專利名稱：用于測定血紅蛋白衍生物的免疫方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于測定血液樣品中一種特殊的血紅蛋白衍生物含量的方法。具體講，本發(fā)明涉及一種用于測定一些血紅蛋白衍生物，例如糖化(glycated)血紅蛋白含量的方法，該方法為了測定血液中血紅蛋白的比例需要單獨測定總的血紅蛋白含量和測定白紅蛋白衍生物的含量。
在一個非酶促反應(yīng)中，被紅細(xì)胞吸收的少量的葡萄糖鍵合到珠蛋白的β鏈的N-末端纈氨酸基上，這取決于血糖水平。形成穩(wěn)定的糖化血紅蛋白衍生物HbA1c(酮胺形式)的反應(yīng)分兩步進行。首先，經(jīng)過一個快速的可逆附著形成不穩(wěn)定的糖化血紅蛋白衍生物(希夫堿)的過程，葡萄糖鍵合到血紅蛋白上。其穩(wěn)定形式是通過一個不可逆的慢重排反應(yīng)(Amadori重排)形成的。在健康代謝的人體中的HbA1c對總血紅蛋白的比是3-6%。在患糖尿病的病人體中，HbA1c所占有的比例在早期的四至十二周中與血液葡萄糖濃度水平成比例增加，最高達(dá)12%，有時甚至高達(dá)20%。特別是對HbA1c與總血紅蛋白含量的相對比例的測量提供了一種監(jiān)測血糖控制過程的總體參數(shù)。
業(yè)已有一系列用于測定糖化血紅蛋白的方法被人們描述過。通常的方法是基于諸如電泳、等電聚焦、比色測定、離子交換和親合色譜這類技術(shù)。在制造專用的多克隆抗體(美國專利4247533)和單克隆抗體(EP-A-0316306，EP-A-0201187)的技術(shù)業(yè)已被公開后，又研究出一系列檢測HbA1c的免疫方法。
EP-A-0185870描述了一種用于測定若干蛋白質(zhì)(包括HbA1c)的方法。所使用的是能識別專門線性肽抗原決定基的單克隆抗體。為釋放出所述抗原決定基定義了一種變性作用，尤其是利用離液序列高的試劑。在溫度低于37℃時，這種變性步驟要用一至幾小時時間，在溫度高于50℃時，要用一分鐘。但同時測量樣品的總血紅蛋白含量這一內(nèi)容未加描述。
在EP-A-0201187中描述了一種測定HbA1c的方法，在該方法中，所使用的抗HbA1c單克隆抗體是通過天然人體HbA1c免疫接種獲得的。該試驗是在4-37℃的溫度下進行的，因而每一保溫步驟最多可能要花72小時。有關(guān)測定同一樣品中的總血紅蛋白和HbA1c含量的內(nèi)容未加敘述。
EP-A-0315864中描述了一種用于測定血樣中HbA1c的相對含量的方法。利用硫氰酸鹽使血紅蛋白變性，并利用外加的氧化劑(最好是鐵氰酸鹽)將其轉(zhuǎn)化為正鐵血紅蛋白?？偟难t蛋白含量以及HbA1c含量可在用這種方法處理的血樣中加以測定。
在EP-A-0407860中描述了用鋰鹽(最好是用硫氰酸鋰)溶解紅細(xì)胞并使血紅蛋白衍生物變性，HbA1c含量可以利用免疫法來測定。為了測定總血紅蛋白，必須額外地加入一種氧化劑，最好是鐵氰酸鹽(它可以將血紅蛋白轉(zhuǎn)化為正鐵血紅蛋白)。
后兩個方法的缺點是為了把血紅蛋白轉(zhuǎn)化為氰基-正鐵血紅蛋白必須使用氰化物。在Clin.Biochem.15(1982)83-88中描述了有關(guān)用十二烷基硫酸鈉代替氰化物測定總血紅蛋白的內(nèi)容。然而，在這一參考文獻(xiàn)中并沒有指出SLS適用于血紅蛋白衍生物(特別是HbA1c)免疫測定中的樣品預(yù)處理。
