專利名稱：同時監(jiān)測多個擴增反應并對其進行分析的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸(DNA或RNA)擴增反應的檢測，更確切地說，是涉及同時實時監(jiān)測多個核酸擴增反應。本發(fā)明還涉及利用累積的數(shù)據(jù)測定一種或多種混合物中的靶核酸序列起始濃度數(shù)量并在反應動力學基礎上監(jiān)測多種擴增反應條件下的效果的方法。
人們已知各種檢測核酸擴增反應的方法。例如，已知的大量檢定法是測定聚合酶鏈反應(PCR)中起始DNA模板的數(shù)量。一些方法涉及在溫度熱循環(huán)之末檢測PCR產(chǎn)物，并使該檢測水平與起始DNA濃度相聯(lián)系。這種利用PCR典型地進行的“終點”分析反映了靶DNA的存在與否，但一般不能提供一種檢測DNA靶起始數(shù)量的適用方法。
其它的測定法包括應用一種競爭性擴增反應產(chǎn)物，其模板以已知濃度在熱循環(huán)前加至反應混合物中。在競爭性產(chǎn)物方案中，利用凝膠電泳檢測擴增反應的等份試樣。檢測靶特異性的和競爭性的PCR產(chǎn)物的相對含量，再用該比值計算靶模板的起始數(shù)量。靶特異性產(chǎn)物與競爭特異性產(chǎn)物的比值越大，則起始DNA的濃度越高。
除了需要諸如雜交或凝膠電泳這類“下游”加工處理外，這些其它的測定法更多地局限于動力學范圍(即對靶核酸濃度范圍的靈敏度)。在競爭物測定中，當靶DNA或加入的競爭物DNA的量遠遠超過對方時，對模板濃度差別的靈敏度將受到損害。檢測終產(chǎn)物含量的測定法之動力學范圍也可能被限定在一個選定的循環(huán)數(shù)，這時一些反應可以達到產(chǎn)物產(chǎn)生的“平臺”水平。因而這些反應中起始模板水平的差別不能很好地被反映出來。而且，在檢測到的產(chǎn)物含量間的微小差別會對起始模板濃度的估計產(chǎn)生很大的改變，導致因可變的反應條件、供樣的變化或抑制劑的存在而產(chǎn)生極不精確的結(jié)果。
PCR反應條件的最優(yōu)化典型地是通過檢測不同條件對終產(chǎn)率的影響及PCR產(chǎn)物特異性來完成的。為了獲取整個擴增反應過程中的信息，將許多復制樣品置于熱循環(huán)儀中，以使在不同的溫度循環(huán)時可從熱循環(huán)儀中取出各個樣品。被取出的試管然后經(jīng)凝膠電泳進行分析以了解循環(huán)數(shù)的作用。正如從本文的描述中顯而易見的，這種優(yōu)化既復雜又耗時，因為它需要大量的樣品操作步驟及后續(xù)的電泳分析。
任何企圖大規(guī)模(如臨床上)應用的測定不僅應該可行，而且應該盡可能地簡化以便于其自動化。因此，需要有一種收集指示核酸擴增反應數(shù)據(jù)的裝置和方法，例如能用于定量測定樣品的起始濃度和優(yōu)化反應的條件，并能提供可靠的結(jié)果及適于自動化。
本發(fā)明的目的是提供一種核酸擴增反應檢測方法和裝置，它能夠同時實時地監(jiān)測多個擴增反應混合物的擴增反應，并因此克服現(xiàn)有技術中存在的問題和不足。
根據(jù)本發(fā)明，上述目的是借助一個其特征在于包括下列組成部分的裝置來實現(xiàn)的一個具有其中形成了多個凹陷的導熱構(gòu)件的熱循環(huán)儀;
一個用于同時檢測由所說凹陷發(fā)射出的光的傳感器。
在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的裝置還進一步包括一個光源，它在光學上與所說的熱循環(huán)儀相連，并將光線分散到具有所說凹陷的導熱構(gòu)件的一部分上。
在另一個本發(fā)明裝置的優(yōu)選方案中，所說的熱循環(huán)儀的導熱構(gòu)件上的凹陷是通過其表面形成的，用于接納含有核酸擴增反應混合物的反應管;所說的傳感器是與上述導熱構(gòu)件在光學上相聯(lián)的成像裝置，用于將該反應管置于所說導熱構(gòu)件的凹陷中時形成上述表面和反應管的像。
在本發(fā)明裝置更進一步優(yōu)選的實施方案中，所說的熱循環(huán)儀導熱構(gòu)件中形成有多個凹陷，適于接納核酸擴增反應混合物，該裝置進一步包括位于所說導熱構(gòu)件上方并與所說熱循環(huán)儀相聯(lián)的套殼;
用于在所說套殼中朝所說凹陷發(fā)光的光源;
位于套殼中所說凹陷上方的雙色鏡，它透射第一波長的光而反射不同于第一波長的第二波長的光;并且所說的傳感器用于接受由所說雙色鏡的第二表面反射的光。
在本發(fā)明裝置的進一步優(yōu)選的實施方案中，所說的熱循環(huán)儀導熱構(gòu)件形成了多個凹陷，并適于接納包括核酸序列和熒光結(jié)合劑的核酸擴增反應混合物，該裝置進一步包括位于所說導熱構(gòu)件上方并與所說熱循環(huán)儀相聯(lián)的套殼;
在所說套殼中發(fā)光的光源;
位于所說套殼中的傳感器;
位于所說套殼中所說凹陷上方的雙色鏡，當將含有熒光結(jié)合劑的核酸擴增反應混合物置于導熱構(gòu)件上形成的一個凹陷中并使之暴露于激發(fā)光源的光線下時，雙色鏡將透射相當于激發(fā)光源產(chǎn)生的光波的波長的光，并反射相當于由所說混合物發(fā)射的熒光波長的光，所說的雙色鏡的取向是能在所說凹陷和所說傳感器之間形成光路。
在本發(fā)明裝置的一個實施方案中，利用最初導入每一擴增反應混合物中可檢測熒光染料熒光的增加，CCD攝像機可同時檢測進行的多個聚合酶鏈反應中每一反應的雙鏈DNA(dsDNA)的積累。所說的熒光由結(jié)合雙螺旋DNA的熒光染料產(chǎn)生。該實施方案有利于消除對光纖管的需要以及與將光纖和各個反應混合物相耦合所帶來的問題。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，光學系統(tǒng)將光源的激發(fā)光移至作為本裝置一部分的熱循環(huán)儀中被擴增的多個反應混合物中，該光學系統(tǒng)要這樣構(gòu)造使它以均勻的方式給反應混合物提供激發(fā)光。這就是說，該光學系統(tǒng)允許激發(fā)光被基本均勻地分散在熱循環(huán)儀的熱交換器上，以使每一種擴增反應混合物都接受基本相同量的激發(fā)光。
利用本發(fā)明的裝置能夠收集熒光數(shù)據(jù)，并用于定量測定靶核酸序列的起始含量。在進行定量測定的優(yōu)選方法中提供了多個擴增反應混合物。一種擴增反應混合物具有未知濃度的特異性核酸序列。另外的反應混合物包括具有不同的但卻是已知濃度的相同特異性核酸序列。已知和未知核酸濃度的擴增反應混合物并行地進行多次循環(huán)的熱循環(huán)。實時地監(jiān)測由反應混合物發(fā)出的熒光，并確定每一反應混合物發(fā)出某一強度值的熒光所需的循環(huán)數(shù)。將能達到某強度值的未知核酸濃度混合物所需的循環(huán)數(shù)與能達到某強度值的已知核酸濃度混合物所需的循環(huán)數(shù)相比較，得到未知濃度的混合物中所說特異性核酸序列的起始含量。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，因為擴增反應是被實時地監(jiān)測的，所以靈敏度范圍達到至少6個數(shù)量級的靶核酸濃度是可能的。另外，可以獲得對在40，000個細胞等同物的復合基因組DNA背景中少至100ssDNA模板的靈敏度。
本發(fā)明進一步還有利于提供處理熒光數(shù)據(jù)以可靠地分析不同反應條件對擴增反應動力學影響的方法。因為多個擴增反應同時被監(jiān)測，所以可以迅速地確定許多不同反應變量的影響。這對于優(yōu)化擴增反應條件以得到最佳產(chǎn)率和效率是有用的。
實時監(jiān)測還產(chǎn)生能檢測PCR的部分抑制的情況的優(yōu)點，這種部分抑制能極大地影響精確定量測定的能力。如

圖10D所示，這些抑制情況可由其反應過程檢測，使得這些樣品可被重新純化并再次測試。另外，有可能導致樣本中不存在靶核酸這一錯誤結(jié)論的完全性抑制也能被檢測出，因為存在這樣的可能性，甚至連不含靶DNA的PCR也將由于非特異性擴增反應產(chǎn)物而在給定足夠的循環(huán)下產(chǎn)生熒光。如果由預定的循環(huán)不能看見熒光，則可推斷存在抑制劑。
本發(fā)明進一步的優(yōu)點在于免除了在擴增反應結(jié)束時進行額外耗時的操作以確定多個反應的產(chǎn)率的需要。因此，例如可以避免需要后續(xù)的雜交或凝膠電泳。
盡管在圖2和圖3中說明的本發(fā)明的非光纖實施方案具有如上所述的許多優(yōu)點，但傳感器(作為該傳感器最好是視頻攝像機)應定位在與導熱構(gòu)件中的反應混合物相距相當遠之處，以最大程度地減少視差。因此，為了提供均勻的光照和避免傳感器視覺上的干擾，光源也應與導熱構(gòu)件中的反應混合物相距較遠。這種安排一般需要一個相當大小的空間，從而又需要使本發(fā)明裝置配有一個完整的暗室。然而，許多臨床實驗室沒有暗室，或者沒有額外的空間用于構(gòu)建暗室。盡管在臨床實驗室容易見到的X光室能夠給激發(fā)光和熒光發(fā)射的光路提供一個適宜的環(huán)境，但這些X光室內(nèi)的空間基本上完全由X光設備占據(jù)。
根據(jù)本發(fā)明進一步的實施方案，將激發(fā)光和熒光感受結(jié)構(gòu)合并入本發(fā)明的裝置中以致于激發(fā)光和熒光發(fā)射的光路能夠折轉(zhuǎn)，從而使裝置更緊湊并使得被包圍在不透光環(huán)境中的光路簡化。利用這種方式，本發(fā)明裝置易于在工作臺上使用而無需暗室。
