專利名稱：適用于診斷肝炎病的dna序列和編碼多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA序列和編碼多肽，其中編碼多肽表示一種可由帶非甲非乙(NonA NonB)肝炎的某些患者體內(nèi)的抗體特異性認(rèn)別的抗原。具體說來，本發(fā)明涉及在丙型肝炎(hepatitis C)病毒的基因組中沒有的核酸序列和編碼多肽?？蓪⒈景l(fā)明的核酸和編碼多肽用于非甲非乙肝炎的各種檢測。
有關(guān)對甲型肝炎(Hepatitis A)和乙型肝炎(Hepatitis B)病毒特異和敏感的免疫診斷檢測方法的發(fā)展導(dǎo)致鑒別出數(shù)種被統(tǒng)稱之為非甲非乙型肝炎(NANBH或NANB肝炎)的綜合癥(由Hollinger綜述的，Non-A Non B Hepatitis.InFields and Knipe，eds.Virology，2nd Ed.New York;Raven Press，pp2239-73，1990)。一種綜合癥已明顯地與輸血或其他經(jīng)皮下處理有關(guān)，稱其為非甲非乙輸血后肝炎(Non-A Non B Post-Transfusion Hepatitis)(NANBPTH)。另一綜合癥流行學(xué)上與糞便-口污染有關(guān)，稱之為腸非甲非乙肝炎。由于未認(rèn)別出感染途徑，而稱第三種綜合癥為散發(fā)性NANBH。分子病毒學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用技術(shù)被用來鑒別一種與NANBPTH有關(guān)的新的病毒因子(丙型肝炎病毒)(Kuo et al.，Science 244362(1989))，以及一種與腸NANBH有關(guān)的新的病毒因子(E型肝炎病毒)(Reyes et al.，Science 247133(1990))。
人們已經(jīng)進(jìn)行過與NANBPTH傳染有關(guān)的，來自濃縮的血液產(chǎn)品或血漿的類似病毒的顆粒的生物物理和生物化學(xué)特征描述。這些研究表明，存在直徑為25-40nm的包封病毒顆粒，若用有機(jī)溶劑處理，其感染性消除(Bradley et al.Gastroenterology 88773(1985))，另外也單獨(dú)觀察到直徑平均27nm的非包封類似病毒，或與上述的包封顆粒相聯(lián)合(Bradley et al.J.Med.Virol.(1979))。使用交叉刺激研究說明不止一種類型的病毒因子可以引起NANBPTH(Bradley et al.，J.Med.Virol.6185(1980);Hollinger et al.，J.Infect.Dis.142400(1980);Yoshizawa et al.，Gastroenterology 81107(1981))。
已經(jīng)表明在受NANBPTH感染的黑猩猩和人血漿中發(fā)現(xiàn)的RNA分子克隆，存在與包封黃熱病病毒或鼠疫病毒的基因組結(jié)構(gòu)相似的約10Kb的病毒基因組(Houghton et al.，EPO申請No.88310922.5(1988);Houghton et al.，EPO申請No.90302866.0(1990);Arima和Fukai，EPO申請No.89309261.9(1989);Choo et al.，Science 244359(1989);Okamoto et al.，Japan J.Exp.Med.60167(1990);Kato et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA879524(1990))，并參見Miller and Purcell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA872057(1990)。稱這種新病毒類型為丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)(HCV)，且最后在約60-80%的NANBPTH患者中發(fā)現(xiàn)了抗該病毒編碼蛋白質(zhì)的抗體(Alter et al.，New Engl.J.Med.3211494(1989);Esteban et al.，New Engl.J.Med.3231107(1990)。Maeno et al.，Nucl.Acid.Res.182685(1990))。還沒有研究出清楚說明HCV為NANBPTH根原與Koch's假設(shè)一致的感染性數(shù)據(jù)，然而，可以得出一個(gè)相關(guān)的論點(diǎn)許多NANBPTH的引起與HCV感染有關(guān)。
雖然已經(jīng)廣泛地接受用HCV作為一種診斷NANBPTH的有力標(biāo)記物，但仍不清楚是否其它病毒因子也能引起這種綜合癥，以及在被認(rèn)為是散發(fā)NANBH的情形中，HCV起什么作用。包括本發(fā)明人之一的(T.A.)的幾個(gè)研究人員已經(jīng)分辨出了編碼與來自NANBPTH患者的血清反應(yīng)的多肽的cDNA序列，該cDNA序列在HCV和其變異體的已知序列中沒有(Arima et al.，Gastroenterology Jpn.24540(1989);Arima et al.，Gastroenterology Jpn.24545(1989);Arima et al.，Gastroenterology Jpn.24685(1989);Arima et al.，Gastroenterology Jpn.25218(1990);Arima和Fukai，EPO申請No.89309261.9(1989))。這些cDNA明顯地不由人基因組編碼，因此對肝炎病態(tài)不具宿主特異性應(yīng)答。雖然已經(jīng)確立了它們在診斷中的效用，但仍不清楚它們的來源和與病程的關(guān)系。
申請人從NANBH患者的血漿成分制備核酸。通過物理和化學(xué)方法，使這些成分富集病毒和類似病毒顆粒。將提取的核酸轉(zhuǎn)變成雙鏈互補(bǔ)DNA(cDNA)并將其導(dǎo)入到λ噬菌體的衍生物中，然后篩選這些含有來自NANBH患者的重組DNA的λ噬菌體，生產(chǎn)能與NANBH患者的血液所含的抗體反應(yīng)的重組編碼蛋白質(zhì)。
發(fā)現(xiàn)稱作20E的重組噬菌體包含編碼多肽序列的重組DNA插入序列，該多肽序列能與NANB肝炎患者中得到的特定血清發(fā)生特異性反應(yīng)。該多肽抗原檢測存在于幾個(gè)NANB肝炎患者血液中的抗體，并看來在該疾病的檢測和篩選中有效用?？寺?0E的核苷酸序列和它編碼的多肽與被認(rèn)為引起大多數(shù)NANB肝炎病例的病毒(即HCV)無關(guān)。另外，看來在人染色體DNA中不含有克隆20E的核苷酸序列。以后的研究結(jié)果表明克隆20E包含在與NANB肝炎而不是丙型肝炎病毒相連系的一個(gè)外部感染因子的染色體中，因此，它可代表在人類患者中傳播NANB肝炎的附加的病原因子或促進(jìn)因子。
本發(fā)明另一方面，申請人描述了各種檢測患者樣品中抗-20E多肽抗體和20E-相關(guān)的核酸的免疫診斷和探針檢測方法。通過在重組噬菌體或重組質(zhì)粒載體相容的宿主細(xì)胞中表達(dá)或通過化學(xué)合成來生產(chǎn)上述的20E多肽。將抗由克隆20E表示的因子的保護(hù)性疫苗配成包括一種或多種在20E多肽中代表的免疫診斷抗原決定基的組合物。此外，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)很容易生產(chǎn)直接抗一種或多種20E多肽的免疫診斷抗原決定基的多克隆或單克隆抗體。上述抗體或其活性片段被用作抗由克隆20E代表的因子的被動免疫試劑。另外，位于本發(fā)明描述的那些DNA序列側(cè)面的DNA序列將在診斷NANBH和其它疾病中有效用。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可以容易地分離出這些附加序列得出克隆20E序列。


