專利名稱：滅活的呼吸合胞體病毒疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是滅活呼吸合胞體病毒疫苗。
相關(guān)申請本申請是于1993年8月6日提交的、共同未決的美國專利申請08/102,742號的部分繼續(xù)申請。
背景技術(shù)：
人呼吸合胞體病毒是引起嬰兒和幼兒下呼吸道感染的主要病因(ref.1至3-a，公開內(nèi)容的末尾附有參考文獻目錄，而目錄中的每篇文獻都附有此中文獻之外的參考文獻)。全球每年發(fā)生6千5百萬例感染，導(dǎo)致160,000例死亡(ref.4)。僅在美國一地，每年就有100,000名兒童因為RS病毒引起的肺炎和細支氣管炎需住院治療(ref.5至6)。美國每年用于為RS病毒感染兒童提供住烷和巡訪治療的花費超過3億4千萬美元(ref7)。由RS病毒引起的重下呼吸道疾病主要發(fā)生于2至6個月的嬰兒(ref.8)。在美國每年大約有4千幼兒死于RS病毒和3型副感冒病毒(PIV-3)感染引起的重呼吸道疾病造成的并發(fā)癥。世界衛(wèi)生組織(WHO)及國立過敏及傳染病研究院(NIAID)的疫苗咨詢委員會已將RS病毒列為第二位疫苗制備對象僅次于HIV。
RS病毒是副粘液病毒科Pasamyxouilidae科肺病毒屬的一個成員(ref.2)。兩個主要保護性抗原是被膜融合(F)及附著(6)糖蛋白(ref.9)。F蛋白從68KDa前體分子(FU)形式合成。經(jīng)蛋白水解分裂成二硫鍵連接的F1(48KDa)和F2(20KDa)多肽片段(ref.10)。G蛋白(33KDa)被嚴(yán)重的O-糖基化而生成表觀分子量為90KDa的糖蛋白(ref.11)。已確定了RS病毒的二個主要的亞型A型和B型(ref.12)。這些亞型之間的主要抗原區(qū)別發(fā)現(xiàn)在G糖蛋白(ref.7，13)上。
尚無安全有效的RS病毒疫苗，因而這是迫切需要的。制備RS病毒疫苗的方法包括用甲醛滅活病毒、分離冷適應(yīng)和/或溫度敏感突變株病毒以及分離病毒的保護性抗原。臨床試驗結(jié)果表明減毒活疫苗和福爾馬林滅活疫苗都不能適當(dāng)?shù)乇Ｗo被接種者抵抗RS病毒感染(ref.14至16)。用冷適應(yīng)的和/或溫度敏感RS病毒突變株進行鼻飼麥理所遇到的問題包括臨床發(fā)病、遺傳不穩(wěn)定性，以及過度減毒(refs 17至19)。皮下給藥活RS病毒疫苗也無效(ref.20)。滅活的RS病毒疫苗的典型制備方法是使用甲醛為滅活劑。Murphy等人(ref.21)報道了關(guān)于經(jīng)福爾馬林滅活的RS病毒免疫的幼兒和兒童的免疫應(yīng)答的資料(ref.21)幼兒(2至6個月)產(chǎn)生了高滴度的抗F糖蛋白抗體，但是對于G蛋白應(yīng)答微弱。較年長的個體(7至40個月齡)生成了F和G抗體，其滴度可與感染了RS病毒的兒童體內(nèi)抗體滴度相比。然而，幼兒和兒童產(chǎn)生的中和抗體的水平比感染了天然RS病毒的同樣年齡的個體低。免疫應(yīng)答是不平衡的對RS病毒的主要免疫原性蛋白-F(融合)和G(附著)蛋白有高滴度的抗體，但是中和抗體的滴度很低，部分原因也許是經(jīng)福爾馬林處理時，F(xiàn)和G糖蛋白的重要抗原決定簇改變了。而且，與未經(jīng)免疫的個體相比，一些接種過福爾馬林滅活疫苗的幼兒在此后感染天然RS病毒時，所患下呼吸道疾病更為嚴(yán)重(refs.15，16)。因此，福爾馬要滅活的RS病毒疫苗確實不能用于人類。
不正常的免疫應(yīng)答的跡象也在用福爾馬林滅活的RS病毒免疫棉鼠中見到(ref.22)。而且，在棉鼠體內(nèi)評價RS病毒的福爾馬林滅活疫苗的工作表明。當(dāng)活病毒侵襲時，經(jīng)免疫的動物發(fā)生了進一步的肺部組織病變(ref.23)。
福爾馬林滅活的RS病毒疫苗制劑的致病增強的機制有待確定，但是成為有效RS病毒疫苗制備的主要障礙。這種強化可能部分歸因于福爾馬林活化了F和G糖蛋白。此外，提出了一種非RS病毒特異的致病增強的機制針對疫苗制劑中出現(xiàn)的污染的細胞和血清的組分所發(fā)生的免疫應(yīng)答，是加重的疾病的部分原因(ref 24)。確實，將接種過HEp-2細胞裂解物的小鼠和棉鼠，并用HEp-2細胞上生長的RS病毒侵染，發(fā)生了強化的肺炎反應(yīng)。
