專利名稱：血小板抗原抗體反應(yīng)的指示試劑、其制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血小板抗原抗體反應(yīng)的指示劑、其制備方法及其應(yīng)用方法。
準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)使地測(cè)定血小板抗原、抗體對(duì)研究血小板血型及血小板抗體的檢出，對(duì)免疫性血小板疾病的診斷、治療等方面都起到了很關(guān)鍵的作用。目前，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，一般采用血凝、補(bǔ)體結(jié)合、抗人球蛋白消耗、免疫熒光、放射免疫、5-羥色胺釋放、酶聯(lián)免疫等方法來測(cè)定血小板抗原和抗體。但這些方法存在著或是儀器復(fù)雜和操作困難的問題，或是對(duì)試劑及實(shí)驗(yàn)條件要求苛刻，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)率低及穩(wěn)定性差等問題，這給臨床推廣應(yīng)用帶來了困難。
1987年研究成功的固相血小板免疫血清學(xué)試驗(yàn)(SPISA)在血小板抗原、抗體檢出等都起到了很大的作用，但由于SPISA中的指示系統(tǒng)試劑系由抗人IgG和抗IgG抗D致敏的紅細(xì)胞組成，其配制過程要求高，且不易長(zhǎng)期保存，必須在試驗(yàn)中臨時(shí)配制，這對(duì)SPISA的推廣使用造成了一定的障礙。為了使SPISA試驗(yàn)成為一種簡(jiǎn)易、快速的血小板免疫血清學(xué)技術(shù)，亟待研制出一種新的指示試劑以替代SPISA中的指示系統(tǒng)試劑，這樣可使SPISA法達(dá)到一個(gè)全新的、更高的水準(zhǔn)，成為一種簡(jiǎn)易、快速和準(zhǔn)確的血小板免疫血清學(xué)技術(shù)，從而具備了臨床實(shí)用的價(jià)值。
為了推廣普及血小板血清學(xué)試驗(yàn)在臨床診斷、治療與輸血上的應(yīng)用，本發(fā)明者在簡(jiǎn)易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)技術(shù)(SEPSA)領(lǐng)域進(jìn)行了長(zhǎng)年不懈的研究，現(xiàn)研制出指示血小板抗原抗體反應(yīng)的指示試劑-SEPSA-抗Ig指示細(xì)胞。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有快速、簡(jiǎn)易、敏感、穩(wěn)定、特異性高和實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)的，用于致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)技術(shù)(SEPSA)中的指示試劑SEPSA-抗IgG指示試劑。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供SEPSA-抗IgG指示試劑的制備方法。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供SEPSA-抗IgG指示試劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是通過以下構(gòu)思來實(shí)現(xiàn)的一種指示試劑，它包括1～10%(體積)的羊紅細(xì)胞懸液，經(jīng)最終濃度為0.5～2%的戊二醛溶液固定及1-10mg/dl鞣酸溶液處理，再加等體積的10-150mg/ml抗人IgG抗體溶液致敏后，得到0.1-0.2%(體積)SEPSA-抗IgG指示試劑。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種指示試劑的制備方法，它包括(1)向1～10%羊紅細(xì)胞懸浮液中加入戊二醛溶液;
(2)取2～5%(1)中所得的懸液與1mg/dl鞣酸溶液混合;
(3)加入與(2)懸液等體積的10～150mg/ml抗人IgG抗體致敏1～2小時(shí)。
(4)需要時(shí)，用0.01M，pH7.2PBS時(shí)以上各步驟產(chǎn)物進(jìn)行洗滌。
較為優(yōu)選的是，(1)步驟中所加入的戊二醛溶液最終濃度為懸液的0.5～2%(體積)。