根據(jù)上述實施方案，用于同時監(jiān)測多個核酸擴增反應的裝置包括一個具有導熱構(gòu)件的熱循環(huán)儀，所說的導熱構(gòu)件包括所形成的用于接納核酸擴增反應混合物多個凹陷。在導熱構(gòu)件上有一個套殼以形成一個不透光室。光源用于在套殼室內(nèi)發(fā)光以激發(fā)置于其中的擴增反應混合物，雙色鏡置于套殼內(nèi)的凹陷的上方。雙色鏡透射具有第一波長的光而反射具有不同于第一波長的第二波長的光。在優(yōu)選實施方案中，所說的鏡子是低通雙色鏡(low pass dichroic mirror)。所說的雙色鏡的構(gòu)造是這樣的，對相當于光源產(chǎn)生的光波波長而言它是透明的或能透射的，并且在暴露于激發(fā)光時它反射具有相當于由擴增反應混合物發(fā)出的熒光波長的光。另外，也可以選擇使用高通雙色鏡(high pass dichroic mirror)。在這種情況下，雙色鏡反射相當于光源產(chǎn)生的光波波長的光，并且在暴露于激發(fā)光時是透明的或透射相當于由擴增反應混合物發(fā)出的熒光波長的光。傳感器也用于在套殼中感受擴增反應混合物發(fā)出的熒光。在用低通雙色鏡的情況下，傳感器用于接受雙色鏡反射的熒光。然而，在用高通雙色鏡的情況下，傳感器與光源的設置位置相反。
以這種安排，激發(fā)光源和傳感器可與導熱構(gòu)件較近地放置，例如相距6-12英寸，以使激發(fā)光源與熒光發(fā)射的光路占有較小的空間。這種安排的緊湊性便于在套殼中封閉住光路，該套殼與熱循環(huán)儀相聯(lián)以有效地形成一個對于激發(fā)光和擴增反應混合物發(fā)射光的不透光室或暗室。利用這種方式，本發(fā)明的裝置幾乎隨處可用，無需給裝置配備暗室。套殼進一步還有利于防止外來光傳至傳感器，所說的外來光來自例如由裝置所用雙色鏡發(fā)出的光和與熱循環(huán)儀及計算機設備相關的LED(發(fā)光二極管)。
將傳感器與放置核酸擴增反應混合物的導熱構(gòu)件靠近放置的進一步優(yōu)點在于能夠降低對傳感器靈敏度的要求。因為將傳感器移至距導熱構(gòu)件更近，由反應混合物發(fā)出的光和到達傳感器的光的強度則增加。據(jù)此，當如優(yōu)選實施方案中利用CCD攝像機型傳感器時，可用具有可接受的低光響應和低熱噪音的廉價CCD攝像機以代替在靈敏度要求更高時通常需要的較昂貴的冷卻型CCD攝像機。
使光源與反應混合物凹陷靠得很近也具有優(yōu)點。通過將光源移至更靠近反應混合物凹陷，到達置于凹陷中反應混合物的激發(fā)光的強度增加，由此提高了熒光發(fā)射的強度。利用這種方式，較小濃度的靶序列可在熱循環(huán)的較早期被檢測出。此外，通過熒光強度的某種加強就可以利用具有更窄通頻帶的濾光器而換取更好的波長分辨率。利用這種方式，可檢測更寬范圍的波長，并能區(qū)分具有非常相近波長的各個標記。
根據(jù)上述實施方案的另一方面，把一個快門與光源相聯(lián)，間歇地使反應混合物在激發(fā)光下曝光。最好是將快門定時，使它在通常顯示最強熒光的退火/延伸階段使混合物在激發(fā)光下曝光。這種構(gòu)組方式減少了混合物或樣本在激發(fā)光下的曝光，所說的激發(fā)光因非?？拷鼘針?gòu)件而可能非常強。通過最大程度地減少樣品在一般為紫外光組也可為其它波長的光的激發(fā)光下的曝光，提高了樣品的穩(wěn)定性，因而使快門改善了系統(tǒng)性能。另外，強烈的激發(fā)光能引起樣品的光失敏(photo-deactivation)，這一現(xiàn)象通常被稱為“漂白”。
根據(jù)上述實施方案的另一方面，把一向場透鏡置于雙色鏡和傳感器之間，以便最大程度地減小穿過其間的視場的視差。
本發(fā)明進一步的有利特征是包括一個加熱窗，它緊靠導熱構(gòu)件上方，實際上能夠置于裝有擴增反應混合物的試管上。加熱窗允許光從中透過，又能防止反應管散熱，這有助于維持混合物所需的熱循環(huán)溫度分布并最大地減少回流。根據(jù)優(yōu)選實施方案。加熱窗維持在變性溫度上，一般約為95-105℃。
濾光器或濾光器輪最好與傳感器相聯(lián)，以使傳感器能選擇性地檢測不同波長的光。濾光器也能阻止激發(fā)光到達傳感器上。通過應用多個濾光器(它們可設在一個濾光器輪上)，濾光器在特定的退火/延伸階段中易于變換，以使得能監(jiān)測例如不同的均質(zhì)核酸酶探針(如下所述)發(fā)射的不同波長。因此，可以監(jiān)測指定樣品中發(fā)射的不同波長和核酸序列，并確定靶序列的存在。
另外，系統(tǒng)的高靈敏度允許對所產(chǎn)生的熒光進行非常精確的檢測，這種檢測是應用例如Gelfand等人的美國專利US 5，210，015中所述的均勻測定系統(tǒng)進行的，所引專利文獻并入本文作為參考。所說的測定系統(tǒng)利用核酸聚合酶5′→3′核酸酶活性裂解由被雜交探針的靶雙鏈退火的和帶標記的寡核苷酸，并釋放出帶標記的寡核苷酸片段以用于檢測。該測定特別適用于在相同的擴增反應混合物中檢測多個靶核酸。在有非特異性擴增反應產(chǎn)物時這類探針也用于證實靶核酸的存在。
均勻性測定應用這類探針，其熒光通常由熒光能量轉(zhuǎn)移(或FET)至第二標記而淬滅。DNA聚合酶的5′核酸酶活性使熒光團與探針和淬滅劑分隔開，破壞FET并恢復熒光。檢測這種變化不需處理，它可以用包含了雙色鏡的本發(fā)明監(jiān)測裝置觀察到。這些探針如果用不同的熒光團標記的話，可用于檢測多個靶核酸。
以下是用于本說明書中的術語。所附的定義是有助于公開而非限制本發(fā)明。
術語“靶核酸序列”是指純化或部分純化的待擴增核酸。
術語“擴增反應混合物”是指含有用于擴增靶核酸的各種試劑的水溶液，包括酶、緩沖水溶液、鹽、擴增反應引物、靶核酸和三磷酸核苷。根據(jù)上下文，混合物可以是完全的或不完全的擴增反應混合物。
術語“引物”是指在一定條件下與核酸模板一起退火時能作為DNA合成起點的寡核苷酸，在所說的條件，即存在4種不同的三磷酸核苷酸和溶于適宜緩沖液(PH、離子強度、輔因子等)中的DNA聚合酶及適當?shù)臏囟认?，啟動了引物延伸產(chǎn)物的合成。
術語“模板”是指與引物退火的靶核酸序列的一部分。
以上是對現(xiàn)有技術中的一些缺點和本發(fā)明優(yōu)點進行的簡單描述。
從下文的描述、附圖及所附權利要求中本領域的技術人員將明顯地看到本發(fā)明的其它特征、優(yōu)點和實施方案。
圖1圖示說明對PCR進行連續(xù)和實時監(jiān)測;
圖1A是圖1中線1A內(nèi)區(qū)域的放大圖;
圖2是與本發(fā)明原理一致的擴增反應裝置的透視圖;
圖3是圖1中熱循環(huán)儀的部分放大，用以說明熱循環(huán)儀的熱交換器板和它的蓋板;
圖4是圖2所示裝置的方塊圖;
圖5表示多個反應混合物的數(shù)字化圖像的例子;
圖6說明進行取平均的被選擇像素陣列，它用以獲得單個熒光值;
圖7表示循環(huán)至循環(huán)熒光讀數(shù)的漂移;
圖8A表示多個熒光圖;
圖8B表示規(guī)范化后圖8A的熒光值;
圖8C表示圖8A和圖8B中熒光圖所代表的擴增反應產(chǎn)物的凝膠電泳;
圖9表示起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)與達到某選定熒光值所需循環(huán)數(shù)之間的線性關系;
圖10A-D代表反應條件改變的影響;
圖11-13是獲得熒光值步驟的簡化流程圖;
圖14是本發(fā)明擴增反應裝置的透視圖，以局部剖視說明激發(fā)光和發(fā)射光/熒光檢測器裝置的又一實施方案;
圖15是局部剖視的圖14中激發(fā)光和發(fā)射光/熒光檢測器裝置的放大圖;
圖16表示反映按照本發(fā)明原理構(gòu)造的雙色鏡的透射率對波長的代表性曲線;
圖17是本發(fā)明含有反應混合物的反應管上部加熱窗頂視圖。
本發(fā)明涉及核酸的擴增反應和擴增反應產(chǎn)物的檢測、監(jiān)測及定量測定。為了便于理解本發(fā)明的擴增反應數(shù)據(jù)的收集和處理系統(tǒng)，首先將討論特別適于與本發(fā)明聯(lián)用的核酸擴增反應方法的概況。
熟練的技術人員們將認識到，本發(fā)明需要核酸雙鏈形式的擴增反應。現(xiàn)已存在多種用于擴增核酸的熟知方法。用于擴增反應的方法并非關鍵，本發(fā)明將與任何能產(chǎn)生核酸雙鏈的方法一起得以實施。各種方法已有綜述(見Bio/Technology 8290-293，April 1990)，所引文獻并入本文作為參考。這些方法包括但不限于PCR、LCR、Qβ和3SR。盡管3SR和Qβ不涉及熱循環(huán)，但其擴增反應的結(jié)果可用下文討論的熒光檢測裝置監(jiān)測，并依據(jù)本發(fā)明的原理進行分析。所說的每種方法簡述如下。
DNA的PCR擴增反應包括熱變性DNA，兩個寡核苷酸引物與側(cè)接待擴增DNA片段的序列退火以及用DNA聚合酶延伸退火的引物這三個階段的重復循環(huán)。引物與靶序列的相反鏈雜交，并以能使得用聚合酶進行的DNA合成跨越引物間的區(qū)域來取向，每一連續(xù)的循環(huán)基本上能使前一循環(huán)中合成的DNA量倍增。這將導致特異性靶片段以約2n/循環(huán)的速度(n為循環(huán)數(shù))指數(shù)式積累。PCR技術的完整綜述可見于PCR TechnologyPrinciples and Applications，Ed.Erlich H.A.，Stockton Press，New York 1989。
當PCR與本發(fā)明結(jié)合應用時要優(yōu)選使用Taq DNA聚合酶，盡管這并非本發(fā)明的必要方面。Taq聚合酶是一種熱穩(wěn)定性聚合酶，在高溫下保持活性。US 4，889，818公開了制備Taq的方法，該文獻并入本文作為參考。然而，由其它的棲熱菌種或非棲熱菌種(例如Thermus thermophilus或Thermotoga maritima)分離出的其它熱穩(wěn)定聚合酶以及非熱穩(wěn)定聚合酶如T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、E.coli DNA聚合酶或E.coli的Klenow片段也可用于PCR中。國際專利申請WO-A-91/09950和WO-A-92/03556中提供了獲得熱穩(wěn)定聚合酶的方法，所引這些文獻并入本文作為參考。
國際專利申請WO89/09835描述了連接酶鏈反應，該文獻并入本文作為參考。該方法涉及應用連接酶以便連接與靶核酸退火的寡核苷酸片段。連接酶鏈反應(LCR)導致原始靶分子的擴增，并提供數(shù)百萬個拷貝的產(chǎn)物DNA。因此，LCR引起雙鏈DNA的凈增。本發(fā)明檢測法可用于LCR，也可用于PCR。LCR一般需要檢測產(chǎn)物DNA的某些手段，如一個寡核苷酸探針。當與公開的檢測擴增反應產(chǎn)物的方法結(jié)合應用時，不需要這類手段，LCR結(jié)果立即可測。