而且，在酸性pH洗脫，經(jīng)免疫親和層析純化的RS病毒糖蛋白是免疫原性的也是保護性的，但是卻在棉鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫強化(refs.22，25)。
但依然明顯地需要致免疫制劑。包括既能有效地提供保護抵抗RS病毒引起的疾病、而且也不產(chǎn)生不期望的副作用，例如免疫強化的疫苗。也需要用于診斷RSV感染的抗原和產(chǎn)生抗體(包括單克隆抗體)的免疫原，而該抗體特異性地識別RSV蛋白，可以用于，例如，診斷RS病毒引起的疾病。
最近綜述文章總結(jié)了專業(yè)人員所承認的制備RSV疫苗的方法(refs.2、31至35)，沒有一篇提議制備滅活的RSV疫苗。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的通過滅活純化的RS病毒制備這樣一些抗原和免疫原的方法。
本發(fā)明的一個方面是提供一種制備致免疫組合物的方法，這種致免疫組合物能夠在經(jīng)過免疫的宿主，特別是人類宿主體內(nèi)引起呼吸合胞體(RS)病毒特異的、由多個步驟組成的免疫應(yīng)答。首先，把RS病毒生長在合適的細胞株上然后收集病毒。收獲的病毒在非變性條件下純化，以產(chǎn)生實質(zhì)上無細胞和血清組分的純化病毒。然后用滅活劑滅活純化的病毒，以制備一種不感染的、無免疫強化的、致免疫的RS病毒。這種病毒被通稱為致免疫組合物。
滅活劑可以是β丙酮酸內(nèi)酯，這是一種非離子去垢劑，包括正辛基-α-D吡喃葡糖苷及正辛基β-D吡喃葡糖苷，或抗壞血酸。
對收獲的病毒所進行的純化步驟可以優(yōu)選地用微過濾除去細胞碎片、切向流超濾，特別是采用一種大約100KDa至300KDa命名的分子量的阻斷膜除去血清組分，通過超速離心沉淀經(jīng)超濾的材料以進一步除去血清組分，將沉淀物進行蔗糖密度梯度離心實現(xiàn)。另一種方法是，切向流超濾的保留時間可以在離子交換層析之后，再進行凝膠過濾以進一步除去血清組分。
本方法提供了一種新的致免疫組合物。該組合物能在經(jīng)構(gòu)成本發(fā)明另一方面免疫過的宿主體內(nèi)引起RS病毒特異的免疫應(yīng)答。這樣致免疫組合物包括純化的、滅活的、實質(zhì)上不含細胞和血清組分的RS病毒，而且它是非傳染的、非免疫強化的，致免疫和保護的、因之也是一個載體。這種致免疫組合物被明確定義為對人類宿主體內(nèi)給藥以保護人類免于RS病毒引起疾病的疫苗。致免疫組合物的載體可以包括一種佐劑。這種致免疫組合物可以被明確地定義為一種可以以針劑、鼻飼或口服形式給藥的疫苗。
本發(fā)明也提供了一種免疫宿主，特別是人類宿主抵抗RS病毒引起疾病的方法，包括對宿主給藥以在此處提供的致免疫組合物的有效劑量。以這種方式免疫的宿主可以從幼兒、幼齡兒童、孕婦、育齡婦女、老年人、免疫損傷個體及其他敏感人群中選擇。
此中規(guī)定的滅活病毒也可以用作診斷試劑檢測RS病毒感染。所以，更進一步說，本發(fā)明包括確定與RS病毒蛋白起特異性反應(yīng)的抗體在樣品中出現(xiàn)的方法，包括以下步驟(a)將樣品同本發(fā)明的致免疫組合物接觸，以產(chǎn)生包含有非傳染的、非致免疫的、和致免疫的RS病毒和任何在樣品中出現(xiàn)的抗體起特異性反應(yīng)的復(fù)合物，以及(b)確定復(fù)合物的產(chǎn)生。
另外，本發(fā)明提出了一種確定RS病毒蛋白在樣品中出現(xiàn)的方法，包括以下步驟(a)用本發(fā)明的致免疫組合物免疫受試者以制造RS病毒蛋白特異的抗體；(b)將樣品和抗體接觸，以產(chǎn)生包含在樣品中出現(xiàn)的任何一種RS病毒蛋白和RS病毒蛋白特異抗體的復(fù)合物；以及(c)確定復(fù)合物的產(chǎn)生。
本發(fā)明進一步提供了一種診斷試劑盒，用以確定樣品中和RS病毒蛋白特異性反應(yīng)的抗體的出現(xiàn)，包括(a)本發(fā)明的致免疫組合物；(b)將非傳染的，非免疫強化的、非致免疫的RS病毒和樣品接觸，以生成包括非傳染的、非免疫強化的、致免疫的RS病毒和樣品中出現(xiàn)的任何一種所說的抗體的復(fù)合物的方法，以及(c)確定復(fù)合物生成的方法。
念及以前在RS病毒疫苗制備上的專業(yè)困難，令人驚訝的是此中敘述的方法規(guī)定的致免疫組合物既展現(xiàn)了免疫原性和保護能力，同時又是非感染的和非免疫強化的。
