專利名稱：單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維酶標抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶標抗體的制備方法，特別是單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維酶標抗體的制備方法。
周圍神經(jīng)斷傷后，感覺束與運動束難以快速、準確鑒別，從而限制了縫合的準確性，也一定程度上困擾著神經(jīng)外科的進步，術(shù)后優(yōu)良率無法明顯提高。目前，采用的物理和化學方法進行術(shù)中鑒別，但這些方法不夠理想、實用。因此，有必要提供一種鑒別單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維的定性方法。
本發(fā)明目的是提供一種可以定性鑒別單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維酶標抗體的制備方法;利用酶標抗體鑒別單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維的方法，該方法操作簡單，易于觀察，顯色迅速，實用性強，特異性強。
為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它包括以下步驟(1)制備人感覺(或運動)神經(jīng)抗原乳劑在15倍手術(shù)顯微鏡下抽取人體的單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維，以Hank′S液體洗掉血細胞，將神經(jīng)纖維研磨成漿狀物，其濃度為25mg/ml-50mg/ml，神經(jīng)纖維漿狀物與弗氏佐劑按1∶3(體積比)加壓混合成油包水乳劑，液氮儲存?zhèn)溆?(2)將抗原乳劑免疫動物制備抗體分三次注射，其時間間隔及用量分別為第一次，4-8ml，滴后第二次注射用量3-5ml，一周后第三次注射，用量為3-5ml，第三次注射后二周，抽血檢測IgG含量;(3)用SephadexG200層析，提純抗體;(4)按改良戊二醛二步法將上述動物血清與辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)。
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例1在15倍手術(shù)顯微鏡下分段抽出神經(jīng)纖維，用Hank′S液體洗掉血細胞，將神經(jīng)纖維研磨成漿狀物，其濃度為25mg/ml，漿狀物與弗氏佐劑以1∶3(體積比)加壓混合，制成油包水的人感覺神經(jīng)及運動神經(jīng)抗原乳劑，液氮儲存?zhèn)溆?將抗原乳劑注入羊腹腔內(nèi)，第一次注射6ml，3周后第二次注射4ml，1周后第三次注射4ml，抽血檢測IgG，其含量為2.94g/l;將羊血清與辣根過氧化物酶交聯(lián)，其步驟包括(a)，將60mg辣根過氧化物酶(HRP)溶于1mlPH6.8/0.2M磷酸鹽緩沖液(PBS)中，逐滴加入2.5%GA(戊二醛)溶液1ml，置室溫18小時后，裝入透析袋在生理鹽水中透析，除去GA;(b)，透析袋內(nèi)液體置稱量瓶中，加入PH9.5/1M碳酸鹽緩沖液1ml，4℃攪拌24小時，(c)，加入0.2M賴氨酸1ml，封閉被GA激活的酶的殘基，室溫2小時后，裝透析袋內(nèi)，在PH7.2/0.15MPBS中4℃透析過夜(d)，透析袋內(nèi)液體在電磁攪拌下滴加飽和硫酸銨，于4℃冰箱中靜置1小時后，以4000rpm離心15分鐘，棄上清，沉淀用半飽和硫酸銨洗滌二次，溶于PH7.2/0.15MPBS中以同樣的PBS4℃透析2-3天，至無MH4+為止，(e)，取出透析袋內(nèi)液體以4000rpm離心30分鐘，取上清液，測定效價、分裝、冰凍保存?zhèn)溆谩?br> 上述制備方法得到的酶標抗體，用于鑒別感覺神經(jīng)或運動神經(jīng)的方法如下將待染組織片段置入試管中，加入上述酶標抗體血清1ml，在37-38°溫箱中溫育，時間為25分鐘，溫育時間也可以長一些，例如55分鐘，115分鐘，取出待染組織，用PH7.2/0.15M的磷酸緩沖液沖洗掉未反應(yīng)的酶，加入底物1%鄰聯(lián)甲苯胺(OT)(其中含1%雙氧水，臨用前現(xiàn)配)，作用后5分鐘后，，加入2MH2SO4終止反應(yīng)。手術(shù)顯微鏡下觀察結(jié)果，這種酶標抗體特異性強，感覺神經(jīng)迂羊抗人感覺神經(jīng)酶標抗體與底物顯蘭色，與運動神經(jīng)不顯色，運動神經(jīng)迂羊抗人運動神經(jīng)酶標抗體與底物顯色，與感覺神經(jīng)不顯色。