圖1(A)從含有用野生型λgt11克隆20E感染的大腸桿菌的細(xì)菌盤中揭下的，并與患NANB肝炎患者處采集的血漿反應(yīng)的膜。通過生色酶反應(yīng)檢測與膜結(jié)合的抗體，得到一個(gè)暗點(diǎn)。
(B)從含有用野生型λgt11感染的大腸桿菌的細(xì)菌盤中揭下的并與如圖1(A)中所述的同樣的血漿反應(yīng)的膜。
圖2(A)在λgt11噬菌體克隆20E中發(fā)現(xiàn)的重組插入片段的DNA序列。
(B)在λgt11噬菌體克隆20E中發(fā)現(xiàn)的重組插入片段的推測氨基酸序列。
圖3(A)用人酪氨酸羥化酶基因的外顯子14連狀結(jié)合的450bp片段探測的BamHI-消化的人胎盤DNA的Southern轉(zhuǎn)移。
(B)用代表克隆20E序列DNA的鏈狀結(jié)合的90bp片段探測的HindⅢ(道1)，EcoRI(道2)，和BamHI(道3)消化的人胎盤DNA的Southern轉(zhuǎn)移。在相同的凝膠中電泳該圖(B)中的DNA，并將其轉(zhuǎn)移到與圖3(A)樣品相同的膜上。
圖4(A)與從Serologicals，Inc購買的來自患者02190D(NANB肝炎)的系列血清樣品反應(yīng)的純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/克隆20E蛋白質(zhì)的Western印跡。星號代表可通過ELISA(Ortho Diagnostics，Inc.)檢測的抗-HCV抗體第一個(gè)變成為可檢測的那份血樣。
(B)Western印跡免疫活性比較經(jīng)純化的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/克隆20E蛋白與上述患者的抗-HCV ELISA反應(yīng)活性(Ortho Diagnostics，Inc.)。
圖5(A)與從Serologicals，Inc.購買的來自患者20830D(NANB肝炎)的系列血清樣品反應(yīng)的純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/克隆20E蛋白質(zhì)的Western印跡。星號代表可通過ELISA(Ortho Diagnostics，Inc.)檢測的抗-HCV抗體第一個(gè)變成為可檢測的那份血樣。
(B)Western印跡免疫活性比較純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/克隆20E蛋白質(zhì)與上述患者的抗-HCV ELISA反應(yīng)活性(Ortho Diagnostics，Inc.)。
圖6(A)與從Serologicals，Inc.購買的患者00269B(NANB肝炎)的一系列血清樣品反應(yīng)的純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/克隆20E蛋白質(zhì)的Western印跡。星號代表可通過ELISA(Ortho Diagnostics，Inc.)檢測的抗-HCV抗體第一個(gè)變成為可檢測的那份血樣。
(B)Western印跡免疫活性比較純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/克隆20E蛋白質(zhì)與上述患者的抗-HCV ELISA反應(yīng)活性(Ortho Diagnostics，Inc.)(N.D＝未做)。
有NANBH診斷效用的多肽以及所代表的對任何其它描述的NANBH沒有可檢測關(guān)系的核酸和氨基酸序列代表著超過現(xiàn)有技術(shù)的顯著進(jìn)步。上述的多肽以及相應(yīng)的核酸對開發(fā)一種完全預(yù)防和診斷NANBH方法的不懈努力極有價(jià)值。本發(fā)明包括上述多肽和其相應(yīng)的核酸序列。
從表現(xiàn)NANBH臨床癥狀的一些患者中得到的匯集血漿單位分離出RNA，在聚乙二醇和氯化鈉/檸檬酸鈉存在下，通過離心處理使該匯集血漿富集病毒和類似病毒的顆粒。從得到的沉淀中提取RNA并將其轉(zhuǎn)變成cDNA，并將該cDNA克隆到噬菌體表達(dá)載體λgt11的EcoRI位點(diǎn)。在大腸桿菌中生長擴(kuò)增重組噬菌體，通過與NANBH患者的血漿衍生的抗體制劑反應(yīng)，免疫篩選所得的文庫以確定NANBH抗原的存在，通過連續(xù)三輪噬菌斑擴(kuò)散和免疫篩選鑒別并純化陽性克隆，“20E”。
在圖2中給出了克隆20E的cDNA插入段的核苷酸序列，以及推斷出的由該插入段編碼的氨基酸序列(后文稱其為“20E多肽”)。該核苷酸序列或氨基酸序列都未表現(xiàn)出與科學(xué)文獻(xiàn)中或各種專利申請中報(bào)告的HCV的核苷酸序列有任何同源性?？寺?0E DNA或氨基酸序列與甲、乙、或丁型肝炎病毒的可獲得序列，或按主要數(shù)據(jù)編入目錄中的其它序列都不表現(xiàn)出任何可檢測出的同源性。結(jié)果，正如與限制性的人基因組DNA的Southern印跡不產(chǎn)生雜交所表明的一樣，克隆20E的核苷酸序列看來不存在于人染色體DNA中。
因此，克隆20E代表一種編碼新多肽的新核酸序列，該新多肽有一個(gè)或多個(gè)由表現(xiàn)NANBH臨床癥狀的患者的抗體識別的抗原決定基。與人基因組DNA不產(chǎn)生可檢測雜交說明由克隆20E的cDNA插入段代表的核酸序列代表外部感染因子基因組部份而不是HCV。因此，該因子可以表示一種引起人類NANBH的附加促進(jìn)因素。
得到的推測的20E多肽的氨基酸序列的長度(26個(gè)氨基酸)，使得在該多肽中不大可能有多于一個(gè)或兩個(gè)NANBH-特異性抗原決定簇。為了進(jìn)一步研究在20E多肽中代表的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇的潛在免疫診斷效用，將插入段亞克隆到表達(dá)質(zhì)粒中并在大腸桿菌中將其表達(dá)為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白質(zhì)。純化GST-克隆20E融合蛋白，并通過Western印跡檢測其對來自附加對照和NANBH患者的血清的免疫反應(yīng)活性。
Western印跡程序是，將GST-克隆20E融合蛋白固定在固相載體(聚二氟乙烯膜)上用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行按大小分級的電泳。然后在能使任何20E多肽特異性(抗-20E)抗體與固定蛋白結(jié)合的條件下，使結(jié)合的蛋白質(zhì)與檢測的血清反應(yīng)。用酶標(biāo)記的信號抗體檢測抗-20E抗體的結(jié)合。該信號抗體含有堿性磷酸酶共軛的山羊抗-人IgG+IgM。與一種對堿性磷酸酶適當(dāng)?shù)纳孜锓磻?yīng)以提供在特定的患者檢測樣品中存在或不存在抗20E抗體的可見指示劑。在該免疫診斷模式中，陽性檢測結(jié)果說明存在夾在固定的GST-克隆20E融合蛋白和信號抗體之間的患者的抗-20E多肽抗體。在沒有抗20E多肽抗體的情況下(陰性檢測結(jié)果)，沒有形成抗原-抗體-信號抗體復(fù)合物，并在上述背景上沒有檢測到生色反應(yīng)。
正如下列提供的實(shí)施例說明的，20E多肽中代表的一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇有對NANBH的標(biāo)記診斷效用。因此，15.5%的慢性NANBH患者和24.3%其它形式NANBH(包括急性，散發(fā)的和供體相關(guān)的NANBH)患者有與20E多肽反應(yīng)的可檢測抗體。相反，71個(gè)人中僅1個(gè)(1.4%)隨機(jī)供血者有上述可檢測的抗-20E抗體。