發(fā)明詳述在某一方面，本發(fā)明涉及一種可被接受用作人疫苗的滅活的呼吸合胞體病毒的制備。把RS病毒的A亞型或B亞型，在受控制的發(fā)酵罐中組織培養(yǎng)的疫苗級細胞株上生長，特別可以是VERO細胞。在收獲病毒之后，病毒被純化然后被滅活以生成滅活RS病毒疫苗。
細胞的生長(黑體字)疫苗級細胞株，例如非洲綠猴腎細胞(VERO)，一般生長在微載體小株(Cytodea-1)上。這種小株一般在緩沖液中溶脹，例如pH大約在6.9至8.2的無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液(PBS)，在室溫下輕柔振蕩(30至50rpm)經(jīng)2至4小時，洗過的小株在110℃至130℃滅菌30到60分鐘，并置于細胞培養(yǎng)液中，例如CMRL 1969，放入搖瓶或小的(2至10升)或大的(20至2000升)控制發(fā)酵罐中。然后用培養(yǎng)液，例如補充了小牛血清的CMRL 1969培養(yǎng)液中的疫苗級細胞(例如0.5×105到2×105細胞/ml濃度)在容器里接種。
RS病毒的生長(黑體字)一旦細胞長滿了大約80至90％(接種細胞3至5天后)，傾去培養(yǎng)上清液，用培養(yǎng)液例如CMRL 1969洗一遍，然后，用在不含F(xiàn)BS的CMRL 1969中的病毒感染細胞。在病毒吸附之后，被感染細胞用培養(yǎng)液洗滌，在感染之后的5至7天監(jiān)測病毒的生長。
病毒的處理和濃縮(黑體字)收獲的病毒在非變性條件下純化使其在實質(zhì)了無細胞組分和血清組分。這種純化可以以任何便利的方法實現(xiàn)。在一種這樣的方法中，RS病毒上清液經(jīng)微濾(0.22至8μm孔徑濾膜)除去細胞碎片。清亮的病毒液通過帶有阻斷分子量大約在100至300KDa之間的超濾膜的切向流超濾可以被濃縮以除去血清組分。
濃縮過的RS病毒經(jīng)受進一步純化，以作為抗原以及用于致免疫制劑。一種方法是濃縮過的病毒經(jīng)超速離心而沉淀，超速離心的上清液被傾去，因而進一步除去血清組分。沉淀的病毒重懸于PBS或其他合適的基質(zhì)中。濃縮過的病毒然后通過蔗糖密度梯度超速離心而純化。另一種方法是，切向流超濾步驟中，保留物質(zhì)在經(jīng)凝膠過濾之后，進行離子交換層析以進一步除去血清組分。生成的RS病毒材料經(jīng)超速離心而再次沉淀。沉淀純化的RS病毒重懸于PBS中，儲于-70℃?zhèn)溆谩?br> 病毒滅活(黑體字)下一步是滅活純化RS病毒。這樣的滅活通過使用能為純化病毒提供一種非感染的、非免疫強化的和致免疫的形式的物質(zhì)來實現(xiàn)。本步驟中采用的滅活劑一般包括β-丙酮酸內(nèi)酯、抗壞血酸或非離子去垢劑。在滅活步驟中可采用的非離子去垢劑中有一些吡喃葡糖苷，包括正辛基-β-D吡喃葡糖苷及正辛基-α-D吡喃葡糖苷。
同提供一種非傳染的、非免疫強化的以及致免疫的材料的愿望相一致的任何適合需要量的滅活劑以及任何一種期望的反應(yīng)條件均可采用。
例如，RS病毒可以使用大約濃度為0.1％的β-丙酮酸內(nèi)酯(BPL)溶液處理30至120分鐘或抗壞血酸處理大約24小時，溫度是37℃，要恒定振蕩。殘留BPL可以通過用PBS透析從滅活樣品中除去，所采用的透析袋是10,000至20,000分子量膜。
棉鼠的免疫原性研究(黑體字)該方法所提供的經(jīng)純化和滅活的RS病毒材料是致免疫的保護性的同時又是非傳染的。這個結(jié)論是通過免疫原性RS病毒物質(zhì)在棉鼠體內(nèi)的評價。包括如下報道的它們保護動物免受活的RS病毒侵染的能力得到的。此中規(guī)定的疫苗制劑引出RS病毒特異的中和抗體并保護棉鼠免受活病毒侵染。
顯然對于本專業(yè)技術(shù)人員來說，本發(fā)明的多種實施方案在疫苗這一領(lǐng)域有著許多應(yīng)用，診斷、治療呼吸合胞病毒引起的疾病，以及生產(chǎn)免疫試劑。關(guān)于此類應(yīng)用的不加局限的進一步討論，將在下面進一步敘述。
疫苗制備和應(yīng)用(黑體字)適于用作疫苗的免疫組分，可能如此中所公開的方法那樣，從滅活RSV制備。疫苗在產(chǎn)生了抗RSV抗體的受試者中體內(nèi)引出免疫應(yīng)答。假如接種過的受試者被RSV侵染時，抗體和病毒結(jié)合并滅活病毒。
