和2ml四聚乙二醇。在攪拌下，沸點(diǎn)溫度回流4小時(shí)。產(chǎn)物經(jīng)吸濾，依次用甲苯、甲醇洗滌，在80℃真空干燥12小時(shí)。產(chǎn)品的元素分析結(jié)果為C%8.28;H%1.76;N%1.67。
權(quán)利要求
1.一類(lèi)用于體液直接進(jìn)樣分析高效液相色譜固定相的合成方法，其特征是首先使硅烷R-Si-(OR′)3和多孔硅膠起鍵合反應(yīng)，然后在堿性催化劑的存在下，所得的鍵合相和聚乙二醇反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求(1)所說(shuō)的一類(lèi)用于體液直接進(jìn)樣分析高效液相色譜固定相的合成方法，其特征是所說(shuō)的R可以是烷基、苯基，或含氨基、氰基、巰基的基團(tuán)，OR′為甲氧基或乙氧基。
3.根據(jù)權(quán)利要求(1)所說(shuō)的一類(lèi)用于體液直接進(jìn)樣分析高效液相色譜固定相的合成方法，其特征是所說(shuō)的多孔硅膠的粒徑為5-40μm，孔徑為60-100
。
4.根據(jù)權(quán)利要求(1)所說(shuō)的一類(lèi)用于體液直接進(jìn)樣分析高效液相色譜固定相的合成方法，鍵合相與聚乙二醇反應(yīng)中的堿性催化劑可以是三乙胺、吡啶、三甲胺、乙二胺等，催化劑在溶劑中的體積百分濃度為0.1%-10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求(1)所說(shuō)的一類(lèi)用于體液直接進(jìn)樣分析高效液相色譜固定相的合成方法，鍵合相在甲苯或二甲亞砜、四氯化碳等介質(zhì)中，和聚乙二醇反應(yīng)，反應(yīng)溫度為70℃到溶劑沸點(diǎn)溫度，反應(yīng)時(shí)間為2-9小時(shí)。
全文摘要
提出了一種制備體液直接進(jìn)樣分析用高效液相色譜固定相的方法，該方法分兩步進(jìn)行第一步是多孔硅膠和硅烷中的烷氧基反應(yīng)，鍵合上與體液中分析物有分子間相互作用的基團(tuán)，第二步利用硅烷中剩余的烷氧基和聚乙二醇交聯(lián)，增加鍵合相的親水性，該固定相對(duì)體液中大分子不保留，而保留分析物小分子并進(jìn)行色譜分離，根據(jù)分析物的性質(zhì)，可以選擇含有不同性質(zhì)基團(tuán)的硅烷，合成一系列體液直接進(jìn)樣分析用固定相。適用于體液試樣，如尿、血清、血漿、腦脊髓液等。
文檔編號(hào)G01N30/06GK1084275SQ92110760
公開(kāi)日1994年3月23日 申請(qǐng)日期1992年9月15日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月15日
發(fā)明者朱彭齡, 劉滿(mǎn)倉(cāng), 呂志珍, 朱家亮, 肖禾 申請(qǐng)人:蘭州大學(xué)