專利名稱：羧酸與叔醇的酯化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用脂肪酶酶促制備羧酸酯的方法。
已知(例如從WO-A-8802775.(NOVO Industri A/s)中已知)在酯水解、酯合成和酯交換(酸解、醇解、酯交換)反應(yīng)中使用脂肪酶，但所有這些反應(yīng)都局限于利用伯醇和仲醇。
法國專利說明書FR-A-2,617,501(Soc.Nat.Elf Aquitaine)中甚至提出以類似叔丁醇或叔戊醇的叔醇作為溶劑，在其中進(jìn)行酶促反應(yīng)，這表明預(yù)期此溶劑和待用酶處理的底物之間不發(fā)生任何反應(yīng)。S.Okumura等人在Biochim.Biophys.Acta 575，156-165(1979)中以實(shí)驗(yàn)證實(shí)了此觀點(diǎn)，并在其中研究了經(jīng)微生物脂肪酶的酯合成。黑色曲霉(Aspergillus niger)、德列馬根霉(Rhizopus delemar)、白地霉(Geotrichum Candidum)或圓弧青霉(Penicillum cyclopium)的脂肪酶中無一能合成叔醇、酚或糖醇的酯類(參見表I)。
A.Zaks和A.M.Klibanov發(fā)現(xiàn)豬胰脂肪酶在99％的有機(jī)介質(zhì)中可催化三丁酸甘油酯和多種伯醇或仲醇之間的醇解反應(yīng)(Science224(15 June 1984)1249-1251)。已發(fā)現(xiàn)在叔醇的醇解反應(yīng)中，干的脂肪酶完全沒有活性，但是表I中已顯示經(jīng)濕的豬胰脂肪酶(酶中有占重量3.6％的水)催化的三丁酸甘油酯和叔丁醇之間醇解反應(yīng)的初速度是每100mg脂肪酶22μmol/h，然而表I中未顯示出產(chǎn)物的任何產(chǎn)量。最后I.L.Gatfield描述了(Lebensm.-Wiss.u.-Technol.19(1986)87-88)在米赫毛霉(Mucor miehei)(ex Rapi-dase，Seclin，F(xiàn)rance)脂肪酶的影響下，在非水非均相系統(tǒng)中酯的酶促合成。已發(fā)現(xiàn)伯和仲脂肪醇可有效酯化，而叔醇卻不行。表1中叔丁醇顯示出與油酸(酸和醇摩爾數(shù)相等；使用3wt％的米赫毛霉酶；在室溫下在密閉容器中磁力攪拌3天)之間酯化反應(yīng)的程度為14％。本申請(qǐng)的申請(qǐng)人重復(fù)了此實(shí)驗(yàn)卻未生成任何油酸叔丁基酯，然而可假定測出的14％的酯化反應(yīng)程度實(shí)際上與叔丁醇中存在的雜質(zhì)(特別是仲丁醇)相關(guān)，因?yàn)樗褂玫臋z測技術(shù)是基于滴定，它不能把各個(gè)酯類區(qū)分開來。
這篇文章中缺少的任何酸值和酯化值不允許任何進(jìn)一步的推斷，但在他們的德國專利申請(qǐng)DE-A-3,108,927(此文章中提及)中，發(fā)明人從酸值和酯化值中計(jì)算出了轉(zhuǎn)化水平，這在此類反應(yīng)中是很平常的，但盡管在此專利申請(qǐng)中也使用了米赫毛霉脂肪酶(酯酶30,000；商標(biāo)，ex Rapidase，Seclin，F(xiàn)rance)，可此發(fā)明清楚地局限于伯醇和仲醇，它清楚地聲明在此酶促反應(yīng)中叔醇無反應(yīng)性。
因此直至現(xiàn)在人們?nèi)哉J(rèn)為在從醇和酸酶促合成酯的過程中，不可能合成其醇部分在酯鍵周圍有立體位阻的酯，即衍生于叔醇的酯。然而這種酶促酯合成的可用性是有價(jià)值的，特別是在“化學(xué)純的”酯的合成中，其中不存在任何痕量的催化劑或副產(chǎn)物，也沒有形成顏色的危險(xiǎn)。
本發(fā)明提供了這種制備有立體位阻的酯類的酶促方法。已發(fā)現(xiàn)某些脂肪酶，即那些對(duì)其醇部分在酯鍵周圍有立體位阻的酯具有水解活性的脂肪酶，能夠利用醇和酸組分來制備這種酯。