致免疫組分包括可能制備成液體溶液或乳劑形式的針劑的疫苗。滅活的RSV可與藥學(xué)上能接受的匹配的賦形劑混合。這些賦形劑包括水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇，及其復(fù)合物。另外致免疫組分及疫苗還可以包含輔助物質(zhì)，例如保濕劑或乳化劑，pH緩沖劑，或用于提高其有效性的佐劑。實現(xiàn)佐劑效果的方法包括使用一些試劑，如氫氧化鋁或磷酸鹽(鋁)，通常以百分之0.05至0.1濃度溶于磷酸鹽緩沖液中。致免疫組分可以通過皮下或肌肉注射腸胃外給藥。另一種方法是，按本發(fā)明所產(chǎn)生的致免疫組分，可以被明確定義為以及可以采用粘膜表面給藥引起免疫應(yīng)答。因此，致免疫組分可以通過，例如，鼻腔或口腔的途徑而在粘膜表面給藥。此外，其他給藥方法包括栓劑，或口服配方也都是可取的。對于栓劑、粘合劑或載體來說，包括，例如，多聚(亞烷基)二醇和甘油三酯。口服藥方包括通常采用的賦形劑例如，藥用級的糖精，纖維素以及碳酸鎂。這些組分可以采用溶液，懸液、片劑、藥丸、膠囊、持續(xù)釋放的成方的或粉末的形式，可以含有1％至95％的此中規(guī)定的滅活RSV。致免疫制劑和疫苗以與劑量中規(guī)定相匹配的情況給藥，以這樣的量給藥在藥學(xué)上將是有效的，保護性的和致免疫的，給藥的量取決于受試者，包括，例如，個體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，以及，假如必需的話，產(chǎn)生細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。所要求的給藥的精確的活性成分的量取決于操作者的判斷。然而，本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以容易地確定合適的劑量范圍。初次給藥及輔助注射的合適的方式也是變化的，但是可以包括初始給藥然后有隨后給藥。劑量也可以取決于給藥途徑并隨宿主的大小而變化。
據(jù)本發(fā)明所載，一般在致免疫組分中滅活RS病毒的濃度大約是1％至95％。一種含有僅有一種病原體的抗原性物質(zhì)的疫苗是一種單價疫苗。含有幾種病原體的抗原性物質(zhì)的疫苗是復(fù)合疫苗，也屬于本發(fā)明的范疇。這種復(fù)合疫苗含有例如來自于不同病原體的、或來自于同一病原體的不同變異株、或來自于不同病原體的組合的物質(zhì)。
免疫測定(黑體字)本發(fā)明的滅活RSV制劑可以用作免疫原，以產(chǎn)生與RSV蛋白起特異性反應(yīng)的抗體(包括單克隆抗體)，在此RSV蛋白是免疫測定的抗原，免疫測定包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫吸附測定(RIA)以及其它非酶聯(lián)抗體結(jié)合測定或本專業(yè)所公知的檢測細菌抗體的方法。在ELISA測定中，滅活的RSV被固定到選擇的表面上，例如，能夠結(jié)合蛋白的表面比如聚苯乙烯微滴度板的小孔。在經(jīng)過洗滌以除去不完全吸附的病毒之后，非特異性蛋白例如已知針對測試樣品為抗原性中性的牛血清白蛋白(BSA)溶液結(jié)合到選擇過的表面上。這樣封閉了固定化表面的非特異吸附位點，因而減弱了由表面的非特異結(jié)合引起的背景。
固定化表面然后和樣品，例如臨床材料或生物學(xué)材料相接觸，以一種引導(dǎo)免疫復(fù)合物(抗原/抗體)形成的方式進行測試。這可以包括以稀釋劑，如BSA溶液，牛γ球蛋白(BGG)和/或磷酸鹽緩沖液(PBS)/Tween，稀釋樣品。將樣品在25℃至37℃范圍內(nèi)溫孵2至4小時。溫孵之后，洗滌接觸過樣品的表面以除去非免疫復(fù)合物物質(zhì)。洗滌步驟包括用溶液洗滌，例如PBS/Tween或硼酸緩沖液。在測試樣品和結(jié)合的滅活RSV形成特異性免疫復(fù)合物、隨之洗滌之后，免疫復(fù)合物形成的發(fā)生甚至其數(shù)量，都可以通過將免疫復(fù)合物和對第一抗體特異的第二抗體相反應(yīng)而測定。如果測試樣品是人來源的，第二抗體則是對人免疫球蛋白特異的抗體，通常是ZgG。為了提供測試方法，第二抗體可以有相連的活性如一種酶活性，可以在與合適的發(fā)色底物共孵育時，產(chǎn)生發(fā)色反應(yīng)。通過測定發(fā)色的程度，例如使用可見光分光光度計，可以進行定量。