本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明提供的酶標抗體分裝后，可較長時間保存，使用方便，采用本酶標抗體鑒別感覺神經(jīng)或運動神經(jīng)的方法，優(yōu)于現(xiàn)有的其他方法，現(xiàn)有的膽堿酶組織化學染色法，操作復雜，時間較長，準確性差，臨床應(yīng)用受到限制，本鑒別方法操作簡單，易于觀察(肉眼或顯微鏡下觀察)，敏感性高，特異性強，手術(shù)醫(yī)師術(shù)中可親自觀察。
權(quán)利要求
1.單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維酶標抗體的制備方法，其特征在于它包括(1)制備人感覺(或運動)神經(jīng)抗原乳劑在15倍手術(shù)顯微鏡下抽取人體的單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維，以Hank/s液體洗掉血細胞，將神經(jīng)纖維研磨成漿狀物，其濃度為25mg/ml-50mg/ml，神經(jīng)纖維漿狀物與弗氏佐劑以1∶3(體積比)加壓混合，制成油包水的人感覺神經(jīng)及運動神經(jīng)抗原乳劑，液氮儲存?zhèn)溆茫?2)將抗原乳劑免疫動物制備抗體分三次注射，其時間間隔及用量分別為第一次4-8ml，三周后第二次注射，用量3-5ml，一周后第三次注射，用量為3-5ml，第三次注射后二周，抽血檢測IgG含量；(3)層析、提純抗體；(4)按改良戊二醛二步法將上述動物血清與辣根過氧化物酶(HRP)交聯(lián)，其步驟是(a)，將60mg辣根過氧化物酶(HRP)溶于1mlPH6.8/0.2M磷酸鹽緩沖液(PBS)中，逐滴加入2.5%GA(戊二醛)溶液1ml，置室溫18小時后，裝入透析袋在生理鹽水中透析，除去GA；(b)，透析袋內(nèi)液體置稱量瓶中，加入PH9.5/1M碳酸鹽緩沖液1ml，4℃攪拌24小時，(c)，加入0.2M賴氨酸1ml，封閉被GA激活的酶的殘基，室溫2小時后，裝透析袋內(nèi)，在PH7.2/0.15MPBS中4℃透析過夜；(d)，透析袋內(nèi)液體在電磁攪拌下滴加飽和硫酸銨，于4℃冰箱中靜置1小時后，以4000rpm離心15分鐘，棄上清，沉淀用半飽和硫酸銨洗滌二次，溶于PH7.2/0.15MPBS中以同樣的PBS4℃透析2-3天，至無MH4+為止；(e)，取出透析袋內(nèi)液體以4000rpm離心30分鐘，取上清液，測定效價、分裝、冰凍保存?zhèn)溆谩?br> 2.一種按權(quán)利要求1所述制備方法獲得的酶標抗體對感覺(或運動)神經(jīng)的鑒別方法，其特征在于它包括將待染組織片段置入試管中，加入酶標抗體血清1ml，在37-38°溫箱中溫育，時間為25分鐘，取出待染組織，用PH7.2/0.15M的磷酸緩沖液沖洗掉未反應(yīng)的酶，加入底物1%鄰聯(lián)甲苯胺(OT)(其中含1%雙氧水，臨用前現(xiàn)配)，作用5分鐘后，加入2MH2SO4終止反應(yīng)，以肉眼或顯微鏡下觀察結(jié)果。
全文摘要
一種單純感覺(或運動)神經(jīng)纖維酶標抗體的制備方法，它包括制備人感覺(或運動)神經(jīng)抗原乳劑，將抗原乳劑免疫動物制取抗體，按改良戊二醛二步法將上述動物血清與辣根過氧化物酶交聯(lián)。本方法制得的酶標抗體分裝，可放置較長時間，使用方便。使用時，將神經(jīng)抗原、抗體反應(yīng)，溫育，溫育后取出待染組織，經(jīng)緩沖液沖洗掉未反應(yīng)的酶，加入底物使之反應(yīng)、顯色，即可鑒別出感覺(或運動)神經(jīng)，敏感性高，特異性強，操作簡單，易于觀察(用肉眼或顯微鏡下觀察)。
文檔編號G01N33/68GK1080399SQ9310486
公開日1994年1月5日 申請日期1993年4月29日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月29日
發(fā)明者于昌玉, 胡玉弘 申請人:豐寧滿族自治縣醫(yī)院