專利名稱：校正化學(xué)分析的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及校正化學(xué)分析的方法，更具體地說，本發(fā)明涉及但并不局限于一種用來校正象分析5′-三磷酸腺苷(ATP)這樣的分析微生物學(xué)中重要分析物分析法的方法。
為分析目的精確檢測并定量特定物質(zhì)或微生物是基本的實驗工具。為生產(chǎn)或工藝控制目的檢測和定量污染物質(zhì)或污染微生物對于食品和飲料工業(yè)非常重要。在包括廢物處理的控制、消毒過程的監(jiān)測以及空氣質(zhì)量的監(jiān)測在內(nèi)的許多其它應(yīng)用中，微生物生物量的估算也很重要。在許多情況下，能在盡可能短的時間內(nèi)估算出微生物或化學(xué)污染物的程度是很有利的。
許多分析技術(shù)適用于檢測和定量目的分析物，這些例子包括酶法分析、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、分光光度分析法、發(fā)光分析、熒光分析、色譜分析、基于測定試樣旋光度變化的分析、離子選擇性分析(包括滴定分析)和比色分析。所用的特定分析方法主要取決于待檢測和定量的分析物。
重要的是所選擇的特定分析方法應(yīng)盡可能精確和有重現(xiàn)性。為了使這些分析的準(zhǔn)確度達到最高，分析的標(biāo)定和校正十分重要。許多因素可以影響分析反應(yīng)并造成誤差來源，因此必須將這些因素降至最低或予以考慮。
已知使用放射性同位素的標(biāo)定技術(shù)，其目的是標(biāo)定儀器而不是分析本身。這樣的放射性標(biāo)定的一個例子出現(xiàn)在Biolink Light Standard(Leaback，DH，Easy-to-use light standards as aids to luminometry，Szalay，A.A.et al(Eds)pp 33-37-Bioluminescence and Chemiluminescence，Status Report.Proceedings of VII International Symposium ofBioluminescence and Chemiluminescence John Wiley & Sons，Chichester 1993)。這樣的標(biāo)準(zhǔn)是基于氣態(tài)的-氚-活化的磷光體，其在確定的光譜范圍內(nèi)發(fā)光并且在長期貯藏期間表現(xiàn)出可預(yù)測的衰變。這樣的設(shè)備只能有助于校正發(fā)光計本身。
校正或標(biāo)定分析本身也同樣重要，這樣可以將樣品和試劑組合物的差異考慮在內(nèi)。
例如，5′-三磷酸腺苷(ATP)是微生物分析中一種重要的被分析物。發(fā)現(xiàn)活細胞中有ATP而死細胞中沒有，并且其在樣品中的存在可以表明微生物的污染。
一種測定ATP的廣泛使用的技術(shù)是ATP生物發(fā)光技術(shù)。
當(dāng)存在得自美國螢火蟲Photinus pyralis的純化酶(熒光素酶)、底物、D-熒光素和足夠的鎂離子和溶解的氧時，發(fā)生下列反應(yīng)Mg-ATP＋O2＋D-熒光素↓螢火蟲熒光素酶氧化熒光素＋AMP＋PPi＋CO2＋光(ATP＝5′-三磷酸腺苷；Mg-鎂離子；O2＝氧；AMP＝5′-單磷酸腺苷；PPi-無機磷酸鹽；CO2＝二氧化碳)。
在適宜條件下，反應(yīng)生成的光的量直接與ATP濃度呈正比，并且可以用靈敏的光檢測儀檢測。這是ATP-生物發(fā)光分析的基礎(chǔ)。
可以用兩種方法校正使用螢火蟲熒光素酶反應(yīng)的ATP分析(Jago，P.H.，Stanfield，G.Simpson，W.J.& Hammond，J.R.M.1989.In ATPLuminescenceRapid Methods in Microbiology，Society of AppliedBacteriology Technical Series，Vol.26，Stanley P.E.et al.(eds)pp 53-61)。
按照外標(biāo)技術(shù)，可用標(biāo)準(zhǔn)曲線將螢火蟲熒光素酶試劑與樣品反應(yīng)發(fā)出的光同螢火蟲熒光素酶試劑與已知量的ATP反應(yīng)得到的光相比較。
雖然該技術(shù)很簡便并且需要的試劑處理最小，但其仍會有誤差。這是因為螢火蟲熒光素酶反應(yīng)發(fā)出的光直接與反應(yīng)速率相關(guān)。雖然ATP濃度是控制反應(yīng)速率的主要決定因素，但并不是唯一決定因素。樣品中存在的抑制劑(如金屬離子、氫離子)可以降低反應(yīng)速率，而促進劑如洗滌劑可以提高反應(yīng)速率(Simpon，W.J.andHammond，J.R.M.1991.Journ.Chemilumin.& Biolumin.，6，97-106)。另外，由于生產(chǎn)或操作的不一致性，螢火蟲熒光素酶試劑本身固有的活性可能有變化。即使反應(yīng)速率可能不受影響，但反應(yīng)混合物中可能存在一些物質(zhì)，其大大吸收了所產(chǎn)生的光，從而引入誤差。有些物質(zhì)，特別是Zn2+，除了降低螢火蟲熒光素酶的催化活性以外，還改變了反應(yīng)中產(chǎn)生的光的波長。在某些類型的發(fā)光計中，這可能會引起反應(yīng)發(fā)出的待測光的量的降低(Denburg，J.L.& McElroy，W.D.1978.Arch.Biochem.Biophys.141，668-675)。
如果放棄標(biāo)準(zhǔn)曲線法而利用內(nèi)標(biāo)技術(shù)則可以消除所有這些誤差來源。在其最簡單的方式中，其包括向引發(fā)了的螢火蟲熒光素酶反應(yīng)中加入已知量的包含于小體積液體中的ATP。將僅從樣品和熒光素酶中發(fā)出的光與從樣品和熒光素酶以及ATP中發(fā)出的光相比較，然后計算樣品中的ATP濃度。該方法消除了與可變樣品組成相關(guān)的操作者分析誤差。