在EP-A-0184787中，還描述了用于測定血樣中總血紅蛋白的無氰化物試劑。該試劑是一種PH值至少為11.3、最好大于13.7的離子表面活性劑。沒有提及血紅蛋白衍生物的免疫測定。在糖化血紅蛋白衍生物的免疫測定過程中很高的PH值是有害的，因為在強堿介質(zhì)中糖部分可能從血紅蛋白上斷裂下來。若所使用的抗體是加有酶標(biāo)記的，則這種酶反應(yīng)可能被抑制，因為所使用的酶的最佳PH值主要是在6至8之間。高PH值也可能使免疫反應(yīng)受到抑制。
因此，仍然需要一種用于測定血液中血紅蛋白衍生物的免疫測定方法，在該方法中，溶血作用可以在低溫，例如在室溫下進行，這樣，就不需要很長的樣品制備保溫期，并避免使用對環(huán)境有害的試劑(例如氰化物)。此外，為能夠測定血液中血紅蛋白衍生物與血液中總血紅蛋白之比而又無需進一步的溶血制備，在同一溶血產(chǎn)物中同時測定總血紅蛋白應(yīng)該是可能的。本發(fā)明的目的是提供這樣一種用于測定血液中血紅蛋白衍生物的免疫檢測方法。
這一目的是利用本發(fā)明實現(xiàn)的，其特征在所述權(quán)利要求書中有更詳細(xì)的記載。這一目的基本上是依靠用于測定血樣中血紅蛋白衍生物的含量的免疫測定方法達(dá)到的，該方法的特征在于樣品是用含有PH值為5至9.5的離子洗滌劑的溶血劑加以處理，并且所述血紅蛋白衍生物是用免疫法在溶血樣中測定的。
本發(fā)明還涉及一種用于測定血樣中血紅蛋白衍生物和總血紅蛋白含量的方法，該方法包括用含有PH值為5.0-9.5的離子洗滌劑的溶血試劑處理所述血液樣品，在溶血樣品中用光度法測定總血紅蛋白含量，以及在溶血樣品中用免疫法測定血紅蛋白衍生物。
此外，本發(fā)明還涉及一種溶血試劑，該試劑含有PH值為5至9.5的離子洗滌劑，用于免疫法測定血紅蛋白衍生物，如果需要的話，還用于測定總的血紅蛋白含量的血液樣品的樣品制備;本發(fā)明還涉及一種試驗試劑箱，其中包括有溶血試劑。
溶血試劑的作用導(dǎo)致血液樣品中存在的紅細(xì)胞被溶解并將血紅蛋白轉(zhuǎn)化為一種特殊的血紅蛋白發(fā)色團。所形成的血紅蛋白發(fā)色團通過它的特征吸收可以用于測定總血紅蛋白含量并且通過專門的抗原決定基的免疫反應(yīng)可用來測定血紅蛋白衍生物。原則上所有的常規(guī)方法都可用于免疫檢測法，例如夾層試驗、IEMA試驗、沉淀或凝集試驗以及基于FPIA和CEDIA技術(shù)的試驗。除干試驗之外濕試驗也是可行的。
可用于溶血試驗的離子洗滌劑是陰離子洗滌劑[最好是十二烷基硫酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉(DONS)]，陽離子洗滌劑[最好是十四烷基三甲基胺溴化物(TTAB)或十六烷基三甲基胺溴化物(CTAB)]或兩性離子洗滌劑。(最好是Zwittergent3-14)。加到血液樣品中的溶血試劑的量要足以將紅細(xì)胞溶解，并把血紅蛋白轉(zhuǎn)化為將定的血紅蛋白發(fā)色團以及釋放出血紅蛋白衍生物的抗原決定基。血液樣品中的溶血試劑是按1∶10到1∶400的比例加入的，這樣，在得到的混合物中離子洗滌劑的濃度為0.01-5%(按重量計)，最好是0.5-1.5%(按重量計)。溶血試劑的PH值在弱酸到弱堿范圍內(nèi)，PH5.0-9.5之間較為可取，最可取是PH7.4。所有常規(guī)的緩沖劑都可以用于溶血試劑調(diào)節(jié)PH值。最好采用HEPES、MES、TRIS或磷酸鹽緩沖劑。