為了確定患者血清轉(zhuǎn)變成抗-20E多肽狀態(tài)的時(shí)間過程，將Western印跡免疫檢測程序附加于代表三個(gè)NANBH患者一系列采血所得的血清樣品。用市場上買到的HCV ELISA藥盒也可檢測這三組血清的抗-HCV抗體。每組系列采集血樣均表現(xiàn)出以轉(zhuǎn)變成抗-HCV狀態(tài)差不多的轉(zhuǎn)變時(shí)間完成抗-20E多肽狀態(tài)血清轉(zhuǎn)變。雖然差不多，但在三組中有兩組，有關(guān)抗-20E多肽狀態(tài)和抗-HCV狀態(tài)轉(zhuǎn)變時(shí)間是不同的。
這些免疫檢測結(jié)果清楚地說明克隆20E核酸和多肽作為對NANB肝炎病特異性非-HCV標(biāo)記的免疫診斷效用。因此，20E多肽有至少一個(gè)診斷NANBH的抗原決定簇。根據(jù)本文公開的結(jié)果，可以將20E多肽的NANBH-診斷抗原決定簇(一個(gè)或多個(gè))的免疫診斷效用定義為來自NANBH患者血清中的可檢測非-HCV免疫反應(yīng)活性以個(gè)體百分比計(jì)，比來自普通人群的隨機(jī)供血者的血清可檢測性至少高約十倍。有關(guān)抗-20E和抗-HCV狀態(tài)差不多的血清轉(zhuǎn)變參數(shù)說明一種可能的HCV和由克隆20E代表的感染因子的同時(shí)感染。用于構(gòu)建分離克隆20E的噬菌體文庫的血清匯集樣完全來源于人，并未被告之其對NANBH因子特別加以富集。就是說，不一定將該人血清匯集樣分類為“高-滴定度”血清匯集樣。相反通過表達(dá)篩選用于原始分離HCV的文庫是從實(shí)驗(yàn)感染的黑猩猩的高滴定度血清中得到的(Choo et al.，Scieuce 244359(1989))?？赡芸寺?0E是從限于人或至少排除黑猩猩的宿主范圍的因子中衍生而來的，用發(fā)現(xiàn)HCV的方法檢測不到該因子。
在任何使用多肽靶的免疫檢測模式中，20E多肽都是有用的。在該模式中，將20E多肽，20E多肽片段，或與另一分子耦合的20E多肽(或其片段)例如融合蛋白，涂復(fù)于固相基質(zhì)如順磁微顆粒上?？梢杂免g性的或共價(jià)的涂復(fù)方法將多肽連接到固相基質(zhì)上。在抗-20E多肽抗體存在的情況下，經(jīng)保溫階段，用磁分離法從任何未反應(yīng)的抗體中分離出結(jié)合的抗體-20E多肽復(fù)合體。與連有信號酶(如堿性磷酸酶)的抗人抗抗體反應(yīng)，進(jìn)行復(fù)合抗-20E抗體的檢測(正如上面Western印跡模式所述)。當(dāng)用磁分離法將順磁顆粒上標(biāo)記的復(fù)合物分開并洗滌后，加入產(chǎn)生信號的底物。測量到的信號量與樣品中存在的抗-20E抗體量成正比。
在另一修改實(shí)施方案中，可以將本發(fā)明的20E多肽按經(jīng)典酶連免疫吸附檢測(ELISA)法涂復(fù)于微滴平盤孔上，與樣品一起培養(yǎng)，洗滌并加入酶-共軛的抗人抗血清。按徑向分配層析法，也可以用玻璃纖維濾器作為固相基質(zhì)。檢測按常規(guī)進(jìn)行，加入適當(dāng)?shù)牡孜?生色劑并測量所得的產(chǎn)物。有關(guān)ELISA的一般討論參見Langone et al.，Immunological Techniques，Part D Immunoassay.InMethods in Enzymology，P.84(1982)。
適用于本發(fā)明多肽的其它可替換檢測方法包括(但不限于)如上文所述的Western印跡法并參見Towbin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.764350(1979);放射免疫檢測法(Walsh et al.，J.Infect.Dis.21550(1970));競爭檢測法(Diamandis，Clin.Biochem.21139(1988));非競爭檢測法(Crook et al.，J.Gen.Uirol.4629(1980));免疫沉淀法(Tojo et al.，Clin.Chem.342423(1988));點(diǎn)印跡法(Jahn et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA811684(1984));和PCFIA(Jolley et al.，J.Immunol.Meth.6721(1984))。
20E多肽和其片段也有作為預(yù)防、改善或治療NANBH的疫苗的潛在效用。如在下文實(shí)施例4或5中記載的，20E多肽代表的抗原決定簇顯示出能與某些NANBH患者血清中存在的抗體反應(yīng)。因此，很可能20E多肽或其片段，如果需要，與適當(dāng)?shù)妮d體大分子耦合[參見Golub，E.S.ImmunologyA Synthesis(1987)]將在用其免疫的人中產(chǎn)生NANBH-特異性免疫應(yīng)答。可以從重組載體中表達(dá)該20E多肽或其適當(dāng)片段或由化學(xué)方法合成生產(chǎn)，使其成為分離多肽或融合蛋白的成分。為了引發(fā)直接抗由20E多肽代表的病原因子的免疫應(yīng)答，可以與本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的藥物學(xué)上可接受的載體(參見，Golub上文)結(jié)合，給人施用該多肽或融合蛋白。
用已知方法，也可以用20E多肽產(chǎn)生能起被動免疫治療成份作用的物質(zhì)。例如，可以用20E多肽或其片段生產(chǎn)直接抗由20E多肽代表的因子的多克隆或單克隆抗體。直接將其混入藥物學(xué)上可接受的載體中注射到患者的血液中，上述抗體，或其免疫反應(yīng)活性部份可將免疫性賦予20E因子。被動免疫的基本原理是所注射的抗體(不依賴于患者的內(nèi)源性免疫系統(tǒng))結(jié)合于病源因子上有利于失活和去除致病因子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)被動免疫對很多疾病因子來說至少賦予暫時(shí)免疫是有效的。例如，單克隆抗體的被動免疫具有對幾種黃熱病病毒抗性[Schlesinger et al.，Technological Advance in VaccineDevelopment(L.Laskey，ed.)Page 11-20(1988)]。相似地，多克隆抗體的被動免疫具有對猿免疫缺陷病毒類型2的抗性[Putkonen et al.，Nature 352436(1991)]。
用多肽為起始物質(zhì)生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體的方法在科學(xué)文獻(xiàn)中多有記載。例如，可在含結(jié)合到固相上的20E多肽的柱上親和純化用20E多肽免疫的主體的免疫球蛋白部分，提供直接抗20E多肽的多克隆抗體的純化制劑。同樣，可以用20E多肽生產(chǎn)分泌直接抗20E多肽的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。用描述過的已知方法，如Kohler，Science 2331281(1986)，可以生產(chǎn)該雜交瘤，并分離和提純分泌的單克隆抗體。