但是，這項技術(shù)的基礎(chǔ)是穩(wěn)定的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的使用。針對該ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性存在著很多爭論。有些技術(shù)人員聲稱這樣的ATP稀釋液不穩(wěn)定，必須避光放置和/或保存在冰上。對溶液的處理不當(dāng)也會引起一些問題。對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性的最大威肋是溶液中污染的微生物的存在。ATP迅速被許多微生物利用(Karl，D.M.1980.Microbiol.Rev.44，739-796)，因此將它們從ATP標(biāo)準(zhǔn)液中排除是很重要的。必須遵循無菌技術(shù)。盡管從某些專業(yè)發(fā)光劑制造廠可以買到預(yù)先稱重的瓶裝ATP，但由于這些可察覺的限制，它們的應(yīng)用并不廣泛。在安全性要求嚴格的領(lǐng)域如食品衛(wèi)生學(xué)和空氣質(zhì)量的監(jiān)測中使用ATP-生物發(fā)光分析時這些問題變得尤為重要。
雖然ATP-生物發(fā)光技術(shù)闡述了這一問題，但分析標(biāo)定問題同樣適用于其它分析方法。
本發(fā)明的一個目的在于通過使用光內(nèi)標(biāo)技術(shù)改善標(biāo)定化學(xué)分析的這些問題。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種內(nèi)部標(biāo)定化學(xué)分析的方法，包括下列步驟(i)向待測樣品中加入預(yù)定量的分析物光敏衍生物；(ii)測定分析的檢測參數(shù)；(iii)將樣品/光敏衍生物的混合物暴露于預(yù)定時間和強度的可見光閃光下，從光敏衍生物釋放出已知量的分析物；(iv)重新測定檢測參數(shù)；(V)按照需要重復(fù)步驟iii)和iv)0-n次；(vi)計算檢測參數(shù)測定中的變化；并且(vii)用得自步驟(vi)的計算值作標(biāo)準(zhǔn)，測定最初存在于樣品中的分析物的量。
本發(fā)明的另一個目的是通過制成光校正系列來改善標(biāo)定化學(xué)分析的問題。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種外部標(biāo)定化學(xué)分析的方法，包括下列步驟(i)將預(yù)定量的分析物光敏衍生物暴露于預(yù)定時間和強度的可見光閃光下，從光敏衍生物釋放出已知量的分析物；(ii)測定分析的檢測參數(shù)；(iii)按照需要重復(fù)步驟(i)和(ii)0-n次；(iv)計算檢測參數(shù)測定中的變化；并且(v)用得自步驟(iv)的計算值作標(biāo)準(zhǔn)，被分析樣品的結(jié)果可與之相比較。
盡管在某些情況下可能需要使用干燥狀態(tài)的光敏衍生物，但優(yōu)選在光解步驟之前光敏衍生物是在溶液中。
在需用多點校正法的情況下，可以改變步驟(iii)中可見光的閃光時間和/或強度，從而補償供光解的光敏衍生物的減少量。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種標(biāo)定ATP-生物發(fā)光分析的方法。
根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了一種標(biāo)定ATP-生物發(fā)光分析的方法，包括下列步驟(i)將預(yù)定量的ATP光敏衍生物加入螢火蟲熒光素酶-熒光素試劑中，(ii)測定試劑發(fā)出的光；(iii)將待測樣品與試劑混合；(iv)再測定發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光；(v)將樣品/試劑混合物暴露于預(yù)定時間和強度的可見光閃光下，從光敏衍生物釋放出已知量的ATP；(vi)再測定發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光；(vii)按需要重復(fù)步驟v)和vi)0-n次；(viii)計算發(fā)光測定中的變化；并且(ix)用得自步驟(Viii)的計算值作標(biāo)準(zhǔn)，測定最初存在于樣品中的ATP的量。
本發(fā)明的方法是一種非放射活性的光標(biāo)定技術(shù)，其比原先可得到的標(biāo)定方法優(yōu)越之處在于(i)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度；(ii)結(jié)果的校驗；和(iii)對使用者友好。
精密度的提高是由于消除了與分析物標(biāo)準(zhǔn)的加入相關(guān)的吸取誤差以及對與分析稀釋相關(guān)的光學(xué)或催化淬火中的任何變化的補償。能夠使用簡單、可行的標(biāo)定方案可能以簡便的結(jié)果校驗形式產(chǎn)生優(yōu)勢，這種形式是食品和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則以及某些安全性要求高的應(yīng)用中特別顯著的著眼點。所改進的對使用者友好是由于不需要分別的分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液來進行這樣的分析，并且分析試劑可由工廠標(biāo)定。另外，分析的標(biāo)定可能完全與用來檢測或定量待測分析物的方法無關(guān)。
已經(jīng)開發(fā)了一些有生物學(xué)意義的合成化合物來用于生物學(xué)研究，其含有光敏化學(xué)鍵。當(dāng)這些化合物中的一種暴露于短暫的強光閃光時，便釋放出反應(yīng)產(chǎn)物。光敏化合物被稱作“籠蔽的”化合物，從中可釋放出有用的分子或離子。因此，ATP從籠蔽ATP中釋放出來，Ca2+從籠蔽的Ca2+中釋放出來，等等。這樣的光敏分析物衍生物適用于本發(fā)明，并且它們的使用與高強度閃光燈或Q-轉(zhuǎn)換雙頻率激光一起為標(biāo)定化學(xué)分析提供了方便且無損害的方法?？墒匈彽拈W光燈能完成分析物分子從籠蔽前體的有效釋放，這一發(fā)現(xiàn)是迄今不曾知道的。