因此，本發(fā)明涉及使用脂肪酶在低水狀態(tài)下酶促制備羧酸酯的方法，它事實(shí)上有如下特征使用脂肪酶來制備其醇部分在酯鍵周圍有立體位阻的酯類，此脂肪酶選自對(duì)相同酯類具有水解活性的脂肪酶種。優(yōu)選的脂肪酶是南極洲假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A。已知南極洲假絲酵母脂肪酶含有兩種組分脂肪酶A和B，它們可通過例如凝膠過濾從脂肪酶中產(chǎn)生。也可通過重組DNA技術(shù)制備它們。脂肪酶A比脂肪酶B具有更好的熱穩(wěn)定性，但是已發(fā)現(xiàn)脂肪酶B不能合成本發(fā)明的有立體位阻的酯類。也可使用就叔醇酯來說底物活性類似于南極洲假絲酵母脂肪酶A的脂肪酶種。
使用發(fā)明所用特定脂肪酶的突變體和變異體也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。已發(fā)現(xiàn)適用于本發(fā)明的其它脂肪酶是來自皺摺假絲酵母(Candida rugosa)、白地霉和Candida cylindracae的脂肪酶。
優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所使用的特定脂肪酶可通過本來已知的任何方法，例如K.Mosbach(編輯)在Methods in Enzymology.Volume44，“Immobilized enzymes”.Academic Press.New York，1976中描述的方法固定到不溶性的無機(jī)或有機(jī)載體上。
特別優(yōu)選的是如歐洲專利說明書EP-B-0,232,933(AKZO N.V)和EP-B-0,322,213和EP-A-0,424,130(both Unilever NV)中所述的固定化方法。通常這些方法包括從水溶液中將脂肪酶吸附到疏水顆粒、多孔固體上，它們選自疏水聚合物，如鏈烯同聚物或共聚物、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚酰胺或者疏水無機(jī)材料，如硅烷化過的二氧化硅、玻璃或陶瓷。預(yù)先用極性、與水互溶的有機(jī)溶劑例如乙醇處理固體材料，在所述溶劑中固體材料是不溶性的，但是溶劑不會(huì)使脂肪酶失活。適當(dāng)材料的例子是Accurel EP100(商標(biāo)、ex AKZO、荷蘭)和硅烷化過的二氧化硅Grace 6 1500 MP(商標(biāo)、多孔二氧化硅，ex W.RGrace，德國)。另外也可如歐洲專利說明書EP-B-140,542(NovoNordisk A/S)中所述將脂肪酶固定在離子交換樹脂上。從水溶液中將脂肪酶吸附到弱的陰離子交換樹脂(例如Duolite ES-568(商標(biāo)、ex Rohm and Haas，法國))上。
此方法可連續(xù)進(jìn)行或分批進(jìn)行。優(yōu)選地，應(yīng)通過蒸餾、全蒸發(fā)或吸附到分子篩上不斷除去反應(yīng)所形成的水。進(jìn)行反應(yīng)的溫度在約20℃至約90℃之間變化，優(yōu)選從50℃至80℃。
可以改變醇和羧酸各自的用量，但優(yōu)選使用大致等摩爾量的醇和羧酸。按照本發(fā)明的方法中的反應(yīng)可通過從系統(tǒng)中除去水來驅(qū)動(dòng)，例如通過共-蒸餾，加入干燥劑(如分子篩)、冷凝或冷卻表面技術(shù)或全蒸發(fā)以除去水。
基于需酯化的醇和酸的總重量，酶的用量可達(dá)到重量的30％，但優(yōu)選使用占重量1％至20％的酶。
按照本發(fā)明的方法可在不添加水時(shí)進(jìn)行，但是對(duì)那些需要水的酶而言，水的存在量(基于起始反應(yīng)混合物的總量)至多占重量的5％，優(yōu)選至多占重量的2.5％。可被酯化的酸是具有2至54個(gè)碳原子的飽和或不飽和、直鏈或支鏈的一元羧酸，例如乙酸、癸酸、月桂酸、硬脂酸、異硬脂酸、肉豆蔻酸和不飽和的或多不飽和的脂肪酸，如油酸、亞油酸等等。也可使用多元羧酸如壬二酸和聚合酸(通過聚合具有8至24個(gè)碳原子的不飽和的脂肪酸得到如三聚物酸、二聚物酸或氫化二聚物酸。
按照本發(fā)明，可使用的叔醇可具有4至54個(gè)碳原子，如叔丁醇，叔戊醇、格爾伯特醇、萜烯醇等等。最好側(cè)鏈所含碳原子數(shù)不超過2個(gè)。所述叔醇優(yōu)選地是一元醇。
在酯混合物的制備中，可使用一元羧酸的多種混合物。
下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步闡明本發(fā)明。