另一種擴增方案，即Qβ復制酶，開發(fā)了RNA噬菌體Qβ的復制酶的應用。在這一擴增方案中，最初將經(jīng)修飾具有針對靶序列特異性的序列的重組噬菌體基因組與待測試的核酸相連。待噬菌體探針與樣品中核酸間形成的雙鏈富集后，加入Qβ復制酶，依照對被保留重組基因組的識別，開始制備大量的拷貝。
Qβ系統(tǒng)不需要引物序列，也不象用PCR和LCR擴增系統(tǒng)存在熱變性步驟。反應一般發(fā)生在一個溫度，如37℃。優(yōu)選的模板是Qβ復制酶的底物midvariant-1RNA。通過應用Qβ系統(tǒng)可使模板量極大地增加。有關該擴增系統(tǒng)的綜述可見于國際專利申請WO87/06270和Lizardi等人，1988，Bio/Technology 61197-1202。
3SR系統(tǒng)是以體外轉(zhuǎn)錄為基礎的擴增系統(tǒng)的一種變化形式。以轉(zhuǎn)錄為基礎的擴增系統(tǒng)(TAS)包括應用引物來對啟動子序列以及與靶鏈互補的序列進行編碼，以產(chǎn)生靶鏈的DNA拷貝，并用RNA聚合酶由所說的DNA拷貝生產(chǎn)RNA拷貝。參見US 4，683，202的實施例9B和EP-A-0，310，229。3SR系統(tǒng)是一個利用三種酶進行靶核酸的等熱復制的系統(tǒng)。
該系統(tǒng)以與T7 RNA DNA引物相連的單鏈RNA靶開始。通過用逆轉(zhuǎn)錄酶延伸引物，形成cDNA，而RNAseH處理使cDNA從異源雙鏈中游離出來。第二引物與cDNA相連，雙鏈cDNA由逆轉(zhuǎn)錄酶處理而形成。一種或兩種引物編碼啟動子(例如T7RNA聚合酶的啟動子)，以致于雙鏈cDNA成為RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄模板。
轉(zhuǎn)錄感受態(tài)cDNA產(chǎn)生原始靶的反義RNA拷貝。轉(zhuǎn)錄物然后由逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)化為含雙鏈啟動子的雙鏈cDNA，所說的啟動子可以以反向重復方向隨意位于兩端。這些DNA可以產(chǎn)生能重新進入循環(huán)的RNA。有關3SR系統(tǒng)更完整的描述可參見下列文獻Guatelli等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA871874-1878;EP-A-0，329，822，這兩篇文獻均引入本文作為參考。TSA系統(tǒng)也有描述，如Gingeras等，Innis等.eds，1990，PCR Protocols，Academic Press，San Diego，該文也引入本文作為參考。
根據(jù)本發(fā)明，當反應混合物中提供的熒光染料(如插入的熒光染料)在每一退火/延伸階段過程混合物在兩個溫度間循環(huán)(熱循環(huán))而與雙鏈核酸結(jié)合時，通過檢測所發(fā)出的熒光可監(jiān)測核酸擴增反應。
熒光的增加表明靶核酸的正向擴增。適宜的插入劑或染料包括但不限于溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EtBr)、溴化丙錠、二氨基吖啶、吖啶橙、吖啶黃素、fluorcoumanin、ellipticine、道諾霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、homidium、光神霉素、ruthenium polypyridyls、氨茴霉素、溴化甲錠、2-[2-(4-羥苯基)-6-苯并咪唑-6-(1-甲基-4-piperazye)苯并咪唑三鹽酸化物等等。
本領域中所述的熒光團和DNA結(jié)合發(fā)色團適用于US 5，210，015中公開的5′→3′核酸酶測定，也適用于本發(fā)明。選擇了適合的供體熒光團和淬滅劑以使供體熒光團的發(fā)射光譜與淬滅劑的吸收光譜重疊。理想的情況是，熒光團應具有高Stokes漂移(在最大的吸收波長與最大的發(fā)射波長間有很大的差別)以最大程度地減小由散射的激發(fā)光產(chǎn)生的干擾。
本領域中熟知的適宜標記包括(但不限于)熒光素及衍生物如FAM、HEX、TET和JOE;若丹明及衍生物如Texas Red、ROX和TAMRA;熒光素黃(Lucifer Yellow)和香豆素衍生物如7-Me2N-香豆素-4-乙酸鹽、7-OH-4-CH3-香豆素-3-乙酸鹽和7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸鹽(AMCA)。FAM、HEX、TET、JOE、ROX和TAMRA由Perkin Elmer，Applied Biosystems Division(Foster City，CA)推入市場。Texas Red和許多其它的合適化合物由Molecular Probe(Eugene，OR)推入市場。適合作為能源供體的化學發(fā)光化合物和生物發(fā)光化合物的例子包括魯米諾(氨基苯二酰-肼)及其衍生物，以及熒光素酶。
參照圖1，顯示了指示單一聚合酶鏈反應(PCR)的DNA擴增反應的熒光跡線，所說PCR包括將反應混合物的溫度在兩個溫度(如94℃和50℃)之間循環(huán)。反應混合物包括加入的熒光DNA結(jié)合染料EtBr，它能夠插入或結(jié)合已成雙鏈的PCR產(chǎn)物并在反應的每個退火/延伸期發(fā)出熒光。其結(jié)果是，隨雙鏈DNA數(shù)量的增加，所產(chǎn)生的熒光也增加。如圖1中說明的，熒光強度的升降和溫度升降正好相反。熒光強度在變性溫度(94℃)時最小，在退火/延伸溫度(50℃)時最大。因此，50℃時的熒光強度顯示出與循環(huán)有關的增加，它表示反應雙鏈DNA數(shù)量增加。當在30個循環(huán)完成后熱循環(huán)儀回到25℃時，熒光值最終增加到比25℃初始熒光值大三倍。另一方面，在變性溫度處的最小熒光值沒有顯著增加，推想是因為在此溫度時不存在dsDNA與EtBr的結(jié)合。
如申請?zhí)枮?7/695，201的美國專利所公開的，該數(shù)據(jù)用光纖導管和光譜-熒光計收集。光纖導管用于將激發(fā)光直接輸入至含有反應混合物的反應管，而該反應管位于熱循環(huán)儀的加熱/冷卻板中。同一根光纖導管也用于將熒光發(fā)射光傳回光譜熒光計，在那里讀出相應于發(fā)射的熒光的數(shù)值。按照這種安排，如圖1中數(shù)據(jù)顯示的，在反應正在進行時就可以監(jiān)測擴增產(chǎn)物的產(chǎn)生。由于由結(jié)合試劑產(chǎn)生的信號可在不必打開反應管的情況下檢測，所以可以在擴增反應過程之前、之中、和之后全程監(jiān)測該信號。
用于檢測單一PCR和提供圖1中數(shù)據(jù)的裝置是按下列方式建立的安裝帶有光纖附件的Spex-Fluorolog-2熒光計(Spex Catalog No.1950)以在500nm發(fā)射激發(fā)光，光的頻帶寬約為3.4nm。用GG 435nm截止濾光鏡排除第二次光(購自Melles Grist Inc)。在頻帶寬約為13.6nm的570nm處檢測發(fā)射光。用OG530濾光鏡(530nm截止)去掉激發(fā)光。
反應管是含有60ng人類男性DNA的0.5ml聚丙烯管。該管的上端被切除以接入光纖導管。光纖導管用環(huán)氧劑粘貼在反應管頂部。透過管中油性覆蓋層收集發(fā)射光。在管周圍建起黑色護罩并將反應管置于熱循環(huán)儀中。設定熱循環(huán)儀的程度為于94℃和50℃之間循環(huán)，每一溫度為1分鐘，進行30個循環(huán)，然后于25℃持續(xù)溫育。同時啟動熒光計和熱循環(huán)儀。熒光計的參數(shù)為用帶5秒積分時間的時基的掃描;將發(fā)射光信號與激發(fā)光信號的比值來控制光源強度的變化。
按照本發(fā)明，提供了一種同時進行實時檢測的多個擴增反應混合物的擴增反應的裝置。每個反應混合物含有一種靶核酸序列。因此，例如使用能夠容納多至48個反應管的加熱和冷卻板的熱循環(huán)儀(如由Perkin Elmer Cetus Instruments商售得到的熱循環(huán)儀)，可以進行48個擴增反應并且同時檢測所有48個樣本中PCR擴增反應產(chǎn)物而不需拿起樣本、打開反應管或中斷循環(huán)反應。同時監(jiān)測的反應數(shù)僅由加熱和冷卻板的容量所限制。因此，用96孔加熱和冷卻板，可以同時監(jiān)測96個擴增反應并檢測其擴增產(chǎn)物。如在上文例子中所描述的，應該理解，盡管下文討論的實施方案是用PCRs和由指示某些樣本中靶DNA序列擴增的特異性熒光結(jié)合試劑產(chǎn)生的信號一起加以描述的，但這些實施方案可以與其它的擴增過程或結(jié)合試劑一起應用，如在上文所總結(jié)的以及在授權給Gelfand等人的US 5，210，015中所公開的那樣，所說的專利已引入本文作為參考。
在多個擴增反應混合物檢測裝置的第一個實施方案中，一個適宜的光學系統(tǒng)將激發(fā)光從光源送至位于熱循環(huán)儀中的多個反應管處并測量各反應管的發(fā)射光。這種光學系統(tǒng)可以包括能同時讀取所有進行熱循環(huán)的PCR管的多根光纖導管。由于可以很快地一次讀取一根光纖(例如在PCR溫度持續(xù)的時間范圍內(nèi)，即退火/延伸間隔期，如圖1A所說明的a-c之間的間隔期)，所以為了讀取反應管的熒光只需要一臺熒光計即可。對本領域?qū)I(yè)人員顯而易見的是這種檢測系統(tǒng)不必限定于具體的熱循環(huán)儀或反應管。
擴增反應檢測裝置包含了傳輸激發(fā)光和熒光發(fā)射光的光纖導管。只要反應孔或管為密閉防光的以便防止外部光源影響熒光檢測，任何含有或可附于光纖管的位于上方的平板、管蓋或孔蓋裝置均是適合的。在本發(fā)明的一個實施方案中，可以去掉反應管蓋以容納光纖部件。然而，使用具有透明或半透明蓋的反應管可消除將光纜插入反應管的必要。很明顯，能夠容納光纜但光纜與擴增反應成分并沒有物理上的接觸的反應管是更為理想的。