按照本發(fā)明的第一個優(yōu)選方法，可將預(yù)定量的“籠敝”化合物加入待測樣品中，或加入用來稀釋待測樣品的緩沖液中。然后測定特定的分析檢測參數(shù)。測定的檢測參數(shù)取決于所討論的分析，但其可能是發(fā)光、放熱、顏色變化或其它參數(shù)。
然后通過將混合物暴露于預(yù)定強度和持續(xù)時間的閃光中，從籠蔽化合物中釋放出預(yù)定量的游離化合物。然后可以重新測定檢測參數(shù)并計算檢測參數(shù)測定中的變化。然后可以用計算值作標(biāo)準(zhǔn)來測定最初存在于樣品中的分析物的量。
另一方面，在本發(fā)明另一個優(yōu)選方法中，可以在單一濃度的籠蔽化合物溶液中通過改變光解程度來產(chǎn)生一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的待測化合物。用這一方法可以制備校正系列，例如在微量滴定板上，而不需要吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)分析物溶液。在這種測定分析形式中，可以按照常規(guī)的分析步驟，但在所選擇的分析中，可以通過在進行分析步驟之前光解“籠蔽的”分析物來完成標(biāo)定。
因此，這種普通的光標(biāo)定系統(tǒng)可與大量的分析系統(tǒng)聯(lián)用，包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、酶法分析、分光光度分析法、熒光分析法、基于測定待測樣品旋光度變化的分析、離子選擇性分析(包括滴定分析法)和比色分析法。
在需要實驗步驟精密度和準(zhǔn)確度盡可能大的情況下，可能需要進行多點校正而不是單點校正。這可以通過分別光解單濃度“籠蔽”化合物的不同溶液產(chǎn)生校正系列來達到(理想的是在微量滴定板或其等同物中)。通過改變光解程度，例如用預(yù)定強度和持續(xù)時間的閃光照射一、二、三或四次而獲得一系列校正標(biāo)準(zhǔn)物。
但是，在測定與校正必須以無損方式在同一試管中進行的情況下，以及分析物必須存在于分析方案的特定步驟如方案的開始步驟中的情況下，這種方法并不適宜。但是，也許能夠在某些單個試管分析如ATP-生物發(fā)光分析中進行多點校正。這是由于事實上當(dāng)被分析物釋放到檢測溶液中時該分析方法仍然適用。在某些情況下，單個試管分析的多點校正可能在準(zhǔn)確度和精密度方面優(yōu)于這些實驗的單點校正。
設(shè)計這些步驟時重要的是確定可用于光解的籠蔽化合物總量與光源強度之間的最佳關(guān)系。在用單點校正法標(biāo)定分析的情況下，需要在反應(yīng)中使用盡可能少的“籠蔽”物質(zhì)，并且通過用足夠強度的光使＞50％的分析物從“籠蔽”物質(zhì)中釋放出來而使“籠蔽”物質(zhì)向分析物的轉(zhuǎn)化率最大。但是，在要用多點校正法標(biāo)定分析的情況下，必須使用在暴露于第一階段的光解時僅能使1-2％的分析物釋放出來的光強，從而限制“籠蔽”分析物向游離分析物的轉(zhuǎn)化。因此，為了確保足夠量的分析物釋放出來，分析中存在的“籠蔽”物質(zhì)總濃度必須高于為用于單點校正而設(shè)計的試劑濃度。
當(dāng)用固定強度和時間的閃光時，釋放的分析物量隨每次連續(xù)閃光而降低。通過改變閃光強度和/或時間，可以補償用于光解的“籠蔽”物質(zhì)減少的量，從而使每一階段產(chǎn)生等量的分析物并形成線性校正系列。
實際上，可以通過參照另外制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定在一系標(biāo)準(zhǔn)光解條件下釋放出的分析物的量，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是用分析物的非衍生形式來制備的?？梢哉{(diào)節(jié)反應(yīng)中光敏分析物濃度使一定量的分析物釋放出來，或者可以調(diào)節(jié)閃光的強度和/或時間來達到同樣目的。
當(dāng)某些物質(zhì)暴露于高強度閃光時會發(fā)出磷光，如閃光槍引起的磷光。這種磷光的強度隨物質(zhì)不同而不同。在通過測定發(fā)射光來估算分析物濃度的實驗中(例如，基于生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光和熒光的實驗)，磷光是一種干擾源。減少或修正該干擾的方法如下(注意，每一次都可以使用一種以上的方法)。
第一種方法是在光解期與測定期之間引入一段時間延遲。磷光強度對數(shù)值的降低與延遲時間的對數(shù)值的增加成正比。因此，數(shù)秒鐘的間隔足以使檢測到的發(fā)射光降至任何類型分析均可接受的值。
第二種方法是濾過用來照射樣品的光(或使用單色光如從激光源發(fā)出的光)或者濾過由比色池中物質(zhì)發(fā)出的光。根據(jù)所用物質(zhì)，兩種方法的效果可能相同或不同。
第三種方法是選擇在光標(biāo)定法特定的光照條件下暴露時發(fā)出磷光的潛能很低的物質(zhì)。
當(dāng)暴露于閃光燈形式的標(biāo)準(zhǔn)多色光源時，普通實驗室用物質(zhì)在發(fā)磷光的性質(zhì)上差異很大。
進一步的方法是修正光解后所得結(jié)果，修正由磷光引起的發(fā)射光。可以用電子計算裝置完成這一方法，條件是(i)得知物質(zhì)固有的磷光，(ii)對物質(zhì)進行選擇，使之符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，以及(iii)暴露于光之后進行測定的時間要標(biāo)定。