本發(fā)明的再一個(gè)方面涉及SEPSA-抗IgG指示試劑的用途，將0.1～0.2%(體積)指示試劑按該技術(shù)領(lǐng)域人員所熟知的方法制成試劑盒來測(cè)定血小板抗原和抗體及檢出血小板血型。
抗人IgG抗體的制備人γ-球蛋白血清通過DEAE-SephadexA50(瑞典Pharmacia產(chǎn)品)層析，得到人IgG抗原，免疫羊或兔，獲得單價(jià)抗人IgG抗體。
需要時(shí)，用CNBr-Sepharose4B柱(瑞典pharmacia產(chǎn)品)進(jìn)行親和層析，獲得高純度的抗人IgG抗體。


圖1是SEPSA-抗IgG指示試劑的組成及作用原理圖。圖中1.羊紅細(xì)胞2.羊抗人IgG3.血小板抗體4.血小板若血小板上存在抗血小板抗體，則2的Fab端與3的Fc端結(jié)合，指示細(xì)胞向孔底移動(dòng)被阻止，而復(fù)蓋在固定的血小板單層上(陽性結(jié)果)。無抗血小板抗體存在，則指示細(xì)胞向孔底移動(dòng)不受阻，從而聚集在孔底中央，成為細(xì)胞扣(陰性結(jié)果)。
以下將結(jié)合實(shí)施例本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述。
實(shí)施例1取適量羊紅細(xì)胞，用0.01M、pH7.2PBS洗滌3次，加入上述pH7.2PBS以配成10%懸浮液，加入最終濃度為2%的戊二醛溶液固定，在室溫下放置1小時(shí)后，固定細(xì)胞用0.01M、pH7.2的PBS洗滌4次，加入上述pH7.2PBS以配成5%戊二醛固定的羊紅細(xì)胞懸浮液，向內(nèi)加入1mg/dl的鞣酸室溫下處理10分鐘左右。向內(nèi)加入等體積的前述制得的抗人IgG抗體溶液(其濃度為150mg/ml)在室溫下致敏1小時(shí)，用0.01M，pH7.2的PBS洗滌3次，加入PH7.2PBS以配制成0.1%的SEPSA-抗人IgG指示試劑。
實(shí)施例2除了用最終濃度為0.5%的戊二醛溶液代替實(shí)施例1中的2%戊二醛溶液來固定羊紅細(xì)胞外，其它采用與實(shí)施例1相同的方法，可制得最終濃度為0.2%的SEPSA-抗人IgG指示試劑。
實(shí)施例3
重復(fù)實(shí)施例1中的固定羊紅細(xì)胞的步驟，只是將戊二醛固定的羊紅細(xì)胞懸浮液配成2%濃度，重復(fù)鞣酸處理步驟后，加入等體積的10mg/ml提純的抗人IgG抗體溶液，致敏2小時(shí)，洗滌3次后，制得最終濃度為0.15%的SEPSA-抗人IgG抗體指示試劑。
試驗(yàn)1.指示試劑敏感度的測(cè)定使用被動(dòng)凝集法(PHA)測(cè)定SEPSA的指示系統(tǒng)與SPISA的指示系統(tǒng)的敏感度，結(jié)果如下表所示
結(jié)果顯示SEASA-抗IgG抗體指示試劑的IgG最小感度為30ng/ml，而SPISA法檢出IgG最小感度為250ng/ml。
2.指示試劑的保存期和試驗(yàn)的重復(fù)性測(cè)定將一份抗YuKa血清、另一份抗YuKb血清置-30℃保存，抗IgG指示試劑從制備用于開始每2個(gè)月用上述-30℃保存的二份血清進(jìn)行SEPSA間接測(cè)定法，測(cè)定抗體效價(jià)變化，結(jié)果表明，保存一年的SEPSA-抗IgG指示試劑穩(wěn)定敏感性無變化。
臨床試驗(yàn)1.選經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室確診的ITP患者99例，SLE患者17例以及各種血小板減少癥患者275例，使用實(shí)施例1制得的SEPSA-抗IgG指示試劑，采用SEPSA直接和間接測(cè)定法對(duì)上述391例患者進(jìn)行血小板抗體的檢測(cè)，結(jié)果如下表所示
表2SEPSA法對(duì)ITP和SLE等患者PAIgG和血清抗血小板抗體的測(cè)定疾病例數(shù)直接法(PAIgG)間接法(血清中抗體)陽性數(shù)陽性%陽性數(shù)陽性%ITP999292.99090.9SLE171376.51482.4血小板減少癥2759434.22.用實(shí)施例2制得的SEPSA-抗IgG指示試劑采用SEPSA直接測(cè)定法及間接測(cè)定法對(duì)經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)室確診的ITP60例，其中男性9例，女性51例，年齡7歲～52歲;MF18例，其中男性4例，女性14例，年齡14～39歲;AA患者10例，其中男性4例，女性6例，年齡14-27歲;SLE38例，男性3例，女性35，年齡17～29歲。進(jìn)行檢查，結(jié)果如下表所示。