公開的克隆20E的核酸序列也將用于各種用核酸靶的檢測模式中。如，可以用克隆20E核酸序列作為探針檢測患者血清或組織中克隆20E-相關(guān)的核酸的存在。用適當(dāng)?shù)姆派湫詷?biāo)記(如，32P)或用適當(dāng)?shù)姆欠派湫詷?biāo)記(如，生物素)來標(biāo)記克隆20E序列，或其片段，并將其與來自患者血清或身體組織的擴(kuò)增或未擴(kuò)增的核酸雜交。為將患者血清或身體組織中的核酸擴(kuò)增，可以使用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的任何擴(kuò)增系統(tǒng)。例如，可以合成以公開的克隆20E序列為基礎(chǔ)的引物并將其用于多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)以擴(kuò)增從血清或組織中提取的DNA(或從RNA衍生的cDNA)。在Mullis等人的U.S.專利Nos.4，683，202和4，683，195中描述了完成PCR的各步驟。可以用Guatelli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874(1990)中描述的自我維持序列復(fù)制(3SR)擴(kuò)增在血清或組織中的RNA靶序列。在3SR中，首先合成含噬菌體啟動子的同源cDNA來擴(kuò)增RNA序列，接著消化RNA-cDNA雙鏈的RNA鏈(由于在反應(yīng)混合物中存在RNAase H活性)，并合成長于第一個(gè)cDNA的第二個(gè)DNA鏈以形成DNA雙鏈，用DNA依賴性RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄該DNA雙鏈。然后用轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為底物合成更多的這類cDNA，接著轉(zhuǎn)錄并重復(fù)上述步驟。另一種產(chǎn)生RNA的擴(kuò)增方法叫做轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，首先由Gingeras等人在WO 880617和WO 880729中公開的。與3SR不同，由于沒有外源性RNAase H活性存在以消化RNA-DNA雙鏈的RNA鏈，TAS需要通過變性進(jìn)行鏈分離。就cDNA合成的連續(xù)循環(huán)需要變性交替循環(huán)而言，TAS表面上類似PCR。
可以在原位(如，在組織學(xué)組織切片上)或以提取核酸完成與擴(kuò)增的或非擴(kuò)增的核酸雜交，并用液體閃爍計(jì)數(shù)，放射自顯影，或檢測非放射性標(biāo)記的適當(dāng)技術(shù)來檢測。有關(guān)核酸雜交技術(shù)的綜述參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd.Ed)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)。據(jù)信可以用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可獲得的方法生產(chǎn)相應(yīng)于圖2A中公開的序列的RNA序列，并在適當(dāng)?shù)那闆r下將其用作RNA探針。
按上面所述，可將與靶核酸能形成可檢測雜交的完整克隆20E序列或其任何適當(dāng)診斷片段用于核酸雜交。同樣可知，可以用標(biāo)準(zhǔn)的位點(diǎn)特異性誘變方法或其它技術(shù)(參見，Sambrook et al.，上文)很容易地改變克隆20E序列以便提供一組用于檢測已經(jīng)誘變變異的克隆20E-相關(guān)的NANBH因子的探針。例如，已知許多RNA病毒是高度可變的，必需用上述參考文獻(xiàn)已知方法來提供適于上述變異體最佳檢測的克隆20E-相關(guān)序列。一般在低到中等嚴(yán)緊度洗滌條件下[即，在同時(shí)考慮溫度和鹽濃度的情況下，計(jì)算的較好匹配的20E-20E雜交的解鏈溫度(Tm)大約在20℃-30℃以下;參見Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1982);Sambrook et al.，上文]能與所公開的克隆20E序列雜交的任何核酸序列均具有用作克隆20E代表的因子的診斷探針的潛在效用。
在類似的方法中，根據(jù)遺傳密碼的簡并性，公開的20E核酸序列可以在各密碼子第三位上改變而不改變其編碼的氨基酸序列。另一方面，應(yīng)強(qiáng)調(diào)，在氨基酸序列中的小變化(如取代，增加或缺失)對檢測結(jié)果影響不明顯，因?yàn)楣_的20E多肽代表的抗原決定簇(一個(gè)或多個(gè))沒有被改變到在對20E因子的檢測中，破壞上述所改變的多肽的免疫診斷效用的程度。因此，認(rèn)為在結(jié)構(gòu)上有上述小改變的多肽和相應(yīng)的抗原決定簇本質(zhì)上是與公開的克隆20E核酸序列編碼的多肽和抗原決定簇相似，或等同的。
用標(biāo)準(zhǔn)方法很容易得到位于相當(dāng)于公開的克隆20E核酸序列的基因組序列兩側(cè)的代表基因組序列的其它核酸序列。這樣的序列，無論在20E序列的5′或3′，均可以增強(qiáng)公開的克隆20E核酸序列的診斷效用，或者作為核酸探針可有分離效用。另外，上述序列可以編碼增強(qiáng)公開的20E多肽診斷效用的氨基酸序列，或者可以編碼其它有獨(dú)立免疫診斷效用的NANBH抗原決定簇。鑒別并分離上述側(cè)核酸序列的方法(染色體“爬行”或“走動”)是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的。有關(guān)綜述分離側(cè)面序列的各種方法，參見Sambrook等人上述文獻(xiàn)。例如，可以用公開的克隆20E序列的5′或3′末端部分特異性寡核苷酸探針再篩選上述提及的并在下文實(shí)施例中描述的λgt11文庫。因此，可以分離與原始分離克隆20E重疊的克隆，它將含在公開的克隆20E序列側(cè)面的核酸序列。此外，可以將以公開的克隆20E序列為基礎(chǔ)的寡核苷酸用作引物以生產(chǎn)可從其中分離其它側(cè)面克隆的新cDNA文庫。
如下列實(shí)施例所述，將公開的20E核酸序列克隆在噬菌體和質(zhì)粒載體中，在大腸桿菌(如，其它原核宿主，酵母和其它真核宿主如哺乳動物細(xì)胞)中，從上述載體表達(dá)20E多肽，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說也是可行的(Sambrook et al.，上文)。
可用于亞克隆和/或表達(dá)克隆20E或相關(guān)序列的載體包括這樣一些載體，即在該載體中，DNA序列(如由克隆20E代表的)可以被插入任何能使得插入序列達(dá)到最佳轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯必需的其它元素。上述載體可被轉(zhuǎn)移到上述的一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞類型中并在其中復(fù)制。優(yōu)選在本發(fā)明所用的載體具有某些或全部下列特征(1)擴(kuò)展期間可在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保持;(2)在所需的宿主細(xì)胞中以高拷貝數(shù)增殖;(3)有能啟動插入序列轉(zhuǎn)錄的序列;(4)有編碼可選擇特征如藥物抗性的序列;和(5)有能終止轉(zhuǎn)錄的序列。為能表達(dá)，優(yōu)選的載體包括至少一個(gè)啟動子，至少一個(gè)Shine-Delgarno序列[核糖體結(jié)合位點(diǎn);Shine and Delgarno，Nature 25434(1975)]或類似序列和引發(fā)密碼子，至少一個(gè)終止密碼子，和至少一個(gè)編碼分泌前導(dǎo)序列或信號序列的序列。用科學(xué)文獻(xiàn)中描述的方法可以將任何對克隆20E相關(guān)序列的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯必需的元素加到載體中。在Sambrook等人上文，第1-4，8，9，16和17章中提供了在適宜于真核和原核宿主的載體中克隆并表達(dá)插入序列的一般方法和大量的實(shí)例。酵母載體可包括如Burke等人在Science 236806(1987)中描述的酵母人工染色體載體。