大多數(shù)“籠蔽”產(chǎn)品，不論是商購的還是用一般技術(shù)實驗室生產(chǎn)的，或多或少滲雜著“非籠蔽”產(chǎn)品。如果要達到光標(biāo)定技術(shù)的最佳性能，必須將存在的“非籠蔽”產(chǎn)品降至技術(shù)上不顯著的水平。在籠蔽的ATP的情況下，可以通過將籠蔽的ATP與溶解形式或固定化形式的ATP-降解酶如三磷酸腺苷酶反應(yīng)來消除摻雜的ATP分子(轉(zhuǎn)化為ADP和AMP，它們不與螢火蟲熒光素酶反應(yīng))。另外，可以將含有“籠蔽”ATP的熒光素-熒光素酶試劑于4℃保溫8-20小時或更長時間。在這段時間中螢火蟲熒光素酶催化水解ATP，但不影響籠蔽ATP水平。也可以用制備化學(xué)中目前已知的任何技術(shù)(包括色譜法、選擇性沉淀、或萃取)來除去ATP。在用于光標(biāo)定分析目的之前，可以用類似性質(zhì)的技術(shù)處理“籠蔽”形式的其它分析物。在許多情況下，這些方法通常是已知的。
在某些情況下可能需要進一步純化“籠蔽”物質(zhì)。例如，在ATP1-(2-硝基苯基)乙酯的情況下，可商購的物質(zhì)含有一對非對映異構(gòu)體，因為用作對光不安定的“籠”的硝基苯基基團可以按兩種構(gòu)型加在ATP上。雖然這些對映異構(gòu)體具有同樣的光化學(xué)性質(zhì)，但在某些應(yīng)用中，僅使用一種對映異構(gòu)體更好。例如，每種對映異構(gòu)體的相互作用，或更具體地說，其與分析試劑如α-、β-、γ-環(huán)糊精組分形成包合配合物的性能隨每種對映異構(gòu)體情況而不同。許多可市購的螢火蟲熒光素酶試劑含有環(huán)糊精(參見，例如，Lundin，A，Anson，J & Kau，P ATPextractants neutralised by cyclodextrins Campbell，A K et al(Eds)pp399-402 in Bioluminescence and Chemiluminescence，F(xiàn)undamentalsand Applied Aspects Proceedings of the 8th International Symposiumon Bioluminescence and Chemiluminescence，John Wiley & Sons，Chichester，1994)?？梢杂靡阎夹g(shù)將籠蔽物質(zhì)的對映異構(gòu)體相互分開。
我們觀察到，在某些情況下，可以把固定量的“籠蔽”化合物冷凍干燥在用于進行分析的設(shè)備的元件上。這樣的元件的例子包括一次性使用的移液管頭、一次性樣品比色池以及一次性紙盤或紙條。在使用中，當(dāng)已冷凍干燥在元件上的“籠蔽”化合物與加入的液體如待測樣品或分析試劑接觸時將溶解。無論當(dāng)“籠蔽”化合物是干燥狀態(tài)還是在溶液中，在任何光解時間均可從“籠蔽”分子中釋放出預(yù)定量的分析物。這類標(biāo)定方法特別適用于“籠蔽”化合物在水溶液中缺乏足夠的穩(wěn)定性的情況。許多“籠蔽”化合物在干燥狀態(tài)下對水解和氧化的穩(wěn)定性明顯升高。
在酶法分析中，例如分析物通過酶的作用轉(zhuǎn)化成不同的化合物的分析中，分析物的轉(zhuǎn)化可能伴隨著黃素核苷酸如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原，或者伴隨著化合物如ATP的產(chǎn)生?？蓪ⅰ盎\蔽”形式的“第二”分析物(如NADH或ATP)引入反應(yīng)混合物并在需要時通過光解被釋放。從而，不需要制備單獨的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液便進行了這些分析的標(biāo)定，節(jié)省了時間和操作者的人力。
能用一種或幾種前面所述的方法標(biāo)定的分析物的例子包括ATP、單磷酸腺苷(AMP)、環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸鳥苷(GTP)、發(fā)光反應(yīng)的底物(如D-熒光素)、發(fā)光反應(yīng)抑制劑(如L-熒光素)、有機酸(如草酸)、脂肪酸(如花生四烯酸)、氨基酸(如苯丙氨酸)、糖(如葡萄糖)、糖磷酸鹽(如葡萄糖-6-磷酸)、農(nóng)藥(如莠去津)、天然產(chǎn)生的毒素(如赭曲毒素A)、抗生素(如芐基青霉素)、以及藥學(xué)上感興趣的化合物(如多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺、睪酮和干擾素)。這個清單并不打算是完全的，但是是為了說明的目的。
已經(jīng)合成了多種能釋放ATP的光敏ATP衍生物。這些ATP衍生物的一個例子是ATP硝基苯酚酯，其含有一個可被光水解的酯鍵(

圖1)。這組化合物的其它成員也可以對硝基苯酚進行取代。另一個適宜的ATP衍生物的例子是1-(4，5-二甲氧基-2-硝基苯基)重氮乙烷(DMNPE)。
籠蔽的ATP已用于與各種領(lǐng)域相關(guān)的許多研究用途，包括肌肉生物化學(xué)的研究(Goldman，Y.E.，Hibbard，M.G.McGray，J.A.&Trentham，D.R.1982，Nature，300，701-705)。以前還沒有人建議或?qū)⑵溆糜谛Ｕ锘瘜W(xué)或微生物學(xué)分析的目的。
已經(jīng)證明在pH6-9范圍內(nèi)ATP從籠蔽的ATP中的產(chǎn)生與pH無關(guān)；另外已證明籠蔽的ATP便于操作，因為其溶于中性pH的水中，并且在柔和的日光中暴露數(shù)分鐘不被明顯光解(McCray，J.A.Herbette，L.Kihara，T.& Trentham，D.R.1980，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77，7237-7241)。
為了按照本發(fā)明的方法校正ATP生物發(fā)光反應(yīng)，以預(yù)定濃度將籠蔽的ATP化合物摻入螢火蟲熒光素酶試劑中。螢火蟲熒光素酶對籠蔽的ATP不表現(xiàn)出任何催化活性(參見實施例1)，因此當(dāng)不添加ATP時，從這樣的熒光素酶制劑中沒有光產(chǎn)生?？梢园聪铝蟹椒ㄓ迷噭┻M行高度靈敏的ATP分析。