實(shí)施例I在容器中將油酸(純度為90％，171.55g)與叔醇(純度超過99％，45.0g)和4.3g蒸餾水?dāng)嚢杌旌稀?5g固定化的南極洲假絲酵母脂肪酶A(Code SP433，ex Novo Industri、丹麥)(固定在多孔聚丙烯珠上，Accurel EP100 ex AKZO)加入其中，將反應(yīng)混合物的溫度升高至60℃并維持117小時(shí)。大約每隔24小時(shí)對(duì)混合物施以真空處理，典型地為20毫巴持續(xù)1小時(shí)以通過與叔丁醇共蒸餾除去水。每次真空除水后再在反應(yīng)混合物中加入45g叔丁醇。
反應(yīng)結(jié)束后，使用300g氧化鋁(基本活性(basic activity)2)通過柱純化以除去游離的脂肪酸，60-80石油醚用作洗脫劑。這樣可生成66g無水產(chǎn)物，通過GC分析顯示出它是叔丁基油酸酯，它具有按油酸計(jì)算的32％的轉(zhuǎn)化率。終產(chǎn)物含有極少量的游離酸(酸值＝0.15)。
實(shí)施例II將油酸(純度超過99％，828mg)與叔戊醇(純度超過99％，258mg)和23mg蒸餾水混合，加入62.5mg如實(shí)施例I的固定化南極洲假絲酵母脂肪酶A(Code SP433，ex NovoIndustri、丹麥)。將反應(yīng)混合物的溫度升至60℃，22小時(shí)后，通過對(duì)樣品進(jìn)行GC分析測定反應(yīng)所形成的叔戊基油酸酯的量。除去70.4mg，使用60-80石油醚作為洗脫劑從氧化鋁柱(基本活性2)上洗下混合物以除去游離脂肪酸，使用2.5mg二十碳烷作為GC分析的內(nèi)標(biāo)，所得終產(chǎn)物的產(chǎn)率按油酸計(jì)算為14.8％，通過GCMS證實(shí)產(chǎn)物本身。
實(shí)施例III按與實(shí)施例II所述相同的方法，使用780mg里哪醇(純度為97％)和1427mg油酸(純度為99％)和44mg水制備里哪基油酸酯。加入125mg固定化的南極洲假絲酵母脂肪酶A(Code SP433ex Novo Industri、丹麥)，將反應(yīng)混合物的溫度升高至60℃，所得終產(chǎn)物的產(chǎn)率按油酸計(jì)算產(chǎn)率為3.0％，通過GCMS證實(shí)產(chǎn)物本身。實(shí)施例IV在此實(shí)施例中研究了大量固定化的脂肪酶(固定在如實(shí)施例I所述的大孔聚丙烯上(Accurel，如EP-B-322,213中所述)形成有立體位阻的酯類的適宜性。
在磁力攪拌容器中將油酸(純度超過99％，548mg)和叔丁醇(純度超過99％，144mg)和14mg蒸餾水混合，加入40mg脂肪酶催化劑(見表1)。
將反應(yīng)混合物的溫度升至40℃，持續(xù)期為64小時(shí)。
反應(yīng)結(jié)束后，使用氧化鋁(基本活性2)通過柱純化除去游離的脂肪酸；60-80石油醚用作洗脫劑。使用2.5mg二十碳烷作為內(nèi)標(biāo)通過對(duì)樣品進(jìn)行GC分析測定反應(yīng)所形成的叔丁基油酸酯的量。
表1
從這些實(shí)驗(yàn)中可明顯看出僅有少量特定的脂肪酶可用于按照本發(fā)明的方法。
比較實(shí)施例A在磁力攪拌容器中將油酸(純度超過99％，858mg)與叔丁醇(純度超過99％，225mg)和22mg蒸餾水混合，加入62.5mg固定化的脂肪酶催化劑(天然米赫毛霉，Code SP 282，ex NovoIndustri A/S、丹麥)，在另一分開的混合物中加入62.5mg固定化的脂肪酶，它是經(jīng)克隆的米赫毛霉(Code SP 392，ex Novo IndustriA/S、丹麥)。
將反應(yīng)混合物的溫度升至40℃并維持20小時(shí)，反應(yīng)期結(jié)束后，以60-80石油醚為洗脫劑，使用氧化鋁(基本活性2)通過柱純化除去游離的脂肪酸。使用2.5mg二十碳烷作為內(nèi)標(biāo)，通過對(duì)樣品進(jìn)行GC分析測定反應(yīng)所形成的叔丁基油酸酯的量。
表2
比較實(shí)施例B使用豬胰脂肪酶進(jìn)行如Zaks和Klibanov(Science 224、P1249-1251，1984)所述的比較實(shí)驗(yàn)，另外還將南極洲假絲酵母脂肪酶A和兩個(gè)其它的醇裂解酯交換反應(yīng)進(jìn)行了比較。
