專利名稱：：生產(chǎn)特異于肽和mhc分子復(fù)合物的胞溶性t細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及獲得特異于一種肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞亞群的方法。
背景技術(shù)：
：免疫性的基礎(chǔ)是免疫系統(tǒng)能識別外來分子(抗原)并與其反應(yīng)，而同時(shí)能容忍機(jī)體自身組織的分子。淋巴細(xì)胞是負(fù)責(zé)識別并區(qū)分免疫系統(tǒng)遇到的各種抗原的細(xì)胞。每種淋巴細(xì)胞攜帶一能識別特定抗原的表面受體，雖然每種淋巴細(xì)胞只攜帶一種類型的受體并因此只能識別一種類型的抗原，但是不同的淋巴細(xì)胞具有不同的受體，因此淋巴細(xì)胞群作為一個(gè)整體能識別很寬范圍的抗原。淋巴細(xì)胞有兩種主要類型，即在骨髓或胎兒肝臟發(fā)育生成并能分化成抗體生成漿細(xì)胞的B細(xì)胞，以及在胸腺中分化并具有各種不同功能的T細(xì)胞。B細(xì)胞和T細(xì)胞使用的抗原受體是不同的，B細(xì)胞可識別溶液中游離的或在其它細(xì)胞表面的未修飾的抗原分子，而T細(xì)胞僅能識別與由主要組織相容性復(fù)合物(MHC)編碼的分子一起被提呈到其細(xì)胞上的抗原。提呈抗原的細(xì)胞被稱為抗原提呈細(xì)胞(“APCs”)，在人類中，MHCs被稱為“HLAs”或“人白細(xì)胞抗原”。抗原提呈細(xì)胞吸收抗原并將其隔離在細(xì)胞內(nèi)小體內(nèi)，隨后加工抗原并在一需要細(xì)胞存活性的耗能動(dòng)力學(xué)過程中將加工后的抗原提呈到細(xì)胞表面的細(xì)胞膜上。有許多顯著證據(jù)表明由T細(xì)胞識別的大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)抗原即重新表達(dá)的表面抗原是非天然形式。動(dòng)力學(xué)研究顯示在原始抗原結(jié)合到提呈細(xì)胞和有效抗原提呈到T細(xì)胞之間有約1小時(shí)的延遲，當(dāng)抗原結(jié)合到提呈細(xì)胞后立即而不是稍后給予升高溶酶體pH的試劑例如氨水和氯喹時(shí)可以抑制有效抗原提呈的發(fā)生。所有這些發(fā)現(xiàn)均得出這樣一個(gè)概念即“抗原加工”，基于以上所述的信息，抗原加工已被推斷涉及由提呈細(xì)胞對內(nèi)在抗原的責(zé)任性部分降解，以及隨后的抗原性片段以能與Ia分子一起被T細(xì)胞識別的形式在表面細(xì)胞膜上的重新表達(dá)。事實(shí)上，一種蛋白被加工并提呈到細(xì)胞表面的機(jī)制現(xiàn)在已得到很好的論述，這一領(lǐng)域發(fā)展的概述可參見Barinaga，“獲得一些基本知識MHC如何結(jié)合肽”，科學(xué)257880(1992)；以及Fremont等人，科學(xué)257919(1992)；Matsumura等人，科學(xué)257927(1992)；Latron等人，科學(xué)257964(1992)。這些文獻(xiàn)通常要求與MHC/HLA分子結(jié)合的肽約9個(gè)氨基酸長度(“九肽”)并且一些MHC分子優(yōu)選在某些位置有特定的氨基酸，例如，九肽的第1位和第9位殘基很重要。最近的研究工作提示其它氨基酸也可作為所謂的“錨著”位置?，F(xiàn)有技術(shù)中產(chǎn)生特異于抗原/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞(CTLs)是將混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物與已在細(xì)胞內(nèi)加工希望抗原的抗原提呈細(xì)胞混合，抗原提呈細(xì)胞起始具有識別該抗原/MHC復(fù)合物的T細(xì)胞受體的胞溶性T細(xì)胞前體的應(yīng)答，由此那些T細(xì)胞被活化并開始細(xì)胞分裂和增殖。這種產(chǎn)生特異于一定抗原/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞克隆的方法有一系列缺點(diǎn)，特別是其依賴于加工細(xì)胞產(chǎn)生所需肽的能力，以及需要所提呈的肽的來源(例如，較大的抗原)，因此，目前仍需要改進(jìn)的產(chǎn)生特異于抗原/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞的方法。本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現(xiàn)將血單核細(xì)胞暴露于肽將使肽直接與血單核細(xì)胞表面存在的MHC分子結(jié)合，并且該暴露后的細(xì)胞能刺激特異于該肽和MHC分子的復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞。血單核細(xì)胞并不在細(xì)胞內(nèi)加工肽。結(jié)果是，本發(fā)明提供了一種獲得特異于特定肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞的方法以及鑒定抗原性肽的方法。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種改進(jìn)的獲得特異于一種肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種鑒定能產(chǎn)生胞溶性T細(xì)胞應(yīng)答的抗原性肽的方法。為實(shí)現(xiàn)這些和其它目的，本發(fā)明提供了一種獲得特異于一種肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞亞群的方法，該方法包括將血單核細(xì)胞樣品與所述的肽接觸以使所述的肽直接與存在于所述的血單核細(xì)胞表面的MHC分子結(jié)合，以及在利于刺激任何特異于所述的肽和該肽所結(jié)合的所述的MHC分子的復(fù)合物的CD8β+細(xì)胞的條件下將所述的樣品與CD8β+細(xì)胞群接觸。本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下的詳細(xì)描述中變得清楚，然而應(yīng)理解的是該詳細(xì)描述和具體的實(shí)施例在指示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的同時(shí)僅僅是舉例說明，因?yàn)樵诒景l(fā)明的精神和范圍內(nèi)的各種改變和修改對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員在閱讀詳細(xì)描述后均是顯而易見的。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的獲得特異于一種肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞亞群的方法，該方法包括將血單核細(xì)胞樣品與所述的肽接觸以使所述的肽直接與存在于所述的血單核細(xì)胞表面的MHC分子結(jié)合，以及在利于刺激任何特異于所述的肽和該肽所結(jié)合的所述的MHC分子的復(fù)合物的CD8β+細(xì)胞的條件下將所述的樣品與CD8β+細(xì)胞群接觸。與MHC分子結(jié)合的肽可以是任何能激起胞溶性T細(xì)胞應(yīng)答的肽，已知某些MHC分子優(yōu)選在肽的特定位置有特定的氨基酸，見Barinaga.，Matsumura等人，以及Latron，文獻(xiàn)同上。1992年5月22日申請并轉(zhuǎn)讓給本申請的受讓人的PCT申請PCT/US92/04354(引入本文作參考)，公開了一個(gè)人腫瘤排斥抗原前體編碼基因家族，稱為MAGE家族。在vanderBruggen等人，科學(xué)2541643(1991)中討論了這些基因中的一些?，F(xiàn)已清楚MAGE家族的各種基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并可作為診斷這些腫瘤的標(biāo)志，該文獻(xiàn)中還討論了其它用途。還可參見Traversari等人，免疫遺傳學(xué)35145(1992)；vanderBruggen等人，科學(xué)2541643(1991)。對于MAGE家族基因的研究表明一些特定的肽被提呈在腫瘤細(xì)胞的表面，這種九肽的提呈需要提呈分子是HLA-A1。MAGE-1腫瘤排斥抗原(“TRA”)的復(fù)合物導(dǎo)致提呈該肽的細(xì)胞被胞溶性T細(xì)胞溶解。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該肽是MAGE衍生的肽。特別優(yōu)選的是MAGE-1肽MZ2-E，或一種來源于MAGE-3并被HLA-A2分子提呈的肽，在本文由SEQIDNOS2，3和4描述。根據(jù)本發(fā)明在體外產(chǎn)生的胞溶性T細(xì)胞可以使用公知的技術(shù)給予患者以治療腫瘤細(xì)胞相關(guān)的疾病。該胞溶性T細(xì)胞溶解腫瘤細(xì)胞，因此達(dá)到所希望的治療目的。胞溶性T細(xì)胞在診斷方面也是有用的，例如，當(dāng)獲得特異于一種肽/MHC復(fù)合物的CTLs時(shí)，可使用熟知的技術(shù)如鉻釋放分析和TNF釋放分析開發(fā)出檢測特定肽/MHC復(fù)合物存在的分析方法。本發(fā)明還可用于鑒定抗原性肽，在這種實(shí)施方案中，將感興趣的肽與血單核細(xì)胞接觸以使該肽與細(xì)胞表面的MHC分子結(jié)合，然后在利于刺激任何特異于所述的肽/MHC分子的復(fù)合物的CD8β+細(xì)胞的條件下將該細(xì)胞與CD8β+細(xì)胞群接觸。