實施例以上公開內(nèi)容概括地描述了本發(fā)明。參閱下面特定的實施例將會獲得更全面的理解。描述這些實施例的唯一目的是說明本發(fā)明，而不是企圖限制本發(fā)明的范圍。形式的改變及等價物的替代被認為是環(huán)境使然或出于權(quán)宜。盡管此中采用特定的用語，這種用語的目的是為了描述而不是為了限制。
測定半數(shù)組織培養(yǎng)物感染劑量(TCID50/mL)，空斑及中和滴度的方法在公開內(nèi)容中沒有詳盡描述，但在科技文獻中有詳盡的報道并為本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所熟知。蛋白質(zhì)濃度以雙辛可寧酸法(BCA)測定，正如Pierce Manual(23220，23225；Pieice Chemical Company，U.S.A.)所描述，此中附有參考文獻。
CMRL 1969培養(yǎng)基用于細胞培養(yǎng)和病毒生長。此項工作中所用細胞是疫苗級非洲綠猴腎細胞(VERO lot M6)，從Institut Mésieux獲得。所用RS病毒是亞型ARS病毒(Long and A2Stsains)，從American Type Cultase Collection獲得，以及被稱為Tracy andRSV-3-DiT的新近從臨床分離的亞型A。在下面的實施例中用每種RSV都獲得了可以比較的結(jié)果。
實施例1本實施例描述了非洲綠猴腎細胞(VERO，Lot，M6)的生長。
非洲綠猴腎細胞生長在微載體小珠上(Cytodex-1，Phasmacia)，小珠濃度是2.5g/L，在pH 8.0的無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液中室溫輕柔振搖(sorpm)膨脹。溫孵之后，傾去PBS液再用1.5L PBS沖洗小珠。傾去上清，用PBS定容至2L。微載體小珠于121℃，蒸汽消毒45分鐘，用CMRL 1969細胞培養(yǎng)基在大發(fā)酵罐(40L)平衡。在培養(yǎng)容器中接種VERO，M6細胞，培養(yǎng)基是補充了胎牛血清(終濃度是5％)的CMRL 1969。
實施例2本實施例描述了RS病毒在組織培養(yǎng)物上的生長。
細胞一旦長滿了90％，傾去培養(yǎng)上清用CMRL 1969培養(yǎng)基洗滌細胞。細胞在無外加FBS的培養(yǎng)基中被RS病毒感染，其感染頻率是0.001。37℃輕柔振搖1小時使病毒吸附在細胞上。吸附之后，細胞用CMRL 1969培養(yǎng)液洗滌一遍，用CMRL 1969培養(yǎng)基溫孵。感染之后十天，收集培養(yǎng)液(Haruesr I)，按照實施例3所描述的處理，加入20％蔗糖貯于-70℃。往發(fā)酵罐內(nèi)加入CMRL 1969，將感染病毒的細胞繼續(xù)溫孵4天以收獲第二批病毒(Haruest II)。第二批病毒收集物按實施例3中的描述處理。液體中感染病毒的滴度用空斑測定法檢測。
實施例3本實施例描述了RS病毒的處理把在感染后的10天和14天收集的、來自于感染RS病毒的VERO細胞的病毒液體(Haruest I和II)分別處理。每一批病毒收集物用5μm孔徑濾膜(終端過濾)微濾以除去細胞碎片。澄清的病毒上清液通過切向流超濾(Sartorius)得到進一步濃縮，所用的膜是100KDa分子量阻斷膜。RS病毒保留物貯于-70℃。
實施例4本實施例描述了通過超速離心濃縮RS病毒。
把RS病毒保留物于4℃，用45,000rpm離心2小時，所用轉(zhuǎn)頭是50.2 Ti Beckman的固定角度轉(zhuǎn)頭。棄去上清，將沉淀的病毒重懸于pH 7.3的磷酸鹽緩沖液中。
實施例5本實施例描述了通過蔗糖密度梯度離心而純化病毒。
把重懸沉淀的病毒在10-60％(w/v)線性蔗糖梯度上通過速度區(qū)帶離心(24,000rpm.2小時，Beckman SW 28轉(zhuǎn)頭)，進行進一步純化。從35-40％區(qū)帶收集彌散的病毒帶，用PBS稀釋到10％蔗糖濃度。純化的病毒用Beckman 50.2 Ti轉(zhuǎn)頭，45,000rpm離心90分鐘而進行進一步濃縮。棄去上清。沉淀病毒重懸于PBS。使其蛋白濃度為大約1mg/mL，并貯于-70℃。純化的RS病毒用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，并用抗-RSV特異抗體進行免疫印跡分析，發(fā)現(xiàn)其純度至少是60％，可以認為是充分地去除了細胞和血清組分。
實施例6本實施例描敘了通過凝膠過濾和層析以純化和濃縮RS病毒。