參照圖2，它顯示了同時進行實時檢測多個靶核酸序列擴增的裝置的另一個實施方案，該裝置參考編號為10。該實施方案有利地消除了需要上文描述的光輸入和熒光輸出光纖導管以及與將光纖和反應管相連接所帶來的問題。如上文所討論的，為了簡化起見，裝置10將與應用了熒光結(jié)合試劑信號發(fā)生器的DNA靶序列PCR擴增反應一起進行描述，但并不意味著限制于使用這樣的擴增過程、核酸或擴增信號發(fā)生器。
裝置10一般包括用于加熱和冷卻反應室管26(預先裝有進行擴增的核酸)的熱循環(huán)儀12、位于側(cè)面的激發(fā)光源或燈14、成像裝置16(包括CCD攝像機16a、攝像機控制器16b和冷卻器16c)以及影像處理器20，所說的影像處理器可以是一臺PC機，它帶有市場提供的幀接收器卡(frame grabber card)如由ITEX Inc.提供的PC VISION PIUS，還帶有IEEE488接口卡。這些元件示于圖4的方框圖中。盡管熱循環(huán)儀12是根據(jù)優(yōu)選的實施方案按常規(guī)制造的，但下面仍給出了熱循環(huán)儀12某些特征概要以幫助理解本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
熱循環(huán)儀12包括用于加熱和冷卻反應管26的熱交換器22。熱交換器22為一最好用鋁制的導熱板，它具有形成于其中的多個凹陷24，凹陷的大小允許一定數(shù)目的反應管26(例如0.5ml Eppendorf管)與之相配合。熱交換器22的用途是支持反應管26并作為熱交換器把熱能導入和導出貯于管中的液體，從而使各反應成份于各種溫度下按用戶所定時間進行溫育。因此，熱循環(huán)儀12也包括用于加熱和冷卻熱交換器的系統(tǒng)和裝置，例如，如本領域常規(guī)所用的用于控制加熱和冷卻系統(tǒng)以便加熱和冷卻熱交換器和反應管的計算機系統(tǒng)。用戶根據(jù)將熱交換器和反應管加熱和冷卻至所需溫度的方案(如圖1所示的)通過顯示/鍵盤用戶接口28設定計算機或所用裝置的程序。
可以根據(jù)本文中作為參考而引用的文獻US5，038，852來設立熱交換器(導熱板)、用于加熱和冷卻熱交換器的裝置和用于控制熱交換器的加熱和冷卻的裝置、以及整個熱循環(huán)儀。市場上可得到的合適的熱循環(huán)儀如示于圖2的GeneAmp PCR System 9600熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)。
然而，應該理解，也可使用用于加熱和冷卻預先裝有反應物的反應管的其它裝置而不超出本發(fā)明的范圍。唯一必要的是無論用何裝置加熱和冷卻反應管，它都應能夠達到和維持所涉及的溫度并且取得所期望的溫度-時間過程。因此，對于核酸擴增反應這一目的，這種裝置應能夠使擴增反應混合物的溫度在變性溫度T1(其范圍可在約80-105℃，優(yōu)選為90-100℃)和退火/延伸溫度T2(其范圍在約30-90℃，優(yōu)選為50-70℃)之間循環(huán)，正如本領域?qū)I(yè)人員所知，T1＞T2。
蓋板27(包括把手27a)按本領域常規(guī)方法可滑動地裝在熱交換器上，用于覆蓋和敞開熱交換器22。在圖2所體現(xiàn)的本發(fā)明的擴增/檢測過程中，蓋板27維持在圖3所示的后面位置上。這使攝像機16a能接受從擴增反應管內(nèi)發(fā)射的熒光信號。
熱循環(huán)儀12還帶有用于經(jīng)過導線30發(fā)送指示熱交換器或擴增反應混合物溫度情況(如循環(huán)數(shù)、溫度和時間)的輸出數(shù)據(jù)至影像處理器20的裝置。用于傳輸這些數(shù)據(jù)的RS232總線與例如Gene AmpPCR System 9600熱循環(huán)儀一起提供。在操作期間LED顯示板28a也給用戶顯示了這些輸出數(shù)據(jù)。
CCD攝像機16a位于熱交換器22和反應管之上以收集通過反應管上端由反應混合物發(fā)射的熒光信號，與此同時在擴增反應期間混合物的溫度由裝置12進行循環(huán)。重量的是，要將攝像機16a在可行的前提下置于離熱交換器22盡可能遠的位置以減少攝像機16a所捕獲的熒光影像的視差效應的影響。然而，攝像機16a必須與熱交換器和反應管足夠近以最大限度減少由其它光源來的背景噪聲，從而使由反應管26而來的足夠的光能被攝像機捕獲。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，熱交換器22與指向熱交換器的攝像機鏡頭46間的最適距離d依所用鏡頭的不同而約在6英寸至5英尺的范圍內(nèi)。例如，如用70mm的鏡頭，d的最佳距離約2英尺。由于所感興趣的熒光波長為約600nm，將一通頻帶干涉濾光鏡48(優(yōu)選為600nm的濾光鏡)置于鏡頭前以限定檢測到所期望的波長。
參考圖2，可見攝像機16a裝置于常規(guī)攝影用拷貝支架32上以將攝像機置于熱交換器22和反應管26之上?？截愔Ъ?2包括一個支撐在托架36中的垂直支持構(gòu)件34。托架36牢牢固定在支持裝置10的安裝表面38上?；瑒訕?gòu)件40可滑動地連接到垂直構(gòu)件34上以沿垂直方向活動，它帶有旋鈕42，該旋鈕42轉(zhuǎn)動時與滑動構(gòu)件40相配合，使滑動構(gòu)件40鎖定在一固定位置，這是一般技術人員都熟悉的。攝像機托架44一端與滑動構(gòu)件40牢牢固定，而另一端與攝像機16a固定。因此，攝像機16a的高度可通過滑動構(gòu)件40調(diào)節(jié)至熱交換器和反應管上面的所需高度位置上。攝像機16a最好是傳統(tǒng)的計算機控制的、受冷卻的CCD-攝像機。冷卻液通過多導管線50循環(huán)流過攝像機16a。攝像機最好進行冷卻以便提供低噪音的更高質(zhì)量的影像。一種合適的攝像機是從Photometrics(Tucson，AZ)商售可得到的、名為STAR 1的CCD-攝像機。它使用每個像素12位分辨率的熱電冷卻的CCD陣列。它也允許變化曝光時間以改變對所測熒光的靈敏度。攝像機16a與影像處理器20之間連有IEEE 488總線(參考編號58)，從而使影像處理器20能夠控制反應管影像的曝光及采集影像的時間周期。
參考圖4，兩個UV燈14于側(cè)面置放在攝像機16a與熱交換器22之間的光路周圍。燈14與攝像機鏡頭46足夠靠近以使它們的外殼不干擾所有反應管和攝像機鏡頭46之間的光路，這一點是唯一重要的一點。為達到這一目標，可通過托架52將燈14懸吊于托架44之上。燈14也平行于熱交換器以便激發(fā)光以均勻的方式提供給反應管。導線54從燈14延伸出來并適合插入標準的115伏墻壁插座以向燈提供所需的電源。根據(jù)核酸熒光結(jié)合試劑的要求選擇UV燈14的波長。例如，波長302nm為激發(fā)溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的所需波長。適宜的302nm中間范圍UV燈可通過商售從U.V.Prodncts，Inc(San Gabriel，CA)處，其名為Chroma-Vue。
由攝像機16a攝取的影像通過導線56傳輸至影像處理器20，如果使用如前所討論的STAR 1系統(tǒng)，導線56為RS170線。影像處理器20包括用于將導線56上的攝像機采集數(shù)據(jù)形成數(shù)字圖像的幀接收器。盡管攝像機16a包括12位的數(shù)字輸出，但在影像處理器20為8位影像處理器時，使用攝像機的模擬輸出信號。在這種情況下，影像處理器20包括幀接收器以便從導線58上的模擬信號產(chǎn)生8位數(shù)字圖像，從而使影像處理器20能夠以數(shù)字數(shù)據(jù)處理收集的圖像。
為給處理器提供擴增反應進行中的溫度變化情況、時間以及周期，將熱循環(huán)儀輸出數(shù)據(jù)導線30也連至影像處理器20。用這種方法，可以設定處理器20的程序以在擴增反應過程中預定時間時通過導線58向攝像機控制器18發(fā)送啟動信號，該控制器18控制攝像機16a快門的開啟。影像處理器20包括用于與IEEE 488的聯(lián)線58通訊以控制攝像機16a的IEEE 488總線卡。處理器20還帶有常規(guī)鍵盤和/或鼠標用戶接口60/64和顯示器62。下面提供了裝置10操作的一般描述。
將每個均含有反應混合物(如待擴增的核酸、催化聚合反應的對熱穩(wěn)定的酶、特異性寡核苷酸引物和四種不同的三磷酸核苷酸)的多個反應管26置于熱交換器板22中(圖3)?？捎贸Ｒ?guī)的蓋子、蒸氣屏障礦物油或AmpliwaxTM牌密封劑密封反應管。啟動熱循環(huán)儀，給對著反應管的激發(fā)光燈通電。攝像機16a在接到來自攝像機控制器16b的信號后，攝下所有反應管26的一幅圖像，這幅圖像反映出在一個循環(huán)的第一次退火/延伸期不同水平的熒光。這幅模擬圖像傳至影像處理器，在那里幀接收器將圖像數(shù)字化，這是因為它帶有模擬/數(shù)字轉(zhuǎn)換器。
圖5顯示了在6個同時發(fā)生的擴增反應過程中攝制的三幅這種數(shù)字化圖像的某些部份。處理器將在所提到的退火/延伸期中各反應管發(fā)射的光的強度加以平均，并將這些強度值規(guī)范化以確定每個反應管的單一熒光值。下面將與圖8A-C相聯(lián)系更詳細地討論規(guī)范化過程。對每個擴增反應過程的循環(huán)重復進行上述過程。將規(guī)范化的熒光值存至計算機電子表格中以便隨后進行分析和作圖。對規(guī)范化熒光值作進一步處理以確定靶核酸序列的起始量(即擴增前靶核酸模板的起始數(shù))或分析擴增反應條件對反應動力學的影響。下面對上文已簡述過的熒光值采集和處理步驟進行更詳細的討論。