公開的克隆20E核酸序列顯示出沒有經(jīng)典的一致糖基化位點(diǎn)。這說明從真核和其它宿主細(xì)胞表達(dá)的20E多肽應(yīng)該有公開的20E多肽的功能抗原決定簇特征。因此，有關(guān)適當(dāng)宿主細(xì)胞(正如需要特異糖基化特征的各種蛋白所遇到的情形)的不可預(yù)料性不應(yīng)是與20E多肽序列和其相關(guān)序列有關(guān)的一個(gè)因素。
在另外的實(shí)施方案中，可以用已知方法化學(xué)合成克隆20E核酸序列和其片段，以及20E多肽和其片段。有關(guān)核酸化學(xué)合成的綜述參見Narang，Tetrahedron 393(1983)和Itakura et al.，Ann.Rev.Biochem.53323(1984))?？梢杂檬袌錾腺徺I的自動肽合成器如Milligen-Biosearch Model 9600 Peptide Synthesizers化學(xué)合成所需序列的多肽。
將用下列有關(guān)的實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，但其不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)施例1克隆20E的分離和DNA特征描述在從NANBPTH患者匯集血漿中制備的cDNA文庫的免疫篩選中，用下列方法鑒別能與NANBPTH患者血清反應(yīng)的噬菌體克隆(20E)步驟1通過低速離心澄清來自出現(xiàn)NANB肝炎臨床癥狀的個(gè)體的血漿單位以除去血纖維蛋白并將其匯集在一起。以40克/升的濃度將聚乙二醇4000(PEG)加到澄清的血漿中，并在冰上攪拌溶解30分鐘。在4℃以7000×g將懸浮液離心20分鐘，并將沉淀再懸浮于含0.5%檸檬酸鈉的10-30ml 0.5%NaCl中。在4℃將再懸浮的沉淀培養(yǎng)2小時(shí)，然后在4℃以3600×g離心20分鐘。然后從所得的沉淀中提取RNA。
步驟2用異硫氰酸鈲，接著用Chomczynski和Sacchi，Anal.Biochem.162156(1987)描述的酚氯仿，從PEG/NACl沉淀提取RNA。用異丙醇和乙醇將病毒核酸沉淀幾次。用氫氧化甲基汞變性，接著用商業(yè)藥盒(C-Clone Ⅱ Clontech)反轉(zhuǎn)錄來完成轉(zhuǎn)變成cDNA的過程。用S1-核酸酶和EcoRI甲基化酶處理雙鏈cDNAs，并用T4DNA多聚酶切成平整末端。用EcoRI接頭連接后，將cDNA連接到λgt11臂(Stratagene)中，并將其包裝入噬菌體頭(Gigapack Ⅱ Gold;Stratagene)。所得的噬菌體文庫代表約1千萬個(gè)克隆，約66%含插入片段。
步驟3將100ml大腸桿菌菌株Y1090R-培養(yǎng)物在由LB液體培養(yǎng)基組成的培養(yǎng)基中長至600nm波長處光密度為0.5，該LB液體培養(yǎng)基含50μg/ml氨芐青霉素，0.2%W/V麥芽糖和10mM MgSO4。離心沉淀細(xì)菌，并將其再懸浮于9.2ml的冰冷卻10mM MgSO4中。
將各300μl SM緩沖液(50mM Tris-HCl PH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO4W/V明膠)中的代表50，000噬菌斑形成單位的噬菌體懸浮液與各450μl上面制備的細(xì)菌懸浮液混合，并將其在37℃，150rpm攪拌15分鐘。然后將各試管加熱到47℃，并將9ml高質(zhì)量瓊脂(在含50μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中0.75%W/V)加到各個(gè)含噬菌體的細(xì)菌試管中。然后將這些試管中物倒入直徑為150mm，含氨芐青霉素(50μg/ml)的LB瓊脂平盤表面上，使其凝固，并在42℃倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)約3小時(shí)后，出現(xiàn)可見噬菌體斑。然后用已預(yù)先在10mM異丙基硫代-β-半乳糖苷(BRL)中浸過的直徑為137mm的硝化纖維素濾膜覆蓋該培養(yǎng)盤，并使其干燥。在37℃將培養(yǎng)平盤再培養(yǎng)3小時(shí)，用沾墨水的針刺穿膜和菌學(xué)培養(yǎng)基數(shù)次來標(biāo)記膜取向。然后從培養(yǎng)平盤上除去膜，用蒸餾水洗滌，并放置一旁干燥。然后在室溫下將干燥的濾膜放在1×TBS(0.1M Tris PH7.4，0.5M NaCl，0.1%W/V NaN3)中的2%W/V脫脂奶粉的溶液中15-60分鐘培養(yǎng)。
步驟4從三個(gè)懷疑患有NANB肝炎的個(gè)體中匯集血漿(各10ml)，并按如下說明將其預(yù)吸附到細(xì)菌溶菌產(chǎn)物中以8000psi在APV Gaulin擠壓器中，將細(xì)菌細(xì)胞沉淀(從4升培養(yǎng)物中得到的)均漿處理3個(gè)回合制備大腸桿菌Y1090R-溶菌產(chǎn)物。按制造商的說明將溶菌蛋白(120mg)與10ml洗滌過的，活化Sepaharose-4B(Pharmacia)偶合。將偶合的溶菌產(chǎn)物分成兩等份，用5ml 0.1%SDS將第一份處理10分鐘，接著每次用30ml×TBS洗滌3次(柱A)。柱B由未用SDS處理的其余偶合溶菌產(chǎn)物組成。將用于免疫篩選的匯集血漿加到1×TBS中的12ml溶解的大腸桿菌Y1099R-溶菌產(chǎn)物(30mg/ml蛋白)中，該1×TBS含10mM EDTA和2mM苯基甲基磺酰氟(BRL)。在室溫下將混和物振蕩1小時(shí)，然后在7100×g離心10分鐘。使上清液通過上文描述的柱A，并將洗脫液兩次通過上述柱B。在室溫下，將最后一次洗脫液(約45ml)與另外112ml溶解的大腸桿菌溶菌產(chǎn)物(30mg蛋白/ml)一起培養(yǎng)30分鐘。將混合物以7100×g離心10分鐘。用TBS中的960ml 2%W/V脫脂奶粉稀釋40ml上清液(等于10ml未處理的匯集血漿)。
步驟5將步驟3的膜抽吸處理除去牛奶/TBS溶液，并將20ml步驟4的處理過的抗體加到各濾膜上。將膜與抗體溶液在室溫下輕輕振動接著過夜。然后抽吸除去抗體溶液，用TBS/Tween溶液更換6次洗滌膜30分鐘。在含2%脫脂奶粉的1×TBS中以1∶3500稀釋堿性磷酸酶共軛的山羊抗-人IgG/IgM(Jackson Immunoresearch)。在室溫下，將各膜在各20ml的上述稀釋二級抗體上清液中培養(yǎng)2.5小時(shí)，然后用1×TBS/Tweew 20更換6次洗滌。在最后一次洗滌后，將膜在50mM Tris-HCl PH9.5中浸10分鐘。將基質(zhì)溶液(含66μl 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸對-甲苯胺鹽[在DMF中50mg/ml]和88μl氯化氮藍(lán)四唑[在70%DMF中75mg/ml]的PH9.5的590mM Tris-HCl，每膜20ml)加到濾膜上，并培養(yǎng)直到反應(yīng)活性噬菌斑變暗(2-7分鐘)為止。用1%V/V冰乙酸溶液洗滌5分鐘接著用水漂洗而中止反應(yīng)。
反應(yīng)活性噬菌斑識別出為直徑約1mm的黑色污跡圓圈，通常象“炸面包圈”樣子。發(fā)現(xiàn)稱為20E的克隆與NANBH患者匯集血清反應(yīng)。用與膜匹配的菌學(xué)培養(yǎng)盤檢出噬菌體噬菌斑，用Pasteur吸管的寬末端從培養(yǎng)平盤中除去瓊脂糖塊。在含50μl氯仿的1ml SM緩沖液中于4℃過液培養(yǎng)而洗脫塊中的噬菌體。用本實(shí)施例上文所述的三次連續(xù)的免疫篩選循環(huán)富集并純化噬菌體克隆。