所述的肽優(yōu)選長度為9-20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選9-12個(gè)氨基酸，最優(yōu)選的是九聚體，即長度為9個(gè)氨基酸。實(shí)施例實(shí)施例1產(chǎn)生特異于Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His-Ser-Tyr/HLA-A1復(fù)合物的CTLsA.試劑本實(shí)施例所用培養(yǎng)基為“Iscove培養(yǎng)基”(GIBCO，GrandIsland，NY)，補(bǔ)加有10％濃集ABO脫補(bǔ)體人血清，L-精氨酸(0.55mM)，L-天冬酰胺(0.24mM)，L-谷氨酰胺(1.5mM)和2-巰基乙醇(5×10-5M)。MZ2-E肽由Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His-Ser-Tyr(SEQIDNO1)組成，并被凍干、以2mM重懸于水并在-80℃儲(chǔ)存。該肽已知由HLA-A1分子提呈(Traversari等人，文獻(xiàn)同上)?？笴D8β抗體是偶聯(lián)有熒光素的單克隆抗體1A3.3，然而可使用任何抗CD8β抗體。白介素2(IL-2)用作刺激CD8β+細(xì)胞增殖的試劑，濃度為1單位/毫升能使得IL-2依賴細(xì)胞系CTLL-2半數(shù)最大增殖。也可使用其它刺激CD8β+細(xì)胞增殖的試劑，如其它白介素或細(xì)胞因子，T細(xì)胞生長因子，促有絲分裂劑，和其它現(xiàn)有技術(shù)熟知的物質(zhì)。通過使用公知技術(shù)(不在此贅述)，將克隆有HLA-A1基因的質(zhì)粒pcDSRα和帶有遺傳素(geneticin)抗性基因的質(zhì)粒pSVtkneoβ共轉(zhuǎn)染到EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系中產(chǎn)生克隆C1R-A1.c13。從遺傳素抗性轉(zhuǎn)染子中分離克隆。通過用抗HLA-A1單克隆抗體標(biāo)記表明克隆C1R-A1.c13表達(dá)HLA-A1。B.分離CD8β+細(xì)胞通過密度梯度離心分離來自患者M(jìn)Z2的血單核細(xì)胞并在含10％DMSO培養(yǎng)基中于-80℃儲(chǔ)存。將這些細(xì)胞解凍并用熒光素偶聯(lián)的mAb1A3.3標(biāo)記。在ATC3000流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器上挑選CD8β+淋巴細(xì)胞(在此例中為20％)，并將其用25mlIscove’s培養(yǎng)基以800個(gè)細(xì)胞/孔接種到V型底96孔微孔中。C.刺激CD8β+淋巴細(xì)胞將作為刺激細(xì)胞的血單核細(xì)胞解凍并將其以5×106細(xì)胞/ml重懸于含5mg/ml人β2微球蛋白和100mM上述MZ2-E肽的無血清培養(yǎng)基X-VIVO10中。在37℃溫育2小時(shí)后，用3000rads銫源照射血單核細(xì)胞，并用培養(yǎng)基調(diào)整至4×105細(xì)胞/ml。加入IL-2(20U/ml)并將25ml懸液(相當(dāng)于10000個(gè)刺激細(xì)胞)加入含步驟B得到的CD8β+淋巴細(xì)胞的微孔中。將該微型培養(yǎng)物于8％CO2中37℃溫育。在第3天，通過加入含3mMMZ2-E肽和10U/mlIL-2的25ml培養(yǎng)基再刺激該微型培養(yǎng)物。在第7天，將自體血單核細(xì)胞與MZ2-E肽以上述相同的方式接觸，將這些刺激細(xì)胞(10000/微型培養(yǎng)物)加到50ml補(bǔ)加了10U/mlIL-2的培養(yǎng)基中。在第11天，將刺激細(xì)胞轉(zhuǎn)移到平底微孔(Nunc)中，并加入160ml含10U/mlIL-2的培養(yǎng)基。D.CD8β+淋巴細(xì)胞的溶解活性在第14、18和23天，將每份50ml的應(yīng)答細(xì)胞轉(zhuǎn)移到V型底微孔中分析它們的溶解活性，其體積由含5U/mlIL-2的培養(yǎng)基替代。在第15天，通過加入溶于含5U/mlIL-2的培養(yǎng)基中的MZ2-E肽至終濃度800nM再刺激微型培養(yǎng)物。微型培養(yǎng)物的溶解活性的測定采用不表達(dá)MZ2-E抗原的標(biāo)記的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系C1R-A1.c13及與肽MZ-2E接觸的相同標(biāo)記細(xì)胞。