表34種疾病的陽性率與其血小板計(jì)數(shù)的關(guān)系病種例數(shù)陽性百分率陽性患者陰性患者P值例數(shù)血小板計(jì)數(shù)(×109/1) 血小板計(jì)數(shù)(109/1)ITP615691.8%33.8±13.259.1±17.5<0.05SLE403177.5%67.7±11.593.4±17.9<0.05MF181372.2%47.6～98.374～127.3<0.05AA10440%50.5～97.156.8～104>0.05在臨床使用中，SEPSA-抗IgG直接指示反應(yīng)系統(tǒng)，不需要臨時(shí)配制，保存期達(dá)一年，從而提高了本試驗(yàn)的穩(wěn)定性、敏感性及實(shí)用性，具有操作簡(jiǎn)單(省去了3個(gè)操作步驟)更省時(shí)間(比原來方法減少1個(gè)小時(shí))對(duì)緊急情況下血小板輸注前的配合試驗(yàn)作用尤為突出，是一項(xiàng)易于一般實(shí)驗(yàn)室和血庫能常規(guī)采用的血小板血清學(xué)技術(shù)，因此，SEPSA比原來的SPISA更有推廣意義。
本發(fā)明的指示試劑，可應(yīng)用于血小板抗原、抗體地研究，檢測(cè)血小板同種及自身抗體，進(jìn)行血小板交叉配合試驗(yàn)，具有快速、簡(jiǎn)易、敏感、穩(wěn)定、特異性高及實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的SEPSA-抗IgG指示試劑已制成試劑盒，保存期一年(4℃下保存)。另外，使用本發(fā)明的指示試劑進(jìn)行SEPSA試驗(yàn)時(shí)不需要特殊的儀器和設(shè)備，重現(xiàn)性好，是一種理想、實(shí)用的測(cè)定血小板抗原抗體的方法。
權(quán)利要求
1.一種指示試劑，其特征在于它包括1～10%(體積)的羊紅細(xì)胞懸液，經(jīng)最終濃度為0.5～2%的戊二醛溶固定及1-10mg/dl鞣酸溶液處理，再加等體積的10-150mg/ml抗人IgG抗體溶液致敏后，得到0.1～0.2%(體積)SEPSA-抗IgG指示試劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的指示試劑，其特征在于其中SEPSA-抗IgG指示試劑的濃度為0.1%(體積)。
3.一種指示試劑的制備方法，其特征在于它包括(1)向1～10%羊紅細(xì)胞懸浮液中加入戊二醛溶液;(2)取2～5%(1)中所得的懸液與1mg/dl鞣酸溶液混合;(3)加入與(2)懸液等體積的10～150mg/ml抗人IgG抗體致敏1-2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于其中步驟(1)在室溫下進(jìn)行1小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于其中戊二醛的濃度占懸浮液的0.5～2%。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于其中步驟(2)進(jìn)行10分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于各步驟完成后，用0.01M、pH7.2的PBS進(jìn)行洗滌。
8.一種如權(quán)利要求1所述的指示試劑的用途，其特征在于將該試劑制成試劑盒來測(cè)定血小板抗原和抗體及檢出血小板血型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種指示血小板抗原抗體反應(yīng)指示試劑、其制備方法及其用途、該指示試劑系通過向1～10％羊紅細(xì)胞懸浮液中加入戊二醛溶液固定，再與鞣酸溶液混合，然后加入等體積的10—150mg/ml抗人IgG抗體致敏1—2小時(shí)而制得了SEPSA—抗IgG指示試劑。該試劑可用于簡(jiǎn)易致敏紅細(xì)胞血小板血清學(xué)技術(shù)來測(cè)定出血小板抗原和抗體及檢出血小板血型。
文檔編號(hào)G01N33/96GK1096375SQ9310745
公開日1994年12月14日 申請(qǐng)日期1993年6月11日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月11日
發(fā)明者劉達(dá)莊, 包于勤, 陸萍, 王健蓮, 吳國光 申請(qǐng)人:上海市血液中心