將純化的克隆和野生型λgt11分別以每平盤500菌斑形成單位的密度鋪于平盤上，并使其與本實(shí)施例上文所述的NANBH采集的血清反應(yīng)。圖1中表示這些噬菌體噬菌斑的免疫染色顯影。純化噬菌體形式的克隆20E保藏于美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC保藏號No.)。
實(shí)施例2克隆20E的DNA和編碼的氨基酸序列進(jìn)行下列步驟以確定在噬菌體克隆20E中所含的重組插入片段的DNA序列步驟1將由免疫篩選選擇的噬菌體克隆20E的重組DNA插入片段，用位于λgt11的EcoRI克隆位點(diǎn)側(cè)面的引物L(fēng) Ga5′-ACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTA-3′(SEQ ID NO1)，LG25′-GGTAATGGTAGCGACCGGCGCTC-3′(SEQ ID NO2)通過PCR來擴(kuò)增，用該酶將其裂解，克隆到質(zhì)粒pUc19中，然后亞克隆到M13mp 19RF DNA中而定序。根據(jù)商業(yè)藥盒(Sequenase 2.0，United States Biochemical)提供的方法，用通用引物和修飾的T7DNA多聚酶確定插入片段的單鏈DNA(ssDNA)序列。通過堿變性后，測定克隆到質(zhì)粒載體中的用于基因表達(dá)(參見下文實(shí)施例4)的插入片段的序列，以便確定帶給20E免疫反應(yīng)活性的插入片段的取向。
下文圖2復(fù)制由上述方法確定的克隆20E的重組DNA序列，和由它編碼的推測氨基酸序列。序列中沒有經(jīng)典的N-結(jié)合的或O-結(jié)合的糖基化作用位點(diǎn)。
對該DNA和其編碼的蛋白質(zhì)序列分析表明，它們與現(xiàn)有科學(xué)文獻(xiàn)或各種專利申請中報(bào)道的有關(guān)HCV的序列之間沒有可檢測水平的同源性。該克隆20E DNA或氨基酸序列與甲乙，或丁型肝炎病毒的現(xiàn)有序列，與上文Arima等人的文章和專利申請中公開的序列，或與1991，10，8檢索Gen Bank和EMBL數(shù)據(jù)庫中的任何其它序列之間也都不具可檢測到的同源性。
實(shí)施例3克隆20E與人DNA的相關(guān)度為了確定是否在人基因組中含被鑒定為克隆20E的DNA序列，按如下方法進(jìn)行直接DNA∶DNA雜交步驟1用EcoRI，HindⅢ或BamH Ⅰ限制酶消化從市場(Clontech)購買的10微克人胎盤DNA。然后在20V，0.7%瓊脂糖凝膠中電泳消化的DNA樣品。按制造商(Pharmacia-LKB)的說明，用真空印跡系統(tǒng)，將按大小分離的DNA片段從凝膠上轉(zhuǎn)移到Oncor SURE BLOT膜上。
步驟2用下列寡核苷酸引物(A37G)5′-AATAAGCTTGTGACGGTGATTGGGGCAGCAGACA-3′(SEQ ID NO3)，(T39T)5′-TAAGAATTCGAGCTATGCCTCACGCCATCCAGCGCCCCTT-3′(SEQ ID NO4)從0.5μg人胎盤DNA，經(jīng)多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)擴(kuò)增酪氨酸羥化酶基因的外顯子14的片段，作為對單拷貝人基因的陽性對照。
分離出一個(gè)約460個(gè)堿基對的擴(kuò)增帶，然后用HindⅢ和EcoRI將其消化。將消化的DNA亞克隆到HindⅢ/EcoRI消化的pUc19質(zhì)粒中，DNA測序確認(rèn)它是酪氨酸羥化酶基因的一部分。經(jīng)下列方法將上述純化的酪氨酸羥化酶基因自我連接以形成連成一串的DNA用HindⅢ和EcoRI限制核酸內(nèi)切酶消化，從100μg pUC19質(zhì)粒中釋放出基因片段，并在2%瓊脂糖凝膠中電泳從質(zhì)粒DNA中將其分離。
用Vogelstein和Gillespie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76615(1979)的方法從凝膠中洗脫DNA片段。采用乙醇沉淀法濃縮洗脫的DNA，并用分光光度方法定量，用T4DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)方法[Sambrook et al.，上文(1989)]將500ng的量相連形成連成一串的基因片段。同樣，將pUC19中的20E序列切成EcoRI片段并將其連成一串。用大腸桿菌DNA多聚酶的Klenow片段和α-32P標(biāo)記的dATP借助缺口轉(zhuǎn)譯分別標(biāo)記連成串的DNA形成放射性探針[Sambrook et al.，上文(1989)]?；蚱芜B成一串對于提供欲作為缺口轉(zhuǎn)譯底物的足夠長的DNA底物(產(chǎn)生高度特異性反應(yīng)活性的放射性DNA探針的優(yōu)選方法)是必需的。
步驟3用膜批發(fā)商(Oncor)建議的溶液(Hybrisol 1)將含消化的人DNA的膜進(jìn)行預(yù)雜交和雜交。將DNA探針加到塑料袋中所含適當(dāng)?shù)哪ぶ?，其濃度為每分鐘、每毫升雜交溶液中計(jì)數(shù)為1×106。在45℃過夜攪拌培養(yǎng)印跡和探針。
除最后一次洗滌在57℃完成外，按制造商的說明洗滌印跡。在-70℃將干燥印跡于兩個(gè)Dupont Cronex增強(qiáng)屏之間的Kodak Xomat AR診斷膠片上曝光16小時(shí)。按制造商的說明將膠片顯影，示于圖3。
實(shí)施例420E多肽與對照樣和NANBH血清樣的反應(yīng)用EcoRI消化含克隆20E插入片段的質(zhì)粒pUC19，并將20E片段亞克隆到質(zhì)粒載體pGEX-2T的變異體中[Smith and Johnson，Gene 6731(1988)]。用BamHI限制核酸內(nèi)切酶消化打開質(zhì)粒pGEX-2T，以大腸桿菌DNA多聚酶的Klenow片段作用填充懸垂末端，并將平整末端連接在一起構(gòu)建該變異體(稱作pGEX-2Ta)[Sambrook et al.，上文(1989)]。按上述方法，在大腸桿菌菌株DH5α中，從質(zhì)粒pGEX-2Ta表達(dá)由克隆20E編碼的肽，為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白[Smith and Johnson，上文(1988)]。含克隆20E插入片段的質(zhì)粒pGEX-2Ta保藏在美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC保藏號No.)將GST融合蛋白與原用于Western印跡試驗(yàn)分離λgt11-克隆20E噬菌體(見下文)的血清反應(yīng)。該結(jié)果令人驚奇，因?yàn)樵撔揎椀妮d體從分離λgt11插入基因不能產(chǎn)生框架內(nèi)蛋白表達(dá)產(chǎn)物。由于融合前導(dǎo)序列與這些序列的EcoRI插入位點(diǎn)的不正確對應(yīng)排列，在該加工過程中，從λgt11分離的其它插入片段不能在pGEX-2Ta中表達(dá)成蛋白質(zhì)。這些結(jié)果表明，該克隆20E序列是不正常的，即在λgt11中其免疫原表達(dá)在于原λgt11-克隆20E噬菌體中不正常的序列對應(yīng)排列所致。這種不正常的序列對應(yīng)排列可能由于在分子的5′末端存在兩個(gè)EcoRI接頭，而序列對應(yīng)排列的準(zhǔn)確性質(zhì)未予確定。用Abath and Simpson，Peptide Res.3167(1990)的方法純化GST-克隆20E融合蛋白。同樣從不含20E插入片段的未修飾pGEX-2T的細(xì)菌培養(yǎng)物中純化谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶。