將樣品和試劑混合于一次性發(fā)光計比色池中。樣品可含有任何來源的水溶性液體，或者是為了使ATP從活生物體中釋放出來而用各種試劑中任何試劑進行處理所產(chǎn)生的特別制備的“提取液”。用發(fā)光計測定從發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光。然后通過將比色池與其內(nèi)容物一起暴露于從例如閃光燈發(fā)出的高強度可見光的閃光下，使已知量的ATP釋放到反應(yīng)混合物中。然后將比色池放回發(fā)光計中，再一次測定從熒光素酶反應(yīng)中發(fā)出的光。由于閃光引起已知量的ATP從存在的籠蔽ATP中釋放出來，因此可以用差值計算對該已知量的ATP的存在有貢獻的光的量。然后可以計算最初存在于反應(yīng)混合物中的ATP的量。
下列非限制性實施例是為了更清楚地描述本發(fā)明的本質(zhì)實施例1用籠蔽的ATP標(biāo)定ATP分析將籠蔽的ATP(Calbiochem，USA，prod.no.119127，5mg)溶于0.5ml無菌去離子水中。將所得貯備液于-20℃冷凍保存直至需要。使用之前將其用無菌去離子水稀釋1000倍。向3ml可市購的熒光素酶-熒光素試劑(Biotrace XT試劑，Biotrace Lth.，Bridgend，UK)中加入200μl無菌去離子水形成對照試劑，或加入200μl籠蔽的ATP貯備液形成籠蔽的ATP試劑。然后將試劑于20℃保溫1-6小時。
在制備試劑后的不同時間，將無菌去離子水(300μl)轉(zhuǎn)移到干凈的一次性發(fā)光計比色池中，然后加入100μl對照試劑或籠蔽的ATP試劑。用Biotrace M3發(fā)光計(Biotrace Ltd，Bridgend，UK)定量從反應(yīng)中發(fā)出的光，該儀器2秒鐘延遲后對光反應(yīng)積分10秒鐘。然后向反應(yīng)混合物中加入一定體積的ATP溶液(10μl，0.1μM)，然后再一次測定光輸出。然后將比色池與其內(nèi)容物一起暴露于來自Hanimex325A2閃光槍(Hanimex，UK)的強烈閃光中，并且第三次測定從反應(yīng)中發(fā)出的光。
表1中的結(jié)果示出了所得的光輸出值。這些結(jié)果說明了以下幾點(1)籠蔽的-ATP不與ATP競爭螢火蟲熒光素酶上的活性位點，通過將1pmol ATP加入到兩種試劑中所觀察到的類似反應(yīng)表明了這一點(平均值，n＝5)從不存在籠蔽的ATP的1pmol ATP中發(fā)出1302RLU，從存在95.2pmol籠蔽的ATP的1pmol ATP中發(fā)出1304 RLU；(ii)高強度的閃光不影響螢火蟲熒光素酶反應(yīng)的速率，如下列事實所示閃光后試劑對1pmol ATP的響應(yīng)沒有改變(閃光前1308 RLU，閃光后1276 RLU，差值可能僅是由與這些反應(yīng)相關(guān)的發(fā)光的自然衰變帶來的)；(iii)將籠蔽的ATP試劑暴露于高強度閃光下造成分析中ATP濃度的升高，等同于1.171pmol ATP/分析?？梢曰谶@種響應(yīng)來校正分析。按這種方法進行的分析校正(對加到反應(yīng)中的1pmol游離ATP來說)給出的值為1.00±0.08pmol ATP/分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝5)，有對于時間隨機分布的誤差。在對照分析的情況下，用標(biāo)準(zhǔn)曲線技術(shù)進行標(biāo)定(用試劑制備后1小時的數(shù)據(jù))，所得數(shù)值為0.93±0.06pmol ATP/分析(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n＝5)，相對于從試劑制備后的時間，各個數(shù)值顯示出了明顯的降低(因為熒光素酶催化活性降低)。
一旦加入到熒光素酶試劑中，通過自發(fā)水解(這是酶作用的結(jié)果)和/或光解籠蔽的ATP可以釋放出ATP。示于實施例1中的結(jié)果表明，從前兩種機制釋放的ATP是可以忽略的，而暴露于閃光槍產(chǎn)生的高強度閃光中后，ATP從存在的籠蔽ATP中迅速產(chǎn)生。表1的注釋1.高強度的閃光(由Hanimex 325A2閃光槍提供，Hanimex，UK)沒有從空比色池中誘導(dǎo)發(fā)光，也沒有從含測試溶液如水或籠蔽的ATP的比色池中、或在不存在籠蔽的-ATP時含有熒光素酶-熒光素試劑的比色池中誘導(dǎo)發(fā)光。2.“ATP光標(biāo)準(zhǔn)”(籠蔽的ATP)在暴露于高強度閃光時產(chǎn)生1.171pmolATP/分析。
這表示分析中存在的籠蔽的ATP的轉(zhuǎn)化率為1.23％。3.當(dāng)用基于洗滌劑的ATP提取物(Swab釋釋液XT，BiotraceLtd.Bridgend，UK)代替水作為樣品基質(zhì)進行分析時獲得了類似結(jié)果，這表明光標(biāo)定技術(shù)適合于這些試劑的使用。實施例2在第2個實驗中，進行類似的系列分析。在這些實驗中，使用前將對照和籠蔽的ATP熒光素-熒光素酶試劑保溫6小時。在添加ATP之前和/或閃光之前將試劑加入其中的樣品混合物是無菌去離子水，或者水和0.1M 3，3′-二甲基戊二酸鈉緩沖液(pH4.00)的混合物。這些實驗條件的設(shè)計是為了在最后的分析中達到一個pH值范圍。表2中的結(jié)果表明，當(dāng)存在數(shù)量增加的緩沖液時，從含1pmol ATP的反應(yīng)中得到的光輸出量減少了。因此，如果用標(biāo)準(zhǔn)曲線法并將結(jié)果參比用水作樣品基質(zhì)獲得的結(jié)果，則誤差顯然是很大的。極端情況時，所得值為0.05pmol ATP/分析，即真實值的二十分之一?；诠鈽?biāo)定技術(shù)的結(jié)果也有誤差，但數(shù)量極小得多。