溶血試劑還可以含有另外一些試劑，例如用于消除免疫反應(yīng)干擾的、氧化血紅蛋白的、除渾濁的、起穩(wěn)定作用的或用于保藏的試劑。包括SDS在內(nèi)的一些洗滌劑可能干擾免疫反應(yīng)。在極少數(shù)情況溶血試劑加入后會出現(xiàn)渾濁和絮凝，這有不同的原因。例如，在低溫下SDS的溶解度極低。出乎人意料的是原來這些干擾可以通過加入非離子洗滌劑來避免，較為可取的洗滌劑是聚氧乙烯醚類，如Brij35和58或Triton×100以及聚氧乙烯酯類，如Myrj52和59或Tween20。非離子洗滌劑通常按照這樣的量加到溶血試劑中，即在加樣后，在所得混合物中其濃度是0.01-5%(按重量計)，而以0.1-0.5%(按重量計)較為可取。
通常使用的另外一種氧化劑是氰鐵酸鹽，例如六氰基高鐵酸鹽(Ⅲ)，也可以包括在溶血試劑中。但是，在與陽離子洗滌劑結(jié)合時，可能會出現(xiàn)沉淀。此外，當(dāng)使用氰鐵酸鹽時必須避光。出人意料的是原來當(dāng)加入防腐劑時，整個反應(yīng)機制是基于硫羥基(例如methylisothiazolone或Bronidox K)的氧化浸蝕，氰鐵酸鹽的加入可以完全忽略不計。這些防腐劑在與陽離子洗滌劑結(jié)合時產(chǎn)生棕綠色血紅蛋白發(fā)色團，它的最大吸收在570nm。這一突出的優(yōu)點首先是這些防腐劑的加入導(dǎo)致將血紅蛋白轉(zhuǎn)化為一種特征血紅蛋白發(fā)色團以及生成溶血試劑的一種良好的防腐劑，其次是溶血作用的終點容易通過顏色由紅到棕綠的變化來識別。在溶血試劑中所使用的防腐劑的濃度范圍為0.005-0.2%(按重量計)，最好是0.01-0.02%(按重量計)。
溶血作用，即借助于溶血試劑將血紅蛋白轉(zhuǎn)化為所述特殊的血紅蛋白發(fā)色團以及為測試血紅蛋白衍生物的樣品制備，是在低溫下，較為可取是在4-37℃，而最好是在室溫(20℃)下，在1至10分鐘后完成。在大多數(shù)情況下對于完成樣品制備來說2分鐘保溫是足夠的。
按這種方式制備的血液樣品隨后按1∶10到1∶100的比例用反應(yīng)緩沖劑稀釋。所有不干擾免疫反應(yīng)的現(xiàn)有緩沖劑都可用作所述緩沖劑。最好采用濃度為10-200mmol/l的MES或HEPES緩沖劑。反應(yīng)緩沖劑的PH值最好是從5.0到8.0。若免疫試劑包括一酶反應(yīng)，則該反應(yīng)緩沖劑最好具有與適于酶反應(yīng)的最佳PH值相對應(yīng)的PH值。此外，反應(yīng)緩沖劑可以已經(jīng)含有一些對于血紅蛋白衍生物試驗所必需的一些試劑，尤其是鍵合配偶體，最好是高度專一的多克隆抗體和單克隆抗體。
出人意外的是原來在這種情況下再加入一種其他的洗滌劑(最好是非離子洗滌劑，如Brij或Myrj)對于為檢測血紅蛋白衍生物(如糖化血紅蛋白)以及為免疫反應(yīng)和避免干擾提供樣品制備的最佳條件是有利的。這種洗滌劑的加入量使得在所形成的混合物中其濃度為0.01-5%(按重量計)，最好是0.5%(按重量計)。
如果除了測定血紅蛋白衍生物之外還要測定同一樣品中的總的血紅蛋白含量，那么要在400-650nm的波長范圍測量吸收度，更好的波長范圍為500-650nm，最好是在540-570nm，為了測定總的白紅蛋白含量最好是在加入所述反應(yīng)緩沖劑之后。在濕試驗情況，是在一比色血中用光度法測定之一波長的吸收度，在干試驗情況，可以在把所形成的混合物涂到一個試驗載體上之后用反射光度法測定該吸收度。