用Laemmli不連續(xù)緩沖系統(tǒng)[Laemmli Nature(Lond)227680(1970)]，通過十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)，按兩步完成pGEX谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)20E Western印跡帶的制備。該凝膠包括12%分離凝膠(PH8.8)和4.5%積層凝膠(PH6.8)。將純化的GST-20E抗原上樣，在水浴中煮沸5分鐘的2%SDS，0.125M Tris PH6.8，10%甘油，1%2-巰基乙醇和0.02%焦寧Y顯跡染料中電泳，將樣品分成2×128μl等分(每份2.7μg)，放到兩個(gè)預(yù)備井(各64mm寬)中，并以恒定流電泳直到顯跡染料到達(dá)凝膠的底部。
從分子量的對數(shù)對相鄰5mm泳道上移動的彩色分子重量標(biāo)記(Amersham Corp.Arlington Heights，IL)的電泳遷移率標(biāo)準(zhǔn)圖外推，估計(jì)出GST-20E的表觀分子量，發(fā)現(xiàn)等于預(yù)計(jì)的融合蛋白分子量。在罐裝置(Hoeffer，San Francisco，CA)中，將分離開的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到Towbin等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA764350(1979)]描述的置于Tris-甘氨酸系統(tǒng)中的二氟聚乙烯膜(Millipore，New Bedford，MA)上。轉(zhuǎn)移后，如Johnson等人[Gene Anal.Tech.13(1984)]所述將該膜封閉于等滲緩沖鹽水(IBS;Baxter Scientific Products)的5%脫脂奶粉溶液中。在IBS中簡單地漂洗該膜，切成3mm×120mm的條，然后要么立刻使用，要么在-20℃貯存。將Western印跡條放在各含5%脫脂奶粉的2ml等滲緩沖鹽水的培養(yǎng)容器(Bio-Rad Laboratories)的溝槽中。用無20E插入片段的100μg(50μl-100μl)純化的pGEX GST將對照樣和檢試(20μl)樣預(yù)培養(yǎng)15分鐘預(yù)吸收GST-反應(yīng)抗體。
將處理過的樣品直接加到上述各槽中并在室溫下過夜輕輕攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)后，用含0.01%NaN3的5ml 0.05MTris 3M NaCl PH8.0將各條洗四次持續(xù)5分鐘，接著用只含IBS的溶液5ml再洗滌2次。然后在IBS5%脫脂奶粉溶液(1∶3500)中將上述條與堿性磷酸酶共軛的山羊抗人IgG+IgM(Jackson Immunoresearch，Westgrove，PA)一起培養(yǎng)2小時(shí)。接著，用5ml IBS 0.3%Tween-20將上述條洗滌3次5分鐘。將來自一個(gè)反應(yīng)容器的條(多至25條)轉(zhuǎn)移到一個(gè)平底塑料盒(19×16cm)中，并用0.05M Tris PH9.5，0.05%NaH3(底物緩沖液)洗滌兩次5分鐘。
用Blake等人[Anal.Biochem.136175(1984)]描述的于底物緩沖液中用氮藍(lán)四唑鎓/5-溴-4-氯-吲哚磷酸鹽系統(tǒng)將上述條顯影，并在暗室中于印跡紙上空氣中干燥。用各組樣品進(jìn)行強(qiáng)反應(yīng)活性，弱反應(yīng)活性和陰性對照對比試驗(yàn)。用以免疫篩選池中所使用的血清之一(實(shí)施例1)顯影的對照Western印跡的相對強(qiáng)度來評估臨床樣品的反應(yīng)活性。就檢測的抗克隆20E噬菌體噬菌斑來說，該血清是該池中兩個(gè)具反應(yīng)活性血清之中較弱的一個(gè)。當(dāng)與對照的血清相比時(shí)，鑒定為具反應(yīng)活性的Western印跡有等于或大于20E特異性帶的顯色強(qiáng)度。在下表1中給出了這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表1克隆20E融合蛋白與血清的反應(yīng)人群 反應(yīng)活性隨機(jī)供血者1/17 (1.4%)慢性NANBH 18/116 (15.5%)其它NANBH 9/37 (24.%3)對表1的說明將Western印跡轉(zhuǎn)移物與臨床樣品一起培養(yǎng)，并評估與克隆20E融合蛋白帶(M.W.32，000)反應(yīng)或不反應(yīng)。反應(yīng)活性表示為全部Western印跡檢測中所用的對照血清的相對值。該血清是由噬菌斑生成發(fā)現(xiàn)克隆20E所用的原匯集血清的成分，噬菌斑-壽命檢測中，代表兩個(gè)匯集血清中反應(yīng)活性較弱者。判斷為具反應(yīng)活性的樣品是在著色密度上等于或大于對照血清的。
將來自美國、英國、和日本的調(diào)查者的臨床樣品分成慢性NANB疾病，或其它NANB疾病(包括急性，散發(fā)性，和供體相關(guān)性的)。隨機(jī)供血者來自美國人群。
實(shí)施例520E多肽與NANBH系列血樣的反應(yīng)為確定是在臨床患病期間還是在其后NANBH患者血清轉(zhuǎn)換成抗-20E，使用對谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/克隆20E融合蛋白的Western印跡來檢測代表3個(gè)NANBH患者的系列血樣的血清樣品。按實(shí)施例4中所述處理并檢測這些血清樣品。血清樣品從市場購買(Serologicals，Inc.)，經(jīng)一種商業(yè)檢測法(Ortho Diagnostic System，Inc.)對所買樣品進(jìn)行檢測表明，這些患者是NANBH病后轉(zhuǎn)變?yōu)榭?HCV C-100蛋白的。用市場上購買的HCVELISA藥盒，檢測這三組血清樣品的抗-HCV抗體。在圖4，5，和6中提供這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。每組系列血樣表現(xiàn)出血清轉(zhuǎn)變成抗-20E多肽狀況與轉(zhuǎn)換成抗-HCV狀況其轉(zhuǎn)換日期是差不多的。雖然差不多，但三組樣品的兩組中，有關(guān)抗-20E多肽狀態(tài)和抗-HCV狀態(tài)的轉(zhuǎn)變?nèi)掌谑遣煌摹＜丛谝徊±?，血清轉(zhuǎn)換為抗-20E狀態(tài)日期滯后于血清轉(zhuǎn)換為抗-HCV狀態(tài)一個(gè)取樣期(圖5);而在第二病例中，是血清轉(zhuǎn)換為抗-HCV狀態(tài)滯后(圖6)。
上文的詳細(xì)描述僅供更好地理解本發(fā)明，不背離所附權(quán)利要求的精神和范圍的一些改變對本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員來說是顯而易見的，所以不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。
序列目錄(1)一般資料(ⅰ)申請人Ryan，Terence ESaeed，BadrKieselburg，Mark KByrne，Robert EStevens，Priscilla WArima，TerukatsuTodd，John A(ⅱ)發(fā)明題目適用于診斷肝炎病患的DNA序列和編碼肽(ⅲ)序列數(shù)目7(ⅳ)有關(guān)地址(A)收信人Baxter Diagnositics Inc.