實施例3中描敘的來自于RSV-3-SiT的病毒保留物通過凝膠過濾和柱層析純化和濃縮如下來自于實施例4的病毒保留物過一個凝膠過濾柱(SephacryeS-500)，該柱已用含有10mM氯化鈉和20％甘油的pH7.3的10mM磷酸鈉緩沖液平衡，以除去主要的污染物，牛血清蛋白(BSA)。病毒在用上述緩沖液平衡的離子交換柱(DE-52，Whatman)上進一步純化。樹脂用平衡液洗后，然后，用五倍柱體積和含有100mM氯化鈉和20％甘油的pH7.3的10mM磷酸鈉緩沖液洗脫。在此步驟中，在經(jīng)過純化的病毒分級部分中仍然出現(xiàn)的非病毒組分，主要是BSA，通過凝膠過濾被洗脫了。再用50mM磷酸鈉和1.5M氯化鈉溶液從柱上洗脫病毒。
實施例7本實施例描述了用正辛基-β-D吡喃葡糖苷(OG)滅活RS病毒。
按實施例5和6的描述而制備的RS病毒，用正辛基-β-D-吡喃葡糖苷(1％wt/vol)室溫下處理兩個小時滅活。將病毒樣品對磷酸緩沖鹽透析，以從蛋白混合物中消除去垢劑。滅活病毒的感染力通過TCID50測試而測定，沒有檢測到感染病毒。
實施例8本實施例描述了正辛基-β-D吡喃葡糖苷滅活的RS病毒制劑的免疫原性。
取六周齡棉鼠用肌肉注射30μg/kg按實施例6中所描述的方法制備的、磷酸鋁吸附的OG滅活的RS病毒，或不相關(guān)抗原(安慰劑)。一組動物被鼻內(nèi)接種100μl的大約100倍棉鼠半數(shù)感染劑量(CRID50)的活RS病毒。在第28天，所有動物都被抽血，除被接種了活病毒的之外的所有動物，都用和初次接種相同劑量的輔助抗原加強免疫。加強免疫一周后(35天)，采集血清樣品。測定了RS病毒特異的中和滴度，并在下面所列表I中描述。(表在說明書的末端)。
從表中可看出，初次血清樣品的數(shù)據(jù)說明了OG滅活的RS病毒制品引發(fā)了強的初次免疫反應(yīng)在4周時，用等價劑量的輔助OG滅活RS病毒加強免疫的動物血清，其35天的中和抗體滴度和接種了活病毒的動物血清的中和抗體滴度是可比的。在此提供的數(shù)據(jù)說明了OG滅活RS病毒是高度致免疫的。
實施例9本實施例描述了OG滅活RS病毒制劑引出免疫棉鼠的保護性應(yīng)答，又不引起增強的肺病理學(xué)的能力。
為了評價正辛基-β-D吡喃葡糖苷滅活RS病毒制劑的保護能力，把棉鼠接種以活的RS病毒或用兩個30μg劑量的滅活RS病毒或不相關(guān)抗原(安慰劑)，然后鼻內(nèi)感染(加強劑量后7天)大約以100倍棉鼠半倍感染劑量(CRID50)的、生長于Hep2細胞的RS病毒的A2株。病毒感染后的第4天，殺死半數(shù)動物。取肺，洗灌肺，生成的液體用來分析肺部病毒滴度和白細胞計數(shù)。病毒侵染后的第7天，處死存活動物，取其肺以分析病毒水平。同時確定肺支氣管洗出細胞的出現(xiàn)。通過蘇木精和曙紅染色石蠟切片進行肺切片的組織病理學(xué)研究。
感染后第4天的肺RS病毒滴度在表2中得到總結(jié)。用那些注射了不相關(guān)蛋白制劑的安慰劑對照動物，其每克肺組織中持有6.610gTCID50單位病毒的復(fù)制。以O(shè)G滅活的RS病毒制劑免疫的動物，其肺部沒有檢測到病毒。這些結(jié)果說明了OG滅活RS病毒的保護能力。在所有測試的動物肺中，其第7天的RS病毒肺部滴度都很低(未展示數(shù)據(jù))。這并非是不期望的結(jié)果，因為通常在感染后7天RS病毒從肺中清除出去。
用OG滅活的RS病毒制劑免疫的動物的肺的洗灌出細胞計數(shù)(表3)，比用不相關(guān)蛋白制劑(placebo)接種的動物的肺的細胞計數(shù)明顯降低。進一步說，在第7天。OG滅活RS病毒接種動物的細胞計數(shù)并不明顯高于安慰劑對照組計數(shù)，可以推斷OG滅活RS病毒制劑，在免疫動物遭受活病毒侵襲之后，并不引起肺部炎癥的加劇。
蘇木精和曙紅染色切片顯示，被給予不相關(guān)蛋白制劑(安慰劑)的動物的肺具有最大的感染和炎癥的指征。而以活病毒或OG滅活RS病毒制劑免疫的棉鼠肺則有微弱的感染和炎癥的跡象。結(jié)果總結(jié)在表8中。
基于這些結(jié)果，可以推斷OG滅活的RS病毒制劑可以引發(fā)保護性免疫應(yīng)答，而并不促使肺部病理加劇。
實施例10本實施例描述用β丙酮酸內(nèi)酯(BPL)滅活RS病毒。