下列數(shù)據(jù)提供了利用光標(biāo)定技術(shù)的進一步證據(jù)。將籠蔽的ATP加入Biotrace MLX試劑(Biotrace，UK)中至濃度為每100μl試劑含有43.1pmol籠蔽的ATP(即431nmol/l)，從而制得含籠蔽的ATP的熒光素酶/熒光素試劑。將該試劑在4℃保溫過夜以降低背景光的發(fā)射。按下列方法進行分析。向一系列試管中加入ATP(每試管中加1pmol，于10μl無菌去離子水中)，然后加入于HEPES/EDTA緩沖液(該緩沖液最初的pH值為7.75)中的三氯醋酸(TCA)溶液290μl。加入的溶液中的最終TCA濃度為2.5g/l、1.25g/l和0.25g/l。
每個樣品在加入100μl修飾的熒光素酶/熒光素試劑的情況下開始發(fā)光。將所得到的光輸出記錄在Biotrace Multilite發(fā)光計中。然后從發(fā)光計中移出比色池并將其暴露于高強度閃光下，使用安裝在我們自己設(shè)計的設(shè)備(序號005)中的閃光燈。然后將比色池放回發(fā)光計中，第二次記錄反應(yīng)產(chǎn)生的光。
計算每個試管中的ATP濃度，假設(shè)每個光解步驟導(dǎo)致1.15pmolATP形成。所有實驗都進行兩份。
獲得下結(jié)果TCA濃度 樣品RLU 閃光后RLU 樣品中的ATP(pmol)0.25克/升1533933406 0.9761517232572 1.0031.25克/升1085723117 1.0181056422990 0.9782.5克/升 5681 12535 0.9535488 12291 0.928注結(jié)果未對空白試劑的光輸出作校正，其不太明顯。
結(jié)果表明，當(dāng)TCA以高濃度存在時強烈抑制了發(fā)光。僅基于光的發(fā)射來估算ATP濃度會出現(xiàn)嚴重的誤差。但是，基于光標(biāo)定法的結(jié)果重現(xiàn)性好而且精密度高。實施例3.用籠蔽的ATP和變化量的光制備已知濃度的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液將籠蔽的ATP(Calbiochem，USA)溶于無菌去離子水中至最終濃度為14.4μmol/l。將溶液各份(300μl)轉(zhuǎn)移到干凈的一次性比色池中，然后用Hanimex閃光槍進行1至10次閃光。光解后，通過加入100μl熒光素酶/熒光素試劑(Biotrace MLX試劑，Biotrace plc，UK)來分析溶液。用Biotrace Multilite發(fā)光計定量發(fā)出的光，該光度計2秒鐘延遲后對光信號積分10秒鐘。
結(jié)果示于圖2。
圖2中的結(jié)果表明，可按這種方法制備“校正曲線”。該曲線與通過把不同濃度的等體積ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取到分別的比色池中所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線類似。所述光標(biāo)定技術(shù)顯著節(jié)省了操作者人力而達到了同樣的結(jié)果。該技術(shù)本質(zhì)上是無損的。實施例4 驗證比色池磷光把不同類型的比色池(包括由Lumac bv(Landgraaf，theNetherlands)和Biotrace plc(Bridgen，UK)提供的那些)暴露在高強度多色光的閃光下，閃光來自安裝在我們自己設(shè)計的樣品室中的閃光燈。暴露后，將每個比色池迅速轉(zhuǎn)移到Biotrace Multilite發(fā)光計的樣品室中，并在100秒鐘內(nèi)測定發(fā)出的光(其與比色池材料的磷光有關(guān))。每個實驗重復(fù)3次。表3示出了比色池磷光隨時間的衰變。
圖3的結(jié)果表明，來自Lumac比色池的磷光強度比來自Biotrace比色池的磷光強度高得多。另外，對于同樣類型的比色池來說，磷光的時間過程是一致的。使用抗靜電板的實驗表明，從比色池發(fā)出的光不是靜電放出的結(jié)果。
通過對光源使用各種濾器可以使磷光程度達到最小。將從Lumac bv獲得的比色池暴露于高強度閃光下，閃光在某些情況下首先被濾過，然后將比色池放置于Biotrace Multilite發(fā)光計中。按一定時間間隔定量發(fā)出的光。圖4顯示了對于暴露于過濾后的光中的比色池，比色池磷光隨時間的衰減。對過濾后的光的響應(yīng)表明，在光譜的紫外線區(qū)域中的光引起了比色池磷光。對一些物質(zhì)測定了由非過濾光引起的磷光。從這些物質(zhì)最初發(fā)出的光的范圍是30 RLU至5239 RLU(用Biotrace Multilite發(fā)光計10秒鐘積分來測定)。這些結(jié)果表明了下面幾點。1.比色池磷光可引起從暴露于用來光標(biāo)定分析的發(fā)光條件下的樣品中產(chǎn)生明顯發(fā)光。2.不同類型的比色池暴露于高強度光之后其發(fā)出磷光的能力有所不同。3.光的濾過可以使磷光最少(但必須注意激發(fā)分析物從“籠蔽”物質(zhì)中釋放出來所需要的光的波長)。4.當(dāng)繪制成對數(shù)曲線時，來自這樣的比色池的磷光衰減速率是線性的。實施例5 用ATP降解酶從籠蔽的ATP中消除游離ATP將籠蔽的ATP溶液(14.3mmol/l；10μl)加入含5μl/ml腺苷三磷酸酶溶液的lml Lumit緩沖液(HEPES/EDTA/Mg緩沖液，pH7.75；Lumac bv)中。馬鈴薯腺苷三磷酸酶是從Lumac bv獲得的工業(yè)制品(Somase)，通過向一瓶腺苷三磷酸酶中加入1ml Lumit緩沖液而重新配制。在不同時間，將20μl該溶液轉(zhuǎn)移到干凈的一次性發(fā)光計比色池中，比色池中含有300ul無菌去離子水。用Biotrace Multilite發(fā)光計(Biotrace，UK)測定樣品所發(fā)出的光。然后從發(fā)光計中取出比色池并放置于我們自己設(shè)計的閃光裝置中。從閃光管接受一次閃光后，將比色池放回發(fā)光計中，再次測定光的發(fā)射。對照實驗檢測了從將Lumit緩沖液而不是腺苷三磷酸酶溶液加入到籠蔽的-ATP樣品的反應(yīng)中的光輸出。獲得下列結(jié)果。