用于檢測總血紅蛋白含量的這樣的試驗載體的結(jié)構(gòu)可以很簡單，因為它不必含任何化學(xué)物質(zhì)。裝在一透明載體薄片上的吸收墊足以滿足簡單的要求。為了改進對試驗條的處理和評價，還可能包括其他的載體層，例如轉(zhuǎn)移墊或劑量墊。
在加入溶血試劑之后，總血紅蛋白含量和血紅蛋白衍生物含量也可以在該樣品的不同部分加以測定。在這種情況，總的血紅蛋白含量是在樣品和溶血試劑混合物的一部分中用光度法測定的，如果必要的話，要在適當(dāng)稀釋后進行。將反應(yīng)緩沖液加到混合物的第二部分中，隨后用免疫測定法測定血紅蛋白衍生物。
從原則上說，所有現(xiàn)有的免疫方法都適合于測定血紅蛋白衍生物，如HbA1c。如上所述，制備針對血紅蛋白衍生物(例如HbA1c)的多克隆抗體和單克隆抗體是可能的，這些抗體專門鍵合到血紅蛋白衍生物的特性抗原決定基上(US4247533，EP-A-0316306以及EP-A-021187)。
免疫試驗變形、標(biāo)記類型以及檢測測量信號的方法是本領(lǐng)域公知的方法。例如酶標(biāo)記的夾層試驗(ELISA)、IEMA試驗程序、RIAs、沉淀和絮凝試驗以及均勻免疫測定法，如CEDIA
、EMIT或FPIA都是合適的。
在濕法試驗中，血紅蛋白衍生物的免疫測定最好按照TINIA技術(shù)來進行，因為在這種情況分離步驟是不必要的。一種分析物專用抗體以及作為凝集試劑的多半抗原(polyhapten)加到樣品中。由載體物質(zhì)，如清蛋白、葡聚糖或IgG構(gòu)成多半抗原，一些特定的抗體可以健合的抗原決定基偶合于這些載體物質(zhì)之上。因為抗體沉淀只有經(jīng)過多半抗原才能發(fā)生，可用濁度測定法或比濁測定法測定的濁度的增加值可以利用減少該樣品中的分析物含量來獲得。
在反應(yīng)緩沖劑中最好已經(jīng)含有血紅蛋白衍生物專有抗體。加入反應(yīng)緩沖劑后，首先用光度法測定所得到的混合物中的總血紅蛋白含量。所述沉淀反應(yīng)是通過加入含有多半抗原的溶液來啟動的。在短暫的保溫期(通常五分鐘就夠了)在適當(dāng)?shù)牟ㄩL(波長范圍在340-600nm，比較可取，最好是在340nm)測量所產(chǎn)生的濁度，并由此測量血紅蛋白衍生物的濃度。因為測量總的血紅蛋白含量是在500-650nm(最好是在546或570nm)波長范圍進行的，所以這兩種測量彼此互不干擾，因此可以在相同的反應(yīng)溶液中在一個比色皿中同時進行。
當(dāng)制備多半抗原溶液，即多半抗原或糖基化蛋白或多肽的液體蓋侖制劑時，人們并清楚原來這種溶液在磷酸緩沖液中是不穩(wěn)定的，所述的磷酸緩沖液通常是在PH值為7.0-7.5的范圍內(nèi)使用并可導(dǎo)致糖蛋白在長期貯存過程中發(fā)生分解。關(guān)于糖基化蛋白在磷酸緩沖液中不穩(wěn)定這一內(nèi)容，例如在Ahmed等在j.Biol.Chem.261(1986)4899-4894的文章中已被公開。通過使用濃度為5-200mmol/l。最好是20-50mmol/l;PH值為5.0-8.0，最好在6.0-6.5之間的MES緩沖劑并同時加入EDTA或等效的復(fù)合試劑(較為可取的濃度范圍為1-50mmol/l，最好是0.1-20mmol/l)來達(dá)到使糖基化多肽、蛋白質(zhì)和多半抗原穩(wěn)定的目的。按照濃度為0.1-2%、最好是1%的條件加入牛血清蛋白(BSA)進一步增強了所述多半抗原溶液的穩(wěn)定性。這種多半抗原在4℃的溫度下可存放12個月以上而不會觀察到多半抗原或糖基化蛋白或多肽有明顯的不穩(wěn)定的跡象。在35℃溫度下存放3個星期時，信號的降低只是原始吸收信號的15-20%。