把滅活劑β丙酮酸內(nèi)酯(0.1％w/v，溶于蒸餾水)用通過0.22Am孔徑濾膜過濾而除菌。按實施例5描述制備的純化RS病毒，和滅活劑以1∶1(v/v)比例混合，并在37℃持續(xù)振蕩孵育兩個小時。然后將病毒樣品于4℃對PBS透析過夜以除去殘留BPL，所用的透析膜是12000分子量阻斷膜，處理過的病毒樣品的感染力以空斑測試法評估。沒有檢測到具有感染力的病毒。透析過的樣品貯于-70℃。
實施例11本實施例描述了β丙酮酸內(nèi)酯滅活RS病毒的免疫原性和保護能力，以及不引起肺病理加重。
取六周齡雌性棉鼠用肌肉注射10μg/kg BPL滅活的、吸附了磷酸鋁的RS病毒。安慰劑對照動物則用PBS加磷酸鉛免疫。一組動物鼻內(nèi)灌注100CRID50的RS病毒。在28天將動物取血，除用活病毒免疫的棉鼠外，并都用同一劑量抗原制劑加強免疫。在84天取血清樣品測定RS病毒特異性中和滴度。為評價滅活RS病毒制劑保護動物免受活病毒侵襲的能力，將棉鼠鼻內(nèi)感染以大約100CRID50的收獲于棉鼠肺的RS病毒Tracy(特爾西氏)分離物。感染4天之后，處死動物，取肺，洗滌過的和生成的液體用以測試肺RS病毒滴度。
表4中總結(jié)了在用BPL-滅活病毒免疫動物血清中，RS病毒特異中和滴度。初次采血(28天)的結(jié)果證明BPL滅活RS病毒制劑引發(fā)了良好的初次免疫應(yīng)答。而且，在4周時用同等劑量的滅活RS病毒加強免疫的動物血清所具有的中和抗體的滴度，與接種了活病毒的動物的可以相比。
BPL滅活病毒制劑也能有效地保護棉鼠免受RS病毒侵襲，正如表5所示肺RS病毒滴度。因此，用兩倍劑量的BPL滅活RS病毒制劑免疫的動物可以得到保護免受活病毒侵襲。肺病毒滴度的降低可以與以活病毒免疫的棉鼠體內(nèi)見到的降低(0.6 log 1g/1μng)，可以相比。
按上面實施例9的方法，確定了β丙酮酸內(nèi)酯滅活的RSV制劑的增強的肺病理。
這些研究的結(jié)果表明BPL滅活RS病毒是高度致免疫的和保護性的。
實施例12本實施例描述了用抗壞血酸滅活RS病毒。
抗壞血酸(10mg/mL)和硫酸銅(0.5mg/mL)溶液通過經(jīng)0.22μm孔徑濾膜過濾而除菌。按實施例5純化的病毒和溶液混合，使得抗壞血酸的終濃度為1mg/mL，硫酸銅的終濃度為50μg/mL(4份病毒和0.5份各種溶液)，混合物于30℃，保持振蕩溫孵24小時。
公開內(nèi)容概要在這公開內(nèi)容摘要中，本發(fā)明提供了一種能在其免疫宿主中產(chǎn)生對RS病毒有特異性免疫應(yīng)答的新的致免疫組分，包括純化的滅活的病毒和制備及使用它們的方法。在本發(fā)明的范疇內(nèi)，有些修正是有可能的。
表1在用OG滅活RS病毒免疫棉鼠血清中的RS病毒中和抗體滴度
1.4個樣品的GMT值，標(biāo)準(zhǔn)差在括號()中。表2在用OG滅活RS病毒免疫棉鼠的肺中RS病毒滴度
1.4個樣品的GMT值，標(biāo)準(zhǔn)差在括號()中。表3在用OG滅活RS病毒免疫的，再經(jīng)RS病毒侵襲的棉鼠的支氣管洗灌液體的肺細胞計數(shù)
1.4個樣品的GMT值，標(biāo)準(zhǔn)差在括號()里。表4在用β丙酮酸內(nèi)酯滅活RS病毒免疫棉鼠的血清的RS病毒中和抗體滴度
1.4個樣品的GMT值，標(biāo)準(zhǔn)差在括號()里。表5β丙酮酸內(nèi)酯滅活RS病毒免疫棉鼠肺中的RS病毒滴度
1.GMT值。標(biāo)準(zhǔn)差在括號()內(nèi)。表6抗壞血酸滅活RS病毒免疫棉鼠血清的RS病毒中和抗體滴度
1.4個樣品的GMT，標(biāo)準(zhǔn)差在括號()內(nèi)。表7抗壞血酸滅活RS病毒免疫棉鼠肺的RS病毒滴度
1.6個樣品的GMT值，標(biāo)準(zhǔn)差在括號()里。
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權(quán)利要求
1.一種能夠在其免疫宿主體內(nèi)產(chǎn)生對呼吸合胞體(RS)病毒特異免疫應(yīng)答的致免疫組合物，包括純化的、滅活的病毒和其載體，這種病毒基本上去除了細胞和血清組分，是非感染的、非免疫強化的、致免疫的和保護性的。
2.權(quán)利要求1的組合物，它被明確定義為對人類宿主活體給藥的疫苗，保護人類不受RS病毒引起的疾病。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所說的載體也包括一種佐劑。