首先將討論每次攝像機對發(fā)射的熒光曝光的時機。由于最大的熒光發(fā)生在進行熱循環(huán)的擴增反應過程中的、各循環(huán)的退火/延伸期(例如，參見圖1A中間隔a-c)并且這指示著核酸擴增反應的水平，所以當攝像機16a在一給定周期中只攝取一幅圖像時，應該在該循環(huán)的這一階段進行攝取，因為在這時可得到最強信號，而且這一間隔中的信號最好地代表了所產(chǎn)生物質(zhì)的量。然后，由于整個反應期中的其它數(shù)據(jù)可用于分析擴增反應的整個過程，所以應該理解，對每個循環(huán)最好收集不止一個圖像。例如，以圖1A中字母b參考所指示的在退火/延伸溫度達到之后的20秒，可攝取各圖像。在該例子的情況下，如果退火溫度為68℃，當熱循環(huán)儀12通過RS 232的的引線30指示溫度達到68℃后20秒時，處理器發(fā)送信號至攝像機控制器16a以啟動攝像機快門(未顯示)。本領域的一般技術人員都知道，曝光時間可以隨不同的應用而不同。開啟攝像機快門的啟動過程很明顯可以在操作者監(jiān)測顯示板28a上顯示的溫度和時間輸出數(shù)據(jù)情況下手動進行。
CCD攝像機將在曝光期間接收到的光相加并產(chǎn)生圖象，該圖象表明熱交換器中在所定時間間隔中所有反應管的熒光。該圖像通過導線56送至影像處理器20。與處理器20相連的顯示器62可以顯示在圖5中標為64A-C的三個窗口。窗口64A可以監(jiān)視攝像機的視野并在攝像機操作期間提供功能菜單，如攝像機曝光控制等。窗口64B顯示數(shù)字圖像并便于手動選定待處理的部分圖像(例如，如下討論的進行平均)。窗口64C顯示了計算機操作系統(tǒng)的命令行。處理器將圖像數(shù)字化并在窗口64B中顯示出來，這個窗口可用來使用戶能夠?qū)⒁唤M像素指定至包含一個反應管的單一圖像的圖像區(qū)域。可以用鼠標在窗口64B中的一個反應管26的數(shù)字圖像某些部分的周圍畫上方框而完成這一步驟，或者，如對計算機圖形學領域中普通技術人員來講是顯而易見的那樣，用一個查看各像素熒光的程序來確定哪個像素屬于哪個反應管而完成該步驟。圖6圖解說明這一步驟，其中6×6像素陣列包括了單個反應管26的圖像。應理解該陣列大小僅僅為舉例的目的而選出，并且可采用其它陣列大小而不偏離本發(fā)明的范圍。像素值“5”表示熒光不明顯，它相應于熱交換器上表面發(fā)射的熒光，而像素值“200”表示在6×6像素陣列中測得的最大熒光值并相應于從成像在像素上的反應管的中心發(fā)射的熒光。像素值“100”相于應由熱交換器和反應管部分發(fā)射的熒光。當然，這些特殊的像素值并不必需代表實際值，而僅僅是舉例說明。
然后影像處理器20將轉(zhuǎn)至包含該反應管的區(qū)域陣列中的像素值加以平均以得到核酸擴增反應過程循環(huán)1的該反應管的單一熒光值。然而，可以以其它方式如將像素值相加而得到各反應管的單一熒光值。然后將繪出6×6陣列輪廓并包含第一反應管的方框移動以使之包含下一個反應管，重復像素值平均步驟并獲得單一的熒光值直至循環(huán)1的各管均得到熒光值。另外的方法是，可將獲得指定循環(huán)的各反應管26的熒光值的過程作為并行過程而進行。各反應管熒光值的計算過程在各循環(huán)重復進行直至完成擴增反應過程。
開始時，即當熱交換板22裝上反應管26時，也將一對照管26c裝入孔24之一。對照管的用途為針對各循環(huán)間測量的差異提供一個穩(wěn)定的熒光源，例如可以檢測出由于微小溫度變化或激發(fā)光強度漂移引起的所說的測量差異。以這種方法可以校正所獲得的各反應管的熒光值，以便根據(jù)下述方法對所說變異進行補償。對照管26c預先只裝有熒光染料，如溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(EtBr)。由于對照管不含核酸，所以在熱循環(huán)期間沒有熒光的擴增。因此，在擴增反應期間經(jīng)受激發(fā)光作用時，對照管將發(fā)射基本恒量的熒光，并且對照管熒光強度在整個擴增反應過程期間可作為基線。這在圖7中得到說明，其中繪制了幾個循環(huán)的對照管熒光強度。
圖7中io為對照管的初始熒光并且它構(gòu)成了基線。在循環(huán)2時，記錄到的對照管26的光強度開始逐漸減小，這表示發(fā)生了熒光漂移。因此，循環(huán)4實線72相應于表觀強度值。例如，在循環(huán)4中，當攝像機收集第4個循環(huán)的退火/延伸期的數(shù)據(jù)時，對照管熒光的表觀值為iA4。然后確定該循環(huán)的校正系數(shù)io/iA4。各反應管獲得的各熒光值乘以校正系數(shù)而得到實際熒光值。對每個循環(huán)重復進行前述過程。總之，校正系數(shù)一般描述為io/iAn，其中io為對照管的初始熒光值，iAn為在循環(huán)數(shù)n期間采集的對照管表觀熒光值。對例如用平均法(如前所述)所得到的各反應管的和熒光值與校正相乘。對各循環(huán)重復進行前述過程。
參考僅作為舉例說明目的的特殊實施例中所得數(shù)據(jù)，下面將描述規(guī)范化和定量過程。數(shù)據(jù)示于圖8A中，應該理解本發(fā)明不是意在僅限于PCR或特殊的擴增反應混合物、擴增反應數(shù)、熱循環(huán)儀、溫度變化方案或在這些情況下對本領域普通技術人員來講是顯而易見的熒光圖像的攝取間隔時間。所需要的只是監(jiān)測靶核酸序列起始濃度不同的擴增反應混合物，以便對其靶序列的起初濃度為未知的擴增反應混合物中的靶序列的起始濃度進行定量，下文將更詳細地進行描述。
圖8A顯示在熱循環(huán)55個循環(huán)中按上文描述的原理用CCD-攝像機獲得的、同時監(jiān)測的8個PCR擴增反應的熒光值。因此，這些熒光值代表了如上文所述對測量值變化(如漂移)的發(fā)生進行校正了的各反應管所獲得熒光值(例如通過將各自像素陣列作平均)。在該例子情況中，7個反應混合物含有已知濃度的特異性DNA靶序列(即已知量的起始樣本)以方便對樣本未知起始量的定量，下文將更詳細地描述。第8個混合物不含靶DNA，作為對照反應以提供背景信息。用單鏈HIV模板DNA的系列稀釋物起動7個已知樣本的擴增反應。
在制備稀釋物前，配制PCR反應混合物于100μl容積中，它含有10mM Tris-HCl(pH8.3);50mM KCl;3mM MgCl2;2.5U的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT);100μM各dNTP(Promega Corp.，Madison，WI);4μg/ml的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓(Bio Rad，Richmond，CA);100pmole各HIV特異性(gag區(qū))寡核苷酸引物SK 145和SK 431(Perkin Elmer，Norwalk，CT)和300ng人胎盤DNA(Sigma，St.Louis，MO)。用HIV gag區(qū)的M13亞克隆作為靶核酸模板。
以102模板起始，以10倍稀釋為一級直至102模板并與HIV特異性引物一起使用以形成142bp PCR產(chǎn)物，圖8A中由這些初始濃度產(chǎn)生的熒光值圖分別給予參考編號108、107……102。還對未加模板的對照擴增反應進行了監(jiān)測。該混合物的熒光值圖以參考編號O的線條表示。為模擬以PCR為基礎的結(jié)合了HIV基因組的淋巴細胞DNA的篩選，所有反應含有300ng或等同于40，000個細胞的人基因組DNA。
在GeneAmp PCR System 9600熱循環(huán)儀(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)中以2個溫度程序進行熱循環(huán)55個循環(huán)，2個溫度程序是在94℃進行15秒的變性;在68℃進行30秒的退火/延伸。為了提供如本領域常規(guī)所用的“熱啟動”以改善反應中的特異性(如Chou，Q.，Russel，M.，Birch D.E.，Raymond，J.和Bloch，W.的“Prevention of Pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves Low-copy-number simplification”Nucleic Acids Research 201717-1723，1992中所描述的)，起始溫度維持在75℃，在此期間當樣本達到此溫度后加入MgCl2(12μl)。各熱循環(huán)的熒光圖由CCD攝像機于維持的退火溫度下在第20秒至第30秒時攝取，曝光時間約為1秒。如上文所述，不用加熱蓋板27并將其置于離開反應管處以允許進行成像。
如圖8A所示，各反應的熒光在早期熱循環(huán)中變化很小，然后當產(chǎn)生了可檢測量的PCR產(chǎn)物時熒光值升高。反應中起始模板拷貝數(shù)越多，熒光值升高就越早。例如可看到標有108的曲線是相應于從含有最高濃度的起始模板(即108模板)起始的反應混合物發(fā)射的熒光的熒光曲線。如圖8A所示，如預計的那樣，108曲線首先升高。
然而，由不同擴增反應獲得的起始熒光值存在著相當大的差異，盡管它們應該相同。因為單鏈DNA的量太小以致于反應管中不同量的單鏈DNA對單管所預期的總熒光值只有可以忽略不計的影響，所以各起始熒光應該相同。據(jù)信這種差異的來源為光照不均勻性或非一致性、視差以及由于管蓋造成的熒光可變的衰減。透過礦物油的蒸氣屏障或AmpliwaxTM牌密封劑來監(jiān)測擴增反應而不蓋管蓋，可減少但卻不能消除這種差異。
為了補償光照不均勻性、視差和可變的熒光衰減以及因此造成的示于圖8A中的差異，處理器給每個擴增反應確定了一個規(guī)范化系數(shù)。各系數(shù)是基于在循環(huán)1中收集的數(shù)據(jù)確定的，并且為所有反應的平均初始熒光與各反應觀察到的初始熒光的比率。處理器將各擴增反應的所有熒光值與各自的規(guī)范化系數(shù)相乘。此規(guī)范化的結(jié)果示于圖8B中。因此，對于含有108起始模板拷貝的反應來講，所說比率(規(guī)范化系數(shù))為循環(huán)1中所有8個被85相除的熒光值的總和，85為如圖8A中所示反應108的初始熒光值。標為108的反應的熒光值然后均被該系數(shù)相乘從而產(chǎn)生圖8B的規(guī)范化曲線。各反應曲線被相似地規(guī)范化。該規(guī)范化熒光是基于這樣的假設基礎上的圖像差異的來源在整個信號強度范圍使熒光信號按比例減弱或增強。