以干試驗形式對血紅蛋白的衍生物進行免疫測定最好是根據(jù)IEMA試驗技術(shù)。在將反應(yīng)緩沖劑加入溶血血樣之后，加入專用的酶標(biāo)記抗體。在一個優(yōu)選的實施例中，這種抗體已存在于所述反應(yīng)緩沖溶液中。在短期保溫后，將這種混合物加到試驗載體上。游離的酶標(biāo)記抗體被俘獲在抗原決定基的基質(zhì)，即一些抗原決定基(一些特定的抗體可以鍵合于其上)可以耦合于其上的試驗載體區(qū)之上。在另外的一個區(qū)，即試驗區(qū)，血紅蛋白衍生物與酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物通過使一合適的酶底物轉(zhuǎn)化利用反射光度法加以測定。所述底物可以存在于該試驗區(qū)或通過使試驗區(qū)與另外一個含有該底物的區(qū)相接觸來獲得。
以試驗箱的形式采購對本發(fā)明的方法來說所必要的試劑是適宜的，所述試驗箱除去溶血試劑之外還包括至少二個單獨的包裝形式的其他的溶解形式的或冷凍干燥形式的或涂到一個試驗載體上的一些試劑。
本發(fā)明借助以下一些例了來加以闡述。
例1在一個濕試驗中同時測量總的血紅蛋白和HbA1c這些實驗可以在the Boehringer Mannheim GmbH的Hitachi717上進行。在波長546nm處用光度法測量總血紅蛋白含量。根據(jù)TINIA試驗技術(shù)在波長340nm處用比濁測量法來完成對HbA1c的免疫測定。所有的測定和培育都在37℃下進行。
使用以下一些溶液。
溶血試劑20mM NaPO4緩沖液1.0%SDS0.1%疊氮化鈉
0.02%六氰基高鐵酸鉀(Ⅲ)0.5%Brij35反應(yīng)緩沖劑20mMMES緩沖劑，PH6.0150mM氯化鈉3.0%PEG60000.5%Brij350.1%牛血清蛋白0.1%疊氮化鈉10mMEDTA6mg/ml PAB<HbA1c>S-IgG(DE)(抗HbA1c的多克隆羊AB)100μg/ml MAB<HbA1c>M-IgG(DE)(抗HbA1c的單克隆鼠AB)多半抗原溶液20mMMES緩沖劑，PH6.0150mM氯化鈉6.0%PEG60000.5%Brij350.1%牛血清蛋白25μg/ml 多半抗原HbA1c-β-1-4(Cys，MHS)-BSA 18∶1
按100∶1的比例將溶血試劑加到血液樣品中并在25℃下保溫2分鐘。將250微升反應(yīng)緩沖劑加到5μl溶血樣品中，4分鐘后在波長546nm處測量總血紅蛋白的吸收度(A1)。一分鐘后波長340nm處測量吸收度(A2)，隨后用滴管加入50μl多半抗原溶液，并保溫5分鐘，接下去在波長340nm處測量濁度(A3)。
為測定HbA1c的值(克/分升)，將吸收度差△A＝A3-K.A2對HbA1c濃度作圖并用圖解法加以測量。
K＝體積校正因子＝ (樣品體積+反應(yīng)緩沖劑體積)/(總體積)由常數(shù)因子K乘以A1(K＝血紅蛋白發(fā)色團的摩爾消光因子×稀釋因子)計算總血紅蛋白濃度。具有一已知血紅蛋白和HbA1c含量的EDTA全血用作校正標(biāo)準(zhǔn)。為了建立起一條校正曲線，以不同量的溶血試劑稀釋EDTA全血。