無腺苷三磷酸酶 有腺苷三磷酸酶閃光前 閃光后 閃光前 閃光后5分鐘 389211 ＞1000000 34844 83748015分鐘400630 944471 149779026630分鐘441410 ＞1000000 830 85937460分鐘413305 995498 754 782365注發(fā)光計不能測定超出1000000RLU的光輸出?？梢园捶蔷€性方法進行接近這一限制值的計算。
這些結(jié)果表明，腺苷三磷酸酶可用于從籠蔽的ATP原料中消除摻雜的ATP。并且，腺苷三磷酸酶不影響籠蔽的ATP。結(jié)果的變化可能是在使用高濃度ATP時的測量誤差引起的。實施例6 在一次性樣品比色池中使用冷凍干燥的“籠蔽”物質(zhì)對實驗進行標(biāo)定將籠蔽的ATP溶液(14.3mmol/l；10μl)轉(zhuǎn)移到1ml pH7.75的HEPES/EDTA/Mg緩沖液(pH 7.75，Lumit緩沖液，Lumac bv)中，并加入5μl馬鈴薯腺苷三磷酸酶溶液。馬鈴薯腺苷三磷酸酶是從Lumac bv獲得的工業(yè)制品(Somase)，通過向一瓶腺苷三磷酸酶中加入1ml Lumit緩沖液而重新配制。將含有腺苷三磷酸酶的籠蔽的ATP的溶液在20℃保溫40分鐘，然后用Lumit緩沖液1∶1稀釋。將各份(1μl)溶液轉(zhuǎn)移到干凈的一次性塑料比色池(自得Biotrace plc)中。這一步驟使每個比色池中含有143pmol籠蔽的ATP。然后將比色池放置于真空保干器中并在真空下于-55℃冷凍干燥2小時。
冷凍干燥后，按下列方法測定比色池。將無菌去離子水(300μl)轉(zhuǎn)入每個比色池中，然后加入100μl熒光素酶/熒光素試劑(BiotraceMLX試劑，Biotrace plc)。用Biotrace Multilite發(fā)光計記錄發(fā)出的光，然后用閃光燈從存在的籠蔽ATP中釋放出ATP，閃光燈安置于構(gòu)建在BRF International(Box序號002)的裝置中。從重復(fù)的比色池中獲得下列結(jié)果。
空白值(RLU) 閃光后的值(RLU)比色池1288390931比色池2288292759比色池3259890078比色池4294484657也可以在向比色池中加入任何樣品或試劑之前通過閃光使ATP從比色池所含冷凍干燥物質(zhì)中釋放出來。在進行的這些實驗中得到了下列結(jié)果。
對干燥比色池閃光后所得空白值(RLU)*閃光后的值(RLU)比色池1 49170 133736比色池2 75870 141760比色池3 34206 116517*加入的試劑與前面的實驗相同。
這些結(jié)果表明，即使存在極少量水時ATP仍可以從籠蔽的ATP中釋放出來。因此，如果需要，可以設(shè)計這樣的分析方法在分析的任何液體步驟之前使ATP或其它分析物從“籠蔽”分子中釋放出來。在某些情況下，這可能是標(biāo)定某些實驗的便利途徑。實施例7 用籠蔽的花生四烯酸和變化量的光制備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液將籠蔽的花生四烯酸(Molecular Probes Inc，USA；生產(chǎn)批號A-7062)溶于HEPES/EDTA緩沖液(pH7.75)中至終濃度為14.4mol/l。將溶液各份(100μl)轉(zhuǎn)移到干凈的一次性試管中，然后用Hanimex閃光槍進行1至10次閃光。光解后，用任何適于定量花生四烯酸的方法，如HPLC、GC/MS、TLC或特異性的酶法來分析溶液。
可以按這種方法制備“校正曲線”，該方法制備的曲線與通過把不同濃度的等體積標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取到各瓶中所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線類似。所述光標(biāo)定技術(shù)顯著節(jié)省了操作者的人力而達到了同樣的結(jié)果。該技術(shù)本質(zhì)上也是無損的。實施例8 用籠蔽的青霉素V和變化量的光制備一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液將籠蔽的青霉素V(Molecular Probes Inc，USA生產(chǎn)批號P-7061)溶于HEPES/EDTA緩沖液(pH7.75)中至終濃度為14.4mol/l。將溶液各份(100μl)轉(zhuǎn)移到干凈的一次性試管中，然后用Hanimex閃光槍進行1至10次閃光。光解后，用任何適于定量青霉素V的方法，例如ELISA實驗分析溶液。
可以按這種方法制備“校正曲線”，該方法制備的曲線與通過把不同濃度的等體積標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取到各瓶中所制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線類似。所述光標(biāo)定技術(shù)顯著節(jié)省了操作者的人力而達到了同樣的結(jié)果。該技術(shù)本質(zhì)上也是不損的。
可用在類似于實施例7和8的方法中的其它籠蔽分析物的例子包括籠蔽的天冬氨酸(Molecular Probes Inc USA產(chǎn)品編號A-2505)、籠蔽的L-賴氨酸(Molecular Probes Inc.USA產(chǎn)品編號B-7099)，籠蔽的L-腎上腺素(Molecular Probes Inc USA產(chǎn)品編號D-7057)，籠蔽的L-多巴胺(Molecular Probes Inc USA產(chǎn)品編號D-7064)，籠蔽的L-苯丙氨酸(Molecular Probes Inc USA產(chǎn)品編號D-7093)以及籠蔽的D-熒光素(Molecular Probes Inc USA產(chǎn)品編號L-7085)。