4.權(quán)利要求2的組合物，它被配制成以針劑形式，鼻內(nèi)、口服、或粘膜表面給藥。
5.一種制備能夠在其免疫過的宿主體內(nèi)產(chǎn)生對呼吸合胞體(RS)病毒特異免疫應(yīng)答的、非免疫強化的致免疫組合物的方法，包括RS病毒在細胞株里生長以產(chǎn)生生長成熟的病毒；收獲所說的生長病毒以產(chǎn)生收獲的病毒；在非變性條件下純化所說的收獲的病毒；以制造在實質(zhì)上去除了細胞和血清組分的純化病毒；用滅活劑滅活所說的純化病毒，以提供一種非感染的、非免疫強化的、致免疫的RS病毒，以及明確定義所說的非感染的、非免疫強化的RS病毒為所說的致免疫組合物。
6.權(quán)利要求5所說的方法，其中所說的滅活劑是β丙酮酸內(nèi)酯。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所說的滅活劑是一種非離子的去垢劑。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所說的非離子去垢劑選自正辛基-α-D-吡喃葡糖苷和正辛基-β-D吡喃葡糖苷組成的類群中。
9.權(quán)利要求5中的方法，其中所說的滅活劑是抗壞血酸。
10.權(quán)利要求5中的方法，其中所說的細胞系是疫苗級連續(xù)細胞系。
11.權(quán)利要求10中的方法，其中所說的連續(xù)細胞系是VERO細胞系。
12.權(quán)利要求5中的方法，其中所說的完成的純化步驟微濾去除細胞碎片，切向流超濾去除血清組分，通過超速離心沉淀超濾物，以進一步去除血清組分，將沉淀物進行蔗糖密度梯度離心。
13.權(quán)利要求12中的方法，其中所說的切向流超濾通過采用一種約100至300KDa命名分子量阻斷膜而完成。
14.權(quán)利要求5中的方法，其中進行的純化步驟包括微濾去除細胞碎片，切向流超濾去除血清組分，凝膠過濾進一步去除血清組分，離子交換層析再一步去除血清組分。
15.一種免疫宿主抵抗呼吸合胞體病毒引起疾病的方法，包括將有效劑量的權(quán)利要求1中致免疫組合物對宿主給藥。
16.權(quán)利要求15中的方法，其中所說宿主選擇自幼兒、幼齡兒童、孕婦、育齡婦女、年長個體、免疫缺損個體及敏感人群。
17.一種測定樣品中存在的與呼吸合胞體病毒蛋白特異反應(yīng)的抗體的方法，包括以下步驟(a)將樣品和權(quán)利要求1的致免疫組合物接觸，以生成一種復(fù)合物，包括非感染的、非免疫強化的、致免疫的RS病毒和任何所說的樣品中出現(xiàn)的與之特異反應(yīng)的抗體，以及(b)確定該復(fù)合物的產(chǎn)生。
18.一種確定呼吸合胞體(RS)病毒蛋白在樣品中出現(xiàn)的方法，包括下列步驟(a)用權(quán)利要求1的致免疫組合物免疫受試者，以產(chǎn)生對RS病毒蛋白特異抗體(b)將樣品和抗體接觸，以產(chǎn)生由任一樣品中出現(xiàn)的RS病毒蛋白和所說RS病毒蛋白特異性抗體構(gòu)成的復(fù)合物，以及(c)確定復(fù)合物的產(chǎn)生。
19.一個診斷試劑盒，用于測定一個樣品中，與RS病毒蛋白特異性反應(yīng)的抗體的出現(xiàn)，包括(a)權(quán)利要求1的致免疫組合物；(b)將非感染的，非免疫強化的和致免疫的RS病毒和樣品接觸，以產(chǎn)生由非感染的、非免疫強化的、致免疫的RS病毒和任一所說的樣品中出現(xiàn)的抗體構(gòu)成的復(fù)合物的方法，以及(c)確定復(fù)合物產(chǎn)生的方法。
全文摘要
一種能在其免疫宿主體內(nèi)引起呼吸合胞體病毒特異的免疫應(yīng)答的免疫組分，它包括純化的，滅活的，在實質(zhì)上是去除了細胞和血清組分的RS病毒，是非感染的、非免疫強化的、致免疫的和保護性的。病毒生長在疫苗級細胞系，收獲的病毒在非變性條件下純化，在實質(zhì)上是去除細胞和血清組分。這純化的病毒用β-丙酮酸內(nèi)酯、一種非離子去垢劑、特別是正辛基-α-D吡喃葡糖苷，或正辛基-β-D-吡喃葡糖苷，或抗壞血酸滅活。這種致免疫組分可被明確定義為一種對人類宿主體內(nèi)給藥的疫苗，這種致免疫組分也可在診斷上應(yīng)用。
文檔編號G01N33/569GK1133013SQ94193703
公開日1996年10月9日 申請日期1994年8月4日 優(yōu)先權(quán)日1993年8月6日
發(fā)明者S·E·桑休茲, M·E·伊瓦西辛, M·H·克萊恩 申請人:康諾特實驗室有限公司