在

圖1和圖2中以圖示方式給出了所述校正曲線。在圖1中，以總血紅蛋白濃度對A1作圖，給出一線性關(guān)系。這樣，在計算時可以乘以一個常數(shù)因子。在圖2中，以吸收度差△A＝A3-KA2對HbA1c含量作圖。
在進一步的一些實驗中，首先用滴管將多半抗原溶液加到溶血血樣中，經(jīng)過5分鐘保溫后，通過加入含有專門抗體的反應(yīng)緩沖劑啟動沉淀反應(yīng)。與以上提到過的首先加抗體、而后再加多半抗原的方式相比較，這種滴加順序使得HbA1c測定靈敏度明顯降低(圖3)。
例2用于測定總血紅蛋白和HbA1c的試驗條把300μl溶血試劑加到30μl全血中，在20℃保溫10分鐘。所述溶血試劑由0.18%SDS溶液(被緩沖保持PH為7)構(gòu)成。
為了測定總血紅蛋白，將32μl溶血血樣涂到一個試驗條上，該試驗條的結(jié)構(gòu)如圖4所示。它僅由一個未經(jīng)處理的玻璃纖維劑量墊(1)、一個未經(jīng)處理的玻璃纖維轉(zhuǎn)移墊(2)、未經(jīng)處理的聚酯纖維(3)和一個透明的聚碳酸酯薄片(4)構(gòu)成。該試驗條不含其他的化學(xué)藥品。利用這一試驗程序可以在波長576nm處非常準(zhǔn)確地測量血樣的總血紅蛋白含量。
于是，獲得了低于2.5%的偏差系數(shù)(表1)。
表1總血紅蛋白的測定在每一種情況由10個單獨的測量值計算CV。
血紅蛋白濃度CV[g/dl][%]14.11.017.52.513.71.914.71.8為了測定HbA1c濃度，將1200μl反應(yīng)緩沖劑加到32μl溶血樣品中并保溫10分鐘。反應(yīng)緩沖劑由100mM Hepes(PH7.4)、100mM NaCl和0.1% Brij 35(含有MAB-酶共軛體)構(gòu)成。將32μl的這種混合物涂到試驗條上(如在圖5中所示)。游離的抗體一酶共軛體被捕獲在一抗原決定基基質(zhì)(11)上。在鄰近區(qū)域，即在轉(zhuǎn)移墊上，在含有底物的底物墊(13)與轉(zhuǎn)移墊(12)接觸后借助于該底物的反應(yīng)用反射光度法測定HbA1c抗體一酶復(fù)合物(表2)。
表2利用一試驗條測定HbA1c濃度在每一種情況都由10個單獨的測量值計算CV。
HbAIC濃度 CV[g/dl][%]0.86.81.15.41.46.0例3各種離子洗滌劑對測定HbA1c的影響這些試驗按例1中所述那樣進行。溶血劑具有如下組成20mM NaPO4緩沖劑，PH7.20.1%疊氮化鈉0.02%六氰基高鐵酸鉀(111)0.5%Brij35表3中所列的離子洗滌劑在其中所述的那些相應(yīng)的濃縮物中都存在。
在TTAB和CTAB的情況，在溶血劑中不包含六氰基高鐵酸鉀(111)，因為這種鹽與這些洗滌劑一起沉淀了。
所述反應(yīng)緩沖劑以及多半抗原的組成與例1相同。
HbA1c的含量為3.2g/dl的標(biāo)準(zhǔn)液被用作血液樣品。所有被試驗的離子洗滌劑都導(dǎo)致細(xì)胞的溶解和釋放抗原決定部位。陰離子洗滌劑SDS和陽離子洗滌劑TTAB和CTAB證實了它們是最適合的。
例3HbA1c測定在溶血試劑中各種離子洗滌劑的影響。
在波長340nm處測定吸收度。
例4HbA1c測量的動態(tài)測量范圍對Brij 35濃度的依賴關(guān)系所述那些試驗是按例3中所述條件進行的。在溶血試劑中始終使用1%的SDS。在反應(yīng)緩沖劑中Brij 35的濃度在表中所述的范圍內(nèi)變化。使用例3中所述的HbA1c標(biāo)準(zhǔn)作為樣品。