將甘油三丁酰甘油酯(純度大于99％，0.975g)與叔丁醇(純度大于99％，0.2392g)和8.5mg(占重量的0.7％)蒸餾水混合，加入125mg豬胰脂肪酶(PPL/EP 100 ST623)，將反應(yīng)混合物的溫度升至40℃，持續(xù)24小時(shí)。
按相同的方法，使用豬胰脂肪酶研究了兩個(gè)其它的醇裂解反應(yīng)。
將甲基油酸酯(純度大于99％，0.859g)與叔丁醇(純度大于99％，0.2146g)和7.5mg(占重量的0.7％)蒸餾水混合，加入125mg適當(dāng)?shù)呢i胰脂肪酶并在40℃下溫育24小時(shí)。
按與前述實(shí)施例相同的方法將類似的甲基油酸酯與正丁醇混合以作為一系列對(duì)照反應(yīng)，通過對(duì)樣品進(jìn)行GC分析測定產(chǎn)物的形成，結(jié)果概括于下列表3中表3
這些實(shí)驗(yàn)清楚地表明當(dāng)叔醇存在時(shí)Zaks和Klibanov的結(jié)果呈陰性。
權(quán)利要求
1.一種在低水狀態(tài)下使用脂肪酶酶促制備羧酸酯的方法，其特征在于使用脂肪酶制備其中醇部分在酯鍵周圍有立體位阻的酯類，所述脂肪酶選自對(duì)相同酯類具有水解活性的脂肪酶種。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述脂肪酶是南極洲假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述脂肪酶是就叔醇酯來說底物活性類似于南極洲假絲酵母脂肪酶A的脂肪酶種。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述有立體位阻的酯的醇部分選自具有4至54個(gè)碳原子的叔醇及其混合物。
5.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述叔醇的側(cè)鏈所含的碳原子數(shù)不超過2個(gè)。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述有立體位阻的酯的醇部分是叔萜烯醇。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述有立體位阻的酯的醇部分是一元叔醇。
8.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述有立體位阻的酯的酸組分選自具有2至54個(gè)碳原子的飽和或不飽和、直鏈或支鏈的一元羧酸，多元羧酸及其混合物。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于存在的水的量按起始反應(yīng)混合物的總量計(jì)算至多占其重量的5％。
10.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于存在的水的量按起始反應(yīng)混合物的總量計(jì)算至多占其重量的2.5％。
11.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述脂肪酶被固定在不溶性的無機(jī)或有機(jī)載體上。
12.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于反應(yīng)可通過從系統(tǒng)中除去水來驅(qū)動(dòng)。
全文摘要
使用南極洲假絲醇母(Candida antarctica)脂肪酶A或具有就叔醇酯酶來說底物活性類似于南極洲假絲酵母脂肪酶A的脂肪酶種，在低水狀態(tài)下酶促制備醇部分在酯鍵周圍有立體位阻的酯類，即衍生于叔醇的酯類。
文檔編號(hào)G01J1/02GK1129956SQ94193198
公開日1996年8月28日 申請(qǐng)日期1994年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年7月2日
發(fā)明者J·A·波斯利, J·卡西, A·R·麥克利, G·邁科克 申請(qǐng)人:尤尼劍馬化學(xué)股份有限公司