參考圖8B，所有反應基本上具有相同的初始熒光，并且大多數(shù)反應圖具有與所有稀釋系列相一致的均勻的間隙。這些圖在形狀上非常相似并且?guī)缀跗叫?。有效PCR的早期或?qū)?shù)期在每個循環(huán)都使DNA拷貝數(shù)加倍。可以預計每個起始模板10倍的稀釋將需要額外的3.32個循環(huán)才能使PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量達到指定的濃度。因此，規(guī)范化值對于熒光水平范圍的多數(shù)值來講是如所預期的，通過檢查圖8B可以看到除了以102拷貝數(shù)和O拷貝數(shù)起始的稀釋液以外，其它各稀釋液之間都有約為3個循環(huán)的分隔。在PCRs的對數(shù)期過后這種循環(huán)數(shù)分隔仍然存在，這也是顯而易見的。相反，將圖8A的非規(guī)范化數(shù)據(jù)中各稀釋液分開的循環(huán)數(shù)卻有很大的不同。
應用如圖8B中所示數(shù)據(jù)的規(guī)范化熒光數(shù)據(jù)可以對靶核酸的初始量定量，并且可以分析不同的反應條件對擴增反應的動力學的影響。首先要討論靶核酸初始量的定量。圖9顯示模板拷貝起始數(shù)的對數(shù)與圖8B中為達到任意選擇的熒光水平190而所進行的擴增反應的循環(huán)數(shù)之間的線性關系。圖9中顯示的線條為配合從108至103初始拷貝的數(shù)據(jù)點的回歸線(r2＞.99)。相應于102初始拷貝的數(shù)據(jù)點與所說的線條(零拷貝不能置于對數(shù)圖上)具有統(tǒng)計學上顯著偏離。除了102拷貝的數(shù)據(jù)點外，最大程度偏離回歸線的數(shù)據(jù)點在105，當應用已確定回歸線的等式時，所說數(shù)據(jù)點顯示其值低于已知初始拷貝數(shù)13%。如果圖8B中所選的熒光水平在125-225之間的任何一處時，可以獲得相似結(jié)果。
在102拷貝處數(shù)據(jù)點偏離直線的原因借助于擴增反應產(chǎn)物的凝膠電泳分析示于圖8C中。擴增反應的特異性為當以模板拷貝從108起始降至155時唯一可見的產(chǎn)物為具有所預計大小的產(chǎn)物;而在采用104個起始拷貝時，剛剛可以見到較小的、非特異性擴增產(chǎn)物。在用103個拷貝時，該產(chǎn)物更顯著，且當用102個拷貝時，可產(chǎn)生與HIV特異性產(chǎn)物等量的非特異性產(chǎn)物。在未加模板的對照中只有非特異性產(chǎn)物。由于特異性產(chǎn)物的熒光與非特異性產(chǎn)物的熒光不能被區(qū)分開來，該項測定的敏感性的“基線”位于某循環(huán)數(shù)處，通過所說循環(huán)數(shù)，合成了大量的非特異性產(chǎn)物以致任何特異性產(chǎn)物的額外的合成對反應幾乎無影響。只要濃度確定是建立在由一組標準物(即含有已知濃度的起始靶核酸序列的反應管)內(nèi)推的基礎之上，則該基線將位于明顯地多于偏離直線開始處的循環(huán)數(shù)的循環(huán)數(shù)處。實際操作中我們看見在少于102個模板的反應圖的樣本與樣本的差異使低于該水平的可重現(xiàn)的定量復雜化了(數(shù)據(jù)未顯示)。
為了測定樣本中靶核酸初始量，首先使用從標準物組得到的規(guī)范化的熒光數(shù)據(jù)以建立初始靶核酸量與達到在儀器檢測范圍內(nèi)的任意選擇的熒光水平的所需循環(huán)數(shù)(如圖9中所示的)之間的關系。這種任意的熒光值(AFV)最好選在位于參考圖8B所描述的、在不同標準物間為平行的反應圖的區(qū)域。如果選擇的AFV為借助采用最高初始已知靶核酸濃度的標準物獲得的最大熒光值的0.1至0.5倍，則這一般將是正確的。
選擇AFV之后，對各標準物擴增反應來講，選擇所得到的最接近該AFV的校正和標準化熒光值。利用該值和在該值產(chǎn)生的循環(huán)之前的4個循環(huán)以及后4個循環(huán)的熒光值，作出將循環(huán)數(shù)(可以是分數(shù))與熒光值相聯(lián)系的回歸線。然后將該AFV置于回歸線等式中，得到所需達到此AFV的循環(huán)數(shù)的該標準物樣本的值。
在現(xiàn)在確定了每個標準物達到AFV所需的循環(huán)數(shù)后，得到了將初始靶核酸量與所需達到AFV的循環(huán)數(shù)相關聯(lián)的數(shù)據(jù)的回歸線。為了確定與標準物樣本一起擴增的未知樣本的初始靶核酸的量，按對標準物樣本所做的方法確定達到該AFV所需的循環(huán)數(shù)。將該循環(huán)數(shù)(可以是分數(shù))置入已確定的回歸線等式中，該等式就給出未知樣本中靶核酸的初始量。對各未知樣本可以重復進行該過程。通過經(jīng)適當設制了程序的微處理器可以容易地和很快地完成剛才所描述的數(shù)據(jù)處理。
核酸定量的這種方式不僅可以利用由染料的非序列特異性結(jié)合所導致的熒光，而且可利用寡核苷酸探針的序列特異性結(jié)合而產(chǎn)生的熒光(如在US 5，210，015中描述的在均勻擴增反應/檢測系統(tǒng)中應用的那樣的寡核苷酸探針)。如在上文專利中所描述的，這些探針需要另外的光源和濾光鏡。多個序列特異性探針(它們各自帶有可區(qū)分的熒光)的應用應該能使多個核酸靶序列在單一的擴增反應中同時進行檢測和定量。
參照圖10A-D，將討論對于不同反應條件對PCR的影響所作的分析。一般來講，這些影響可以通過加、減或改變標準PCR的成分并且觀察反應圖中的變化而加以監(jiān)測。圖10A顯示Taq DNA聚合酶的滴定。用如圖中所示的Taq聚合酶的各水平啟動9個同樣的含108靶HIV模板的CPRs。對于酶量在1到10個單位之間的每個反應，經(jīng)過大約相同的循環(huán)，在所有反應中可開始檢測出熒光。這表明酶水平的這些差異在早期循環(huán)中對擴增反應的效率幾乎沒有什么影響。然而，在晚期循環(huán)中PCR產(chǎn)物水平的差異變得明顯了，如在循環(huán)50時，用10個單位與用1個單位相比可以產(chǎn)生幾乎為2倍的DNA。借助凝膠電泳(未示出)，在這些反應中沒有非特異性、非HIV PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的跡象。僅用0.5單位Tag聚合酶，可檢測的產(chǎn)物會突然消失。由于PCR是這樣一種過程，其中DNA按指數(shù)而增加其濃度，之所以存在酶的閾值水平或許并不令人驚異，在此酶的閾值水平之下擴增反應顯然是失敗的。
也可以監(jiān)測改變引物濃度對擴增反應動力學的影響。圖10B表示出用從2μM(各引物)至0.05μM的引物水平檢測HIV模板(108個初始ssDNA拷貝)的PCRs的圖。每個PCR中用同樣量的酶(2.5U)。應注意在引物濃度從0.05至0.4μM時，反應中DNA水平升高至一定水平并且保持穩(wěn)定。如果用圖4中的數(shù)據(jù)并設定142bp PCR產(chǎn)物為10.6pmole/μg來估計這些終產(chǎn)物的水平，我們可見對0.05、0.10和0.20μM引物分別產(chǎn)生了0.05、0.10和0.20μM的產(chǎn)物。在這些水平上，引物濃度明顯地成為產(chǎn)物DNA產(chǎn)量的限制因素。相反，在0.8μM引物濃度及其以上的濃度。如圖6A所示，DNA水平隨每一個熱循環(huán)而持續(xù)升高，并且引物增加的量對圖沒有什么影響。通過比較圖6A中的數(shù)據(jù)，人們可以得出這些反應是由酶而不是由引物限制的這一結(jié)論。
采用含1μM引物和每100μl 2.5U酶的同樣HIV測試系統(tǒng)，不同的KCl濃度的結(jié)果示于圖10C中。高濃度的KCl極大地抑制了Taq DNA聚合酶的活性。與此相一致，在KCl濃度為125mM或更高時，不存在可檢測到的PCR產(chǎn)物。以鮭魚精子DNA作模板，Taq DNA聚合酶的活性在50-90mM KCl時最優(yōu)。該測定表明在50、75和100mM KCl時產(chǎn)物產(chǎn)量最高，而在0mM KCl僅有一半量的產(chǎn)物。這種差異可能是由于使引物退火不穩(wěn)定的低離子張力所致，但與此不一致的是觀察到直到循環(huán)20為止用0mM KCl的擴增反應的效率顯示幾乎與用50-100mM KCl的擴增反應的效率相同。僅僅在較晚期循環(huán)時產(chǎn)物產(chǎn)量才下降，這與圖6A中用較少聚合酶獲得的結(jié)果相似，如果引物退火不穩(wěn)定，人們可以預計所有各循環(huán)的擴增反應效率將降低。
最后，把PCR的一種已知抑制劑羥高鐵血紅素以不同濃度加至PCRs中。除了用0.2μM的引物濃度以外，將羥高鐵血紅素加至前面所用的同樣的HIV測試系統(tǒng)中。如圖10D所示，在羥高鐵血紅素濃度為0.2μM或更高時，未得到可檢測到的DNA產(chǎn)物。在0.1μM時，產(chǎn)物的測出推遲了3-4個循環(huán)，這表明，與以0μM KCl或減少的酶所獲結(jié)果相比，在早期以及晚期的擴增反應循環(huán)中擴增反應的效率受到了不利的影響。反應圖中的差異表明，部分抑制的PCRs可與未抑制反應區(qū)分開。
圖11-13顯示了說明由本發(fā)明裝置完成的步驟的簡化流程圖。圖11說明總的熒光值獲取步驟，而圖12-13顯示了熒光的平均和規(guī)范化子程序。