通過加入0.1%的Brij35已經(jīng)把測量范圍從對照的47mA增加到233mA。Brij35的較為可取的濃度是0.1-1.0%。
表4在反應(yīng)緩沖劑中各種Brij濃度對HbA1c測量的影響在波長340nm處測定吸收度。
例5在反應(yīng)緩沖液中各種洗滌劑對HbA1c的影響這些試驗的進行類似于例4。表5中所述的那些洗滌劑被用在反應(yīng)緩沖液中。所述動態(tài)測量范圍的擴展主要靠加入Brij35、56和58，Myrj52和59，然而其他的非離子洗滌劑(例如Triton)和兩性洗滌劑(例如Zwittergent·3-14)與對照試驗相比也顯示出很積極的影響。
表5在反應(yīng)緩沖劑中洗滌劑的影響
例6同時測量具有特殊的棕綠色血紅蛋白發(fā)色團的總血紅蛋白和HbA1c所述這些試驗是在the Boehringer Mannheim GmbH的Hitaehii717上進行的。在波長570nm處用光度法測定總血紅蛋白含量。HbA1c的免疫測定是根據(jù)TINIA試驗技術(shù)通過在波長340nm處的測定濁度來進行的。所有的測量和保溫都是在37℃的溫度下進行的。
使用以下溶液溶血試劑20mM NaPO4緩沖劑，PH7.41.0%十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)0.01%methylisothiazolone0.02% Bronidox
K0.5%Brij3510mMEDTA反應(yīng)緩沖劑20mMMES緩沖劑，PH6.0150mM氯化鈉3.0%PEG60000.5%Brij35
0.01%methylisothiazolone0.02% Bronidox K1.2mg/ml PAK<HbA1c>S-IgG(DE)抗HbA1c的多克隆羊AB)多半抗原溶液20mMMES緩沖劑.PH6.0150mM氯化鈉6.0%PEG60000.5%Brij3520μg/ml聚米抗原溶血試劑是按100∶1的比例被加入血液樣品中并在25℃溫度條件下保溫2分鐘，將250μl反應(yīng)緩沖液加到1.0μl溶血樣品中。4分鐘后在波長570nm處測量總血紅蛋白吸收度(A1)。一分鐘后在波長340nm處測定吸收度(A2)，接下去用滴管滴加50μl多半抗原溶液并保溫5分鐘。而后，在波長340nm處測量所述濁度(A3)。
為了測量HbA1c的值(單位為g/dl)，用吸收度之差△A＝A3-KA2相對于HbA1c的濃度作為并用圖解法測量。
K＝體積校正因子＝ (樣品體積+反應(yīng)緩沖劑體積)/(總體積)
由常數(shù)因子K乘以A1來計算總血紅蛋白的濃度(K＝血紅蛋白發(fā)色團的摩爾消光系數(shù)×稀釋因子。在圖6中給出了特征吸收光譜。具有已知的血紅蛋白和HbA1c含有的EDTA全血用作校正標(biāo)準(zhǔn)。為了完成一條校正曲線要用不同數(shù)量的溶血試劑稀釋EDTA全血。
在圖7和8中以圖示法顯示所述校正曲線。在圖7中，用總血紅蛋深度對A1作圖。這就產(chǎn)生了一個線性關(guān)系。因此，操作者在計算中可以乘以一個常數(shù)因子K，在圖8中用吸收度差△A＝A3-KA2相對于HbA1c含量作圖。
權(quán)利要求