表1 在一個工作日過程內(nèi)用籠蔽的ATP標(biāo)定ATP分析
*RLU＝相對光單位表2在不同的pH值用籠蔽的ATP標(biāo)定ATP分析
*RLU＝相對光單位′NaDMG＝0.1M 3，3’-二甲基戊二酸鈉緩沖液，pH4.00
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)部標(biāo)定化學(xué)分析的方法，包括下列步驟(i)向待測樣品中加入預(yù)定量的分析物光敏衍生物；(ii)測定分析的檢測參數(shù)；(iii)將樣品/光敏衍生物的混合物暴露于預(yù)定時間和強度的可見光閃光下，從光敏衍生物釋放出已知量的分析物；(iv)重新測定檢測參數(shù)；(v)按照需要重復(fù)步驟iii)和iv)0-n次；(vi)計算檢測參數(shù)測定中的變化；并且(vii)用得自步驟(vi)的計算值作標(biāo)準(zhǔn)，測定最初存在于樣品中的分析物的量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中分析物的光敏衍生物是分析物的籠蔽形式。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中對分析物的光敏衍生物進行預(yù)處理以降低非籠蔽形式的分析物衍生物造成的污染。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中將分析物的籠蔽衍生物冷凍干燥在載體上。
5.根據(jù)前面的權(quán)利要求中任何一項的方法，包括一個附加的步驟，以補償分析物質(zhì)或設(shè)備任何固有的磷光。
6.一種外部標(biāo)定化學(xué)分析的方法，包括下列步驟(i)將預(yù)定量的分析物光敏衍生物暴露于預(yù)定時間和強度的可見光閃光下，從光敏衍生物釋放出已知量的分析物；(ii)測定分析的檢測參數(shù)；(iii)按照需要重復(fù)步驟(i)和(ii)0-n次；(iv)計算檢測參數(shù)測定中的變化；并且(v)用得自步驟(iv)的計算值作標(biāo)準(zhǔn)，可將分析樣品的結(jié)果與之相比較。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中分析物的光敏衍生物是分析物的籠蔽形式。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中對分析物的光敏衍生物進行預(yù)處理以降低非籠蔽形式的分析物衍生物造成的污染。
9.根據(jù)權(quán)利要求6、7或8的方法，其中將分析物的籠蔽衍生物冷凍干燥在載體上。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任何一項的方法，包括一個附加的步驟，以補償分析物質(zhì)或設(shè)備任何固有的磷光。
11.一種標(biāo)定ATP-生物發(fā)光分析的方法，包括下列步驟(i)將預(yù)定量的ATP光敏衍生物加入螢火蟲熒光素酶-熒光素試劑中；(ii)測定試劑發(fā)出的光；(iii)將待測樣品與試劑混合；(iv)再測定發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光；(v)將樣品/試劑混合物暴露于預(yù)定時間和強度的可見光閃光下，從光敏衍生物釋放出已知量的ATP；(vi)再測定發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光；(vii)按照需要重復(fù)步驟v)和vi)0-n次；(viii)計算發(fā)光測定中的變化；并且(ix)用得自步驟(vii)的計算值作標(biāo)準(zhǔn)，測定最初存在于樣品中的ATP的量。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中ATP的光敏衍生物是ATP的籠蔽形式。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中ATP的籠蔽形式是ATP的硝基苯酚酯。
14.根據(jù)權(quán)利要求11、12和13的方法，其中通過在4℃保溫8-20小時或更長時間對含籠蔽ATP的熒光素酶-熒光素試劑進行預(yù)處理，從而消除摻雜的ATP分子。
15.根據(jù)權(quán)利要求11、12和13的方法，其中用ATP降解酶對籠蔽的ATP進行預(yù)處理，從而消除摻雜的ATP分子。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任何一項的方法，包括一個附加的步驟，以補償分析物質(zhì)或設(shè)備任何固有的磷光。
17.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任何一項的方法，其中將籠蔽的ATP冷凍干燥在載體上。
18.一種標(biāo)定ATP生物發(fā)光分析的試劑盒，包括1)分析緩沖液2)ATP光敏衍生物；和3)螢火蟲熒光素酶-熒光素試劑。
19.根據(jù)權(quán)利要求13的試劑盒，進一步包括4)發(fā)光計；和5)高強度光源。
全文摘要
公開了內(nèi)部和外部光標(biāo)定化學(xué)分析如ATP-生物發(fā)光分析的方法。分析方案中使用了預(yù)定量的待測分析物的光敏衍生物，當(dāng)其暴露于預(yù)定時間和強度的可見光閃光時釋放出已知量的游離分析物。通過監(jiān)測分析的檢測參數(shù)對已知量分析物釋放的響應(yīng)，可以計算標(biāo)準(zhǔn)值，該值可以用來直接測定最初存在于分析樣品中的分析物的量，或者產(chǎn)生光標(biāo)定系列，分析樣品的結(jié)果可與之相比較。
文檔編號G01N33/96GK1148870SQ9519320
公開日1997年4月30日 申請日期1995年4月6日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月6日
發(fā)明者W·J·西蒙斯, J·M·佩耶 申請人:布拉福國際公司