參照圖11，整個過程開始，得到循環(huán)1熒光值。然后，處理器計算各樣本的規(guī)范化系數(shù)。接著將各熒光值與其各自的規(guī)范化系數(shù)相乘使在該循環(huán)中各值的熒光值規(guī)范化。然后處理器輸出已規(guī)范化的值，并得到下一個循環(huán)的熒光值。重復進行該過程直至所有的熒光圖像被處理。參照圖12，它說明如何獲得熒光值，啟動熱循環(huán)儀并且在攝像機控制器等待啟動信號時給激發(fā)光源通電。當攝像機控制器接到來自處理器的啟動信號時，它向攝像機發(fā)出信號以使攝像機開啟快門n秒，在快門關閉之前的這n秒中攝像機將指示熒光的像素值相加。模擬圖像傳送至影像處理器，在那里影像處理器的幀接收器將圖像數(shù)字化。此時可將數(shù)字化的圖像貯存以便以后的處理或者也可以實時處理數(shù)字化的圖像。在后一種情況下，影像處理器然后將一組像素分配至包含一個反應管的區(qū)域并且將該區(qū)域所有值平均以獲得可供貯存的單一熒光值。處理器重復這些步驟直至該循環(huán)中所有反應管均獲得了單一的熒光值。接著處理器輸出該循環(huán)的已貯存的值。然后重復進行該循環(huán)的前述步驟。圖13為圖11說明的規(guī)范化系數(shù)獲取步驟的子程序。首先，確定所有循環(huán)1基值的平均值。然后，該平均值被循環(huán)1中的各熒光值相除，以便得到將被繼續(xù)用于剩余循環(huán)的各擴增反應混合物的規(guī)范化系數(shù)。盡管流程圖不包括循環(huán)至循環(huán)的校正，但處理器也可以提供這種校正。
參照圖14和15，它們顯示了激發(fā)光和與裝置10聯(lián)合使用的熒光發(fā)射感光裝置的進一步的實施方案。該激發(fā)和熒光感光裝置總體上給予參考編號100，并且它總體上包括以不透光的方式覆蓋凹陷24的外殼或套殼102、提供給位于凹陷中反應樣本的燈或光源14′、檢測或感受由反應樣本發(fā)射的熒光的傳感器或攝像機16a′、以及用于分離激發(fā)光和熒光發(fā)射以使基本上只有發(fā)射光可被攝像機16a′檢測的二色鏡104。按上文所述處理熒光或擴增反應數(shù)據(jù)。
套殼102顯示出具有頂壁106、側(cè)壁108和110、前壁112和后壁114。套殼102置于熱循環(huán)儀12的上表面以使套殼包括熱交換器22并因而包括凹陷24，凹陷24是在熱交換器中形成的，其大小可接受多個反應管26，反應管26制成能容納核酸擴增反應樣本的形狀。更確切地說，建造套殼102是為了給置于樣本管26中的樣本以及在光源與樣本之間、樣本與傳感器之間的光路形成一個不透光的室。因此，套殼設置于熱循環(huán)儀12上以在其間形成不透光的聯(lián)接。另外，除了形成的供接受激發(fā)光源或燈14′的孔116和118以及攝像機16a′的鏡片120外，外殼或套殼的壁上無孔，并且它實質(zhì)上由不透明材料構(gòu)成。此外，壁最好由具有相對低的導熱性的材料如塑料組成以阻止熱量從導熱構(gòu)件22和管26中的樣本中傳遞。適于做套殼壁的一種材料是聚碳酸酯。
提供了一種進入套殼或外殼102內(nèi)部的辦法并因此可接觸到熱交換器22中的樣本。參照圖14和15，為了能提供這種進入或接觸，前壁112可通過合頁122與頂壁106以鉸接方式聯(lián)在一起。盡管對套殼已描述了特定的構(gòu)型，但應該理解也可用其它的構(gòu)型為激發(fā)光和熒光發(fā)射光路以及為包含元件的套殼102形成一不透光的室，套殼102中包含的元件在下文更詳細地進行描述。
燈或光源14′在外形上基本上與燈14不同。燈14′包括聚光擋板或護罩14a′以及用于發(fā)射光的燈泡或燈絲14b′，這與燈14的情況一樣并在本領域為常規(guī)的設計。選擇燈14′以提供具有這種波長的光，此波長相應于所需激發(fā)待測試樣本中存在的熒光結(jié)合試劑的光的波長。例如，用溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓作為熒光結(jié)合試劑，光源14′最好能發(fā)射波長約為302nm的UV光，提供302nm(UV)光的適宜光源可從U.V.Products，Inc.(CA)通過商售得到，其型號為UVM-57(302nm)。然而，應該理解溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓可在約480nm以及約302nm的波長處激發(fā)。另外，其它的熒光團(如其它DNA結(jié)合染料或上文描述的5′核酸酶均勻測定探針)可被非UV波長激發(fā)。因此，可用另一種產(chǎn)生480nm光的光源。然而，產(chǎn)生480nm光的光源一般提供可見光范圍的光。因此，當用這種光源時，要用濾光鏡以獲得所需480nm的光的輸出。一般地講，只要光源可以提供給反應混合物所需波長，可以使用任何光源裝置。單色計和激光器是適宜光源的例子。
燈14′與套殼102相連接以使激發(fā)光穿過孔116并照向凹陷24中所含的任何樣本，所說孔116位于凹陷24上方的中央從而最大限度地降低了在其上的非均勻性光分布。應該理解燈14′也可以位于其它位置。例如，燈14′可以完全位于套殼102中從而去除了孔116。然而，由于上文討論的原因，光發(fā)射元件(如燈炮14b)最好平行于熱交換器22的上表面并位于凹陷上方的中央，以增強在熱交換器上的光分布的均勻性。如果使用了濾光鏡以獲得所需波長，可將濾光鏡安裝在例如位于燈的光路與凹陷24中的樣本之間的孔116處的套殼上。
雙色鏡104最好使用低通雙色鏡，它直接位于熱交換器22上方并且最好使其角度與熱交換器的上表面約成45°，以適應燈14′和攝像機16a′的方向。以圖中顯示的安排，雙色鏡為低通雙色鏡，它的構(gòu)造要求在暴露給激發(fā)光時對具有相應于由激發(fā)光源14發(fā)射光的波長的光能穿透或透明，而對具有相應于由凹陷24中樣本發(fā)射光的波長的光進行反射(參見圖15)。當然雙色鏡的穿透和反射特征是根據(jù)具體應用而選擇的。例如，當用溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓作為熒光結(jié)合試劑時，如上文討論的，激發(fā)光波長可以約為302或480nm。在這兩種中的任意一種的情況下，發(fā)射光波長為約600nm。因此，可以這樣構(gòu)造雙色鏡，使它對波長約為302或480nm的光透過或者對約為302和約為480nm波長光均透過。在這兩種情況下，將雙色鏡建造成反射波長約為600nm的光。圖16顯示當采用溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓作為熒光結(jié)合試劑時，雙色鏡的適宜的特征的穿透性對波長的代表性曲線。在此例子中，雙色鏡對波長約為300至510nm(后者為截止波長)的光具有高度穿透性，然而當波長接近600時又變得有高度反射性。還要注意到，當使用其它熒光結(jié)合試劑(如熒光素)時可以使用具有于圖16中說明的特性的雙色鏡。熒光素分別有約495nm的激發(fā)波長和522nm的發(fā)射波長。至于穿透性和反射性的程度，圖16中所示的能穿透約85%的激發(fā)光和將98%的發(fā)射熒光反射至攝像機16a′的鏡子已為按照本發(fā)明以溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓檢測核酸擴增提供了適宜的結(jié)果。
為了說明的目的，給出了下面的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)并不是意在限制本發(fā)明。一種在使用溴化-3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓作為熒光結(jié)合光時用于分離激發(fā)光和發(fā)射光的適宜雙色鏡的規(guī)格如下UV穿透510nm截止短程透過(UV Transmitting 510nm Cut-Off Short Pass)對300-500nm，穿透性平均≥80%，在300nm處絕對值≥65%;對525-610nm，反射性絕對值≥90%;硬耐熔氧化物表面涂層;基底物質(zhì)(底物)-Corning7940熔化的硅;且各邊緣倒角為0.010×45°。適合的雙色鏡制造商包括Omega Optical，Inc.(VT)和Janos Optical，Inc.(VT)。
盡管已經(jīng)描述了低通裝置，但也可以使用高通雙色鏡。然而，在用高通雙色鏡時，如對本領域普通技術人員是顯而易見的，應該把燈14′和攝像機16a′的位置顛倒。
回到圖14和15所示的實施方案的組成的安排上，雙色鏡104借助合頁128與隆起物或凸起物126鉸接固定，使鏡子可在軸上轉(zhuǎn)動以接近熱交換器22。隆起物或凸起物126自上壁106延伸，并且被建造成可防止或最大程度地減少來自光源14′的光越過合頁128而至攝像機16a。
按照優(yōu)選的實施方案提供了光快門，它示于圖15中并給予參考編號124，用以限制反應樣本受激發(fā)光的曝光。如圖15中圖解所示，快門124可滑動地聯(lián)至上壁106上以便在孔116開啟處的第一位置(以實線顯示)和它覆蓋孔116時的第二位置(以虛線顯示)之間移動?？扉T可以如本領域常規(guī)使用的那樣，用彈簧使之偏向于關閉位置，而通過電磁控制開啟到打開位置?？梢钥刂瓶扉T使它例如只在PCR期間各循環(huán)的退火/延伸期期間打開，即在該期間預計可產(chǎn)生最大的熒光?？扉T以這種方式通過提高樣本穩(wěn)定性從而改善了系統(tǒng)的性能。在此實施方案中由于燈與反應管更接近，所以樣本受到相對強的激發(fā)光強度照射，這可以導致樣本降解或光失敏，或稱作“漂白”?？扉T使樣本暴露給光的時間最大程度地減少，因此消除了或顯著減少了漂白的問題。盡管顯示了快門與套殼102相連，但它也可以與燈14′相連，位于導熱板正上方從而也位于樣本的正上方，或者以某種其它方式控制樣本對激發(fā)光的暴光。也可以使用其它機構(gòu)控制這種曝光或設定曝光時間。
可在雙色鏡104和攝像機16a′鏡頭片120之間置放向場透鏡(物鏡)或平凸透鏡130。向場透鏡使由鏡104反射的射線向內(nèi)偏，從而基本上使所有的由樣本和熱交換器22發(fā)射的熒光均射向鏡片120。向場透鏡130最好可滑動地連至套殼102上，以便如本領域普通技術人員顯而易見的，根據(jù)樣本發(fā)射光波長而將透鏡130移向或移離鏡片120。