1.用于測定血液樣品中血紅蛋白衍生物含量的方法，其中(a)該血液樣品用含有PH值為5至9.5的離子洗滌劑的溶血試劑進行處理，以及(b)用免疫法在溶血血液樣品中測量血紅蛋白衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述血液樣品在溫度4至37℃條件下用溶血試劑進行處理最長時間為10分鐘。
3.如權(quán)利要求1和2之一所述的方法，其中溶血試劑還含有非離子洗滌劑。
4.如權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其中含有非離子的或兩性的洗滌劑的反應(yīng)緩沖劑被加到溶血樣品中，并且在所生成的混合物中用免疫法測定血紅蛋白衍生物。
5.如權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其中血紅蛋白衍生物是HbA1c。
6.用于測定血液樣品中血紅蛋白衍生物含量和總血紅蛋白含量的方法，其中(a)所述血液樣品用含有PH值為5-5.9的離子洗滌劑的溶血試劑進行處理;(b)在溶血樣品中測定總血紅蛋白含量，以及(c)在溶血樣品中用免疫法測定血紅蛋白衍生物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中通過測量所述特定的血紅蛋白發(fā)團的的特征吸收度來測量總血紅蛋白含量。
8.如權(quán)利要求6和7之一所述的方法，其中所述溶血試劑還含有非離子洗滌劑。
9.如權(quán)利要求6-8之一所述的方法，其中含有非離子的或兩性的洗滌劑的反應(yīng)緩沖劑被加到所述溶血樣品中并在所生成的混合物中測定總血紅蛋白和血紅蛋白衍生物。
10.含有PH值為5-5.9的離子洗滌劑的溶血試劑。
11.如權(quán)利要求10所述的溶血試劑，其中它還含有非離子洗滌劑。
12.如權(quán)利要求10或11之一所述的溶血試劑，其中包括一種適當(dāng)?shù)难趸瘎┗蚍栏瘎渥饔脵C理是基于巰基的氧化腐蝕。
13.如權(quán)利要求10-12之一所述的溶血試劑用于所述血紅蛋白衍生物的免疫測定或用于同時測定樣品中血紅蛋白衍生物和總血紅蛋白含量。
14.用于免疫測定血紅蛋白衍生物的試驗箱，包括至少二個單獨的包裝，其中之一裝有如權(quán)利要求10-12之一所述的溶血試劑，另一個裝有另外一種混合物，該混合物包括有免疫測定血紅蛋白衍生物所必須的一些試劑。
15.如權(quán)利要求14所述的試驗箱，其中對于免疫試驗所必須的一些試劑被涂到一試驗載體上。
16.穩(wěn)定糖基化蛋白質(zhì)、多肽或多半抗原溶液的方法，其中使用PH值5.0-8.0的MES緩沖劑作為緩沖劑并且該溶液含有EDTA。
17.如權(quán)利要求16所述的穩(wěn)定該溶液的方法，其中加有BSA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于測定血液樣品中特殊的血紅蛋白衍生物的含量的方法。具體地說，本發(fā)明涉及一種用于測定血紅蛋白衍生物(例如糖化血紅蛋白)含量的方法，該方法需要單獨測定血紅蛋白衍生物，以便測定血液中衍生的血紅蛋白的比例。本發(fā)明還涉及一種用于這一方法的適合的溶血試劑。
文檔編號G01N33/531GK1081765SQ9310403
公開日1994年2月9日 申請日期1993年3月4日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月5日
發(fā)明者J·卡爾, L·克爾舍, E·施奈德 申請人:曼海姆泊靈格股份公司