(B)街道One Baxter Parkway，DF2-2E(C)城市Deerfield(D)州Illinois(E)國家美國(F)郵政編碼60015(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release ＃1.0，Version ＃1.25
(ⅵ)該申請的資料(A)申請?zhí)朥S(B)申請日(C)分類號(ⅲ)代理人/代理資料(A)名字Barta，Kent(B)登記號29，042(C)查詢/備審案卷號PA-4171(ⅸ)通訊情報(bào)(A)電話708/948-3308(B)傳真708/948-2642(2)SEQ ID NO1的資料(ⅰ)序列特征(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1ACGACTCCTG GAGCCCGTCA GTA(2)SEQ ID NO2的資料(ⅰ)序列特征
(A)長度23個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2GGTAATGGTA GCGACCGGCG CTC(2)SEQ ID NO3的資料(ⅰ)序列特征(A)長度34個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3AATAAGCTTG TGACGGTGAT TGGGGCAGCA GACA(2)SEQ ID NO4的資料(ⅰ)序列特征(A)長度40個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知
(ⅱ)分子類型其它核酸，合成的寡核苷酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4TAAGAATTCG AGCTATGCCT CACGCCATCC AGCGCCCCTT(2)SEQ ID NO5的資料(ⅰ)序列特征(A)長度78個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型cDNA，對基因組RNA互補(bǔ)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5AATTCCGGGA AGGTAGTGTC AGGTTTTGCG CCCACGCACAAAGCGCCTCA ACGTTCTGTT TTTGCACCGC CGGAATTC(2)SEQ ID NO6的資料(ⅰ)序列特征(A)長度78個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型cDNA，對基因組RNA互補(bǔ)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6
GAATTCCGGC GGTGCAAAAA CAGAACGTTG AGGCGCTTTGTGCGTGGGCG CAAAACCTGA CACTACCTTC CCGGAATT(2)SEQ ID NO7的資料(ⅰ)序列特征(A)長度26個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未知(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)未知(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7Asn Ser Giy Lys Val Val Ser Gly Phe Ala Pro Thr His Lys1 5 10Ala Pro Gln Arg Ser Val Phe Ala Pro Pro Glu Phe15 20 2權(quán)利要求
1.一種純化和分離的DNA分子，包含編碼具有多肽免疫診斷效用的多肽的DNA序列，該序列在序列表中定義為SEQ ID NO∶6。
2.權(quán)利要求1的純化和分離DNA分子，其中所述的DNA序列包含在序列表中由SEQ ID NO5所定義的DNA序列。
3.權(quán)利要求1的純化和分離DNA分子，其中，所述的DNA序列包含編碼多肽的DNA序列，該序列在序列表中定義為SEQ ID NO6。
4.一種純化和分離的DNA分子，包含編碼一個(gè)在氨基酸序列中具有一個(gè)與NANBH-診斷抗原決定簇基本相似的抗原決定簇的多肽的DNA序列，該序列在序列表中定義為SEQ ID NO6。
5.一種純化和分離的核酸，包含一個(gè)在低到中度嚴(yán)緊性洗滌條件下，可與一個(gè)DNA分子雜交的核酸序列，所述的DNA分子選自下列一組序列在序列表中由SEQ ID NO5所定義的DNA序列;和一個(gè)與在序列表中由SEQ ID NO5所定義的DNA序列互補(bǔ)的DNA序列。
6.權(quán)利要求5的純化和分離的核酸，其中，所述的核酸序列包含一個(gè)DNA序列，所述的DNA序列選自下列一組序列在序列表中由SEQ ID NO5所定義的DNA序列;和與在序列表中由SEQ ID NO5所定義的DNA序列互補(bǔ)的DNA序列。
7.權(quán)利要求5的純化和分離的核酸，其中，所述的核酸序列包含一個(gè)RNA序列。
8.一種純化和分離的核酸，包含在低到中度嚴(yán)緊性洗滌條件下可與一個(gè)基因組序列雜交的核酸序列，該基因組序列位于相應(yīng)的在序列表中由SEQ ID NO5定義的DNA序列的基因組序列的側(cè)面。
9.一種多肽，包含具有多肽診斷效用的氨基酸序列，在序列表中由SEQ ID NO6定義。
10.一種多肽，包含具有基本上相似于NANBH多肽中的診斷抗原決定簇的抗原決定簇的氨基酸序列，在序列表中由SEQ ID NO6定義。
11.一種多肽，包含在序列表中定義為SEQ ID NO6的多肽的氨基酸序列。
12.一種包含權(quán)利要求1的DNA序列的載體。
13.一種包含權(quán)利要求4的DNA序列的載體。
14.一種包含權(quán)利要求5的核酸序列的載體。
15.一種包含權(quán)利要求8的核酸序列的載體。
16.一種用權(quán)利要求12，13，14或15的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
17.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是一種原核細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是一種真核細(xì)胞。
19.一種制備一種多肽的方法，該多肽具有在序列表中由SEQ ID NO6所定義的多肽的免疫診斷效用，該方法包括在適于所述多肽表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞;和回收所述的多肽。
20.一種制備一種多肽的方法，該多肽具有在序列表中由SEQ ID NO6所定義的多肽的免疫診斷效用，該方法包括化學(xué)合成所述的多肽。
21.一種診斷NANBH的方法包括用具有在序列表中由SEQ ID NO6所定義的多肽的免疫診斷效用的多肽與來自患者的血清接觸;并確定所述血清是否包括能與所述多肽發(fā)生免疫反應(yīng)的成分。
22.一種篩選輸血血液的方法包括從所述的血液中分離血清;用具有在序列表中由SEQ ID NO6所定義的多肽的免疫診斷效用的多肽與所述的血清接觸;確定所述的血清是否包括能與所述多肽發(fā)生免疫反應(yīng)的成分;和以上述測定為基礎(chǔ)將所述血液分類和處理。
23.一種在人體組織中檢測NANBH因子的基因組存在的方法，包括將人體組織的擴(kuò)增或未擴(kuò)增的核酸與包含權(quán)利要求5的核酸的探針，在能啟動所述探針與所述基因組雜交的條件下接觸;和確定所述的探針是否與所述人體組織的所述核酸雜交。
24.一種預(yù)防，改善或治療NANBH的疫苗，包含一種具有在序列表中由SEQ ID NO6所定義的多肽的免疫診斷效用的多肽，和一種藥物學(xué)上可接受的載體。
25.一種純化和分離的多肽，所述多肽包含一個(gè)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述的抗原結(jié)合位點(diǎn)具有與在序列表中由SEQ ID NO6所定義的NANBH多肽中的診斷抗原決定簇基本相似的抗原決定簇特異性。
26.權(quán)利要求24的多肽，其中，所述的多肽是一種單克隆抗體。
27.一種對抗NANBH被動免疫的組合物，含有權(quán)利要求24的多肽和一種藥物學(xué)可接受的載體。
全文摘要
分離出的新cDNA克隆20E，其特征為它編碼一個(gè)以前未知的，由帶非甲非乙肝炎(NANBH)的特定的患者的血清中的抗體識別的多肽抗原。在丙型肝炎病毒(HCV)的基因組中沒有該核酸序列。在人基因組中也沒有該核酸序列。資料表明，相當(dāng)于克隆20E的RNA序列被包含在一個(gè)外部感染因子的基因組中而不是HCV，因此可以代表一個(gè)附加的病原因子，或者說是人類患者中NANBH流行的散播因子。因此20E核酸和相應(yīng)的多肽及其不同的變異體在各種針對預(yù)防和診斷NANBH的方法中是有用的。
文檔編號G01N33/576GK1080957SQ93102679
公開日1994年1月19日 申請日期1993年2月4日 優(yōu)先權(quán)日1992年2月4日
發(fā)明者T·E·瑞安, B·賽義德, M·K·基塞爾堡, P·E·伯恩, P·W·斯蒂芬斯, T·阿里馬, J·A·托德 申請人:巴克斯特診斷技術(shù)有限公司