可將單個濾光鏡或多個濾光鏡(如濾光鏡輪)連至攝像機以只允許某個(或某些)波長被檢測。參照圖15，如本領域常規(guī)所用的那樣，將濾光鏡輪132連至鏡片120上，從而使多種標記物或靶物質(zhì)可以被檢測和被監(jiān)測。這就是說，借助旋轉(zhuǎn)濾光鏡輪使濾光鏡交換位置從而使檢測被限定在所需波長。交換位置的步驟可依據(jù)具體應用在每個退火/延伸期間或在預先選定的循環(huán)數(shù)之后進行，另外，也可以考慮采用可區(qū)分波長的攝像機如光譜成像儀。
參照圖15，最好提供一個加熱的透明或穿透性窗或構(gòu)件134以改善熱循環(huán)條件。構(gòu)件134應至少具有足夠的穿透性以允許樣本有效的激發(fā)和所伴隨產(chǎn)生的熒光的檢測。加熱構(gòu)件或窗134例如可使用石英，并且可被置于反應管26上或略高于它的上方。提供加熱構(gòu)件134一般是為了維持反應混合物的熱循環(huán)溫度曲線使之盡可能貼近預選的熱循環(huán)溫度曲線并最大程度地減少回流。加熱構(gòu)件最好維持在約95-105℃的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選約100℃。即，該窗最好維持在相應于變性溫度的溫度上。構(gòu)件134可以例如用鎳鉻絲加熱，或根據(jù)常規(guī)的實踐用其它的加熱元件加熱。
參照圖17，它顯示了用鎳鉻絲作加熱元件的加熱構(gòu)件，還要注意到盡管顯示加熱元件134覆蓋僅有9個凹陷的熱交換器，但這僅僅是為了簡化該圖。鎳鉻絲136可以嵌于構(gòu)件134中或固定于其表面。鎳鉻絲的鋪敷最好不跨越過熱交換器中的凹陷24，因此不會干擾激發(fā)光和發(fā)射光的光路。鎳鉻絲還要連至將構(gòu)件134的溫度維持在所需溫度的常規(guī)溫度控制器138上。
顯示器最好連至處理器上以顯示諸如靶序列是否存在以及其濃度的數(shù)據(jù)。另外，應用連續(xù)監(jiān)測擴增反應(上文已討論)，用于顯示被測的擴增反應的裝置在擴增反應進行的同時可以被顯示出來。這能使熱循環(huán)次數(shù)減少。例如，如果可以作出反應混合物在相對早期時已含有靶序列的判斷，就可以取出該樣本并將另一樣本置于其位置上，從而增加了樣本的流通量。這一點在以帶有不同反應混合物(如一些用于測試遺傳疾病，另一些用于測試HIV等等)的多至96個小孔裝入熱交換器時，或者當按不同時間裝入混合物時，尤其顯示出其優(yōu)點。
以上是對本發(fā)明具體實施方案的詳盡的描述。應認識到在本發(fā)明范圍內(nèi)可以作出偏離已公開的具體方案，而且對本領域技術人員來講可以進行顯而易見的修改。本發(fā)明的全部范圍在所附權利要求及其等同物中列出。因此，本發(fā)明的權利要求和說明書不應該被認為將保護的全部范圍不適當?shù)乜s小至本發(fā)明命名的范圍內(nèi)。
權利要求
1.一種用于同時監(jiān)測多個核酸擴增反應的裝置，其特征在于包括一個包括在其中形成了多個凹陷的導熱構(gòu)件的熱循環(huán)儀；一個用于同時檢測由所說凹陷發(fā)射出的光的傳感器。
2.根據(jù)權利要求1的裝置，其特征在于它還包括一個光源，該光源在光學上與所說的熱循環(huán)儀相聯(lián)，并且被安排成使光分布到在其中形成了多個凹陷的所說導熱構(gòu)件的一部分上。
3.根據(jù)權利要求1的裝置，其特征在于，它還包括用于產(chǎn)生由所說傳感器檢測到的與每一光發(fā)射凹陷有關的光的平均值的裝置。
4.根據(jù)權利要求1的裝置，其特征在于，還包括根據(jù)為多個循環(huán)和多個核酸擴增反應混合物而預選的溫度對時間的曲線而使所說導熱構(gòu)件進行溫度循環(huán)的裝置，每一種所說的混合物含有一種熒光結(jié)合劑，并被置于一個不同的所說凹陷中;并且所說的光源在所說導熱構(gòu)件的一部分和多個所說的反應混合物上方提供了基本均勻的光通量;所說的傳感器在光學上與所說的導熱構(gòu)件相聯(lián)，以同時檢測來自被所說光通量激發(fā)的每一擴增反應混合物發(fā)出的熒光。
5.根據(jù)權利要求4的裝置，其特征在于，它還包括用于在被檢測熒光的基礎上產(chǎn)生每一被激發(fā)的反應混合物的平均熒光強度值的裝置。
6.根據(jù)權利要求5的裝置，其特征在于，它還包括由所說的平均熒光強度值產(chǎn)生規(guī)范化的熒光強度值的裝置。
7.根據(jù)權利要求1的裝置，其特征在于所說的熱循環(huán)儀導熱構(gòu)件的凹陷是通過其一個表面而形成的，用于接納裝有核酸擴增反應混合物的反應管;所說的傳感器是一個在光學上與所說導熱構(gòu)件相聯(lián)的成像裝置，用于在所說反應管置于所說導熱構(gòu)件的凹陷中時產(chǎn)生所說表面和反應管的圖像。
8.根據(jù)權利要求7的裝置，其特征在于，包括一個在所說導熱構(gòu)件表面上方提供光的光源。
9.根據(jù)權利要求8的裝置，其特征在于其中所說的光源被安排成使光沿著所說導熱構(gòu)件表面基本均勻地分布。
10.根據(jù)權利要求8的裝置，其特征在于，其中所說的光源包括UV燈。
11.根據(jù)權利要求7的裝置，其特征在于，其中所說的成像裝置包括CCD成像陣列。
12.根據(jù)權利要求1的裝置，其特征在于，所說的熱循環(huán)儀的導熱構(gòu)件中形成了多個凹陷，這些凹陷適宜接納核酸擴增反應混合物;并且所說裝置還包括位于所說導熱構(gòu)件上方并與所說熱循環(huán)儀相聯(lián)的套殼;被安排成用于在所說套殼中朝向所說凹陷發(fā)光的光源;置于所說套殼中所說凹陷上方的雙色鏡，所說的雙色鏡透射具有第一波長的光并反射具有不同于第一波長的第二波長的光;和所說的傳感器被安排成用于接收由所說雙色鏡的所說第二表面反射的光。
13.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，其中所說的雙色鏡透射具有相當于激發(fā)光源產(chǎn)生的光波波長的光，并在核酸擴增反應混合物被置于其中一個所說凹陷中且暴露在光源發(fā)射的光中時反射具有相當于從所說混合物發(fā)射的熒光波長的光。
14.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，其中所說的雙色鏡透射具有約220-550nm范圍波長的光。
15.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，其中所說的套殼包括不透明的材料，并被構(gòu)造成為一個在其中安放所說雙色鏡和傳感器的不透光室。
16.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，其中所說的導熱構(gòu)件具有一個上表面，而所說的雙色鏡與所說的上表面形成約45°角。
17.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，其中所說的傳感器包括一個電荷耦合器件(CCD)。
18.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，還包括與所說光源與套殼這二者之一相聯(lián)以便允許所說凹陷在預選時間間隔暴露于所說光源的快門。
19.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，還包括具有透明材料和與其相聯(lián)接的加熱元件的窗，所說的窗在所說凹陷之上，而在所說雙色鏡之下。
20.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，還包括一個位于所說雙色鏡和所說傳感器之間的向場鏡。
21.根據(jù)權利要求12的裝置，其特征在于，還包括與所說傳感器相聯(lián)的濾光器輪。
22.根據(jù)權利要求1的裝置，其特征在于，所說的熱循環(huán)儀的導熱構(gòu)件中形成了多個凹陷，這些凹陷適于接納包括核酸序列和熒光結(jié)合劑的核酸擴增反應混合物;以及所說裝置還包括位于所說導熱構(gòu)件上方并與所說熱循環(huán)儀相聯(lián)的套殼;被安排成用于在所說套殼中發(fā)光的光源;被安排在所說的套殼中的傳感器;和置于所說套殼中所說凹陷上的雙色鏡，所說雙色鏡透射具有相當于激發(fā)光源產(chǎn)生的光波波長的光，并在包括熒光結(jié)合劑的核酸擴增反應混合物被置于導熱構(gòu)件中形成的凹陷之一且暴露于從激發(fā)光源發(fā)出的光中時，反射具有相當于從所說混合物發(fā)出的熒光波長的光，所說的雙色鏡的取向是使得在所說凹陷和所說傳感器之間形成光路。
23.根據(jù)權利要求22的裝置，其特征在于，其中所說的雙色鏡包括第一表面和第二表面，所說的第一表面在總體上面對所說的光源，所說的第二表面在總體上面對所說的凹陷和傳感器。
24.一種用于定量測定樣品中特異性核酸序列含量的方法，包括下列步驟提供多個擴增反應混合物，每個混合物包括不同的但是已知濃度的所說特異性核酸序列和熒光結(jié)合劑;提供一種含有未知濃度的所說特異性核酸序列和熒光結(jié)合劑的擴增反應混合物;將具有已知和未知核酸濃度的所說擴增反應混合物并行地進行多次熱循環(huán);確定為達到一定的熒光強度值對于每個反應混合物所需的循環(huán)數(shù);將為達到所說熒光值的未知核酸濃度的混合物所需的循環(huán)數(shù)與為達到所說熒光值的已知核酸濃度的混合物所需的循環(huán)數(shù)相比較，以獲得所說未知濃度混合物中所說特異性核酸序列的起始含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及同時監(jiān)測多個核酸擴增反應的裝置。為了提供對多個核酸擴增反應的擴增產(chǎn)物的同時的實時監(jiān)測。本發(fā)明裝置的特征在于它包括在其中形成了多個凹陷的導熱構(gòu)件的熱循環(huán)儀(12)和用于同時檢測由所說凹陷發(fā)出的光的傳感器(16a)。
文檔編號G01N21/25GK1107892SQ94115790
公開日1995年9月6日 申請日期1994年8月26日 優(yōu)先權日1993年8月27日
發(fā)明者R·G·樋口, R·M·沃特森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司