如Traversari等人(文獻(xiàn)同上并引入本文作參考)所述用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞，如下所述將標(biāo)記的C1R-A1.c13細(xì)胞與MZ2-E肽接觸以1-5×105細(xì)胞/ml將細(xì)胞重懸于含600nM肽的培養(yǎng)基中，并在37℃溫育30分鐘。對照細(xì)胞在不含肽的培養(yǎng)基中溫育。將細(xì)胞離心，重懸于培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并加入到效應(yīng)細(xì)胞中(1000靶細(xì)胞/微孔)。發(fā)現(xiàn)了帶有肽特異性溶解活性的微型培養(yǎng)物，其中的大多數(shù)是在第14天、第18天和第23天發(fā)現(xiàn)這一活性的。表1微型培養(yǎng)物的溶解活性(特異溶解率，％)表注用與MAGE-1MZ2-E九肽接觸的經(jīng)照射的自體血單核細(xì)胞刺激的MZ2CD8β+淋巴細(xì)胞微型培養(yǎng)物的溶解活性。特異性溶解百分比以在刺激的第14、18和23天分析的兩套36個(gè)微型培養(yǎng)物中表示。靶細(xì)胞是表達(dá)HLA-A1但不表達(dá)MZ2-E抗原的EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系C1R-A1.c13，以及與MZ2-E肽接觸的相同細(xì)胞。顯示肽特異性的微型培養(yǎng)物的溶解活性用方框表示。顯示MZ2-E肽特異性的23個(gè)微型培養(yǎng)物在體外用熟知的技術(shù)擴(kuò)增，將胞溶性T細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移到2ml孔中并在第28、37和44天通過加入補(bǔ)加MZ2-E肽(200nM)、IL-2(30U/ml)的培養(yǎng)基以及作為飼養(yǎng)細(xì)胞的照射過的(10000rads)同種EBV-B細(xì)胞(106/孔)再刺激。在第48天，用與MZ2-E肽接觸的C1R-A1.c13細(xì)胞、MZ2-MEL腫瘤細(xì)胞、喪失MZ2-E抗原表達(dá)的抗原缺失變異體MZ2-MELE腫瘤細(xì)胞測定CTL克隆的溶解活性。仍有13個(gè)微型培養(yǎng)物顯著溶解與肽接觸的C1R-A1.c13細(xì)胞(在E/T比率為30時(shí)為大于20的溶解率)。它們還能溶解自體黑素瘤細(xì)胞，但不溶解不提呈MZ2-E抗原的變異體(見表2)。表2微型培養(yǎng)物的溶解活性(特異溶解率，％)</tables>表注抗MZ2九肽的微型培養(yǎng)物的溶解活性以及由這些微型培養(yǎng)物衍生的穩(wěn)定抗MZ2-MELCTL克隆的溶解活性。僅示出了在第23天的特異于MZ2-E肽的微型培養(yǎng)物，在第23天觀察到的溶解值示于表中。然后將這些微型培養(yǎng)物擴(kuò)增并在第48天和68天以規(guī)定的效應(yīng)子/靶細(xì)胞比率和附加的靶細(xì)胞分析其溶解活性，所述的附加的靶細(xì)胞為自體MZ2-MEL黑素瘤細(xì)胞系及其E抗原缺失變異體。抗MZ2-ECTL克隆82/30的溶解活性作為對照示出，這一CTL克隆在PCT/US92/04354(引入本文作參考)中有述。在第49天和58天，將來自該13個(gè)微型培養(yǎng)物的克隆用補(bǔ)加IL-2(50U/ml)的培養(yǎng)基、照射過(10000rads)的EBV-B細(xì)胞(106/孔)和照射過的MZ2-MEL腫瘤細(xì)胞(105/孔)再刺激。在第68天再次測試其溶解活性，仍然全部能溶解MZ2-MEL腫瘤細(xì)胞(表2)。實(shí)施例2產(chǎn)生特異于MAGE-3HLA-A2復(fù)合物的CTLA.試劑本實(shí)施例所用培養(yǎng)基為“Iscove培養(yǎng)基”，補(bǔ)加有10％濃集ABO脫補(bǔ)體人血清，L-精氨酸(0.55mM)，L-天冬酰胺(0.24mM)，L-谷氨酰胺(1.5mM)和2-巰基乙醇(5×10-5M)。分別將MAGE-3肽Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Arg-Ala-Leu-Val(SEQIDNO2)(密碼子271-279；以下稱為“LB-373-1”)，Ala-Leu-Ser-Arg-Lys-Val-Ala-Glu-Leu-Val(SEQIDNO3)(密碼子108-117；以下稱為“LB-373-2”)，和Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val(SEQIDNO4)(密碼子277-286；以下稱為“LB-373-3”)凍干，并以2mM濃度重懸于水中并于-80℃儲(chǔ)存。已知這些肽由HLA-A2分子提呈(見在審專利USSN08/217,187，申請日為1994年3月24日，引入本文作參考)。B.分離CD8β+細(xì)胞通過密度梯度離心分離來自患者LB373的血單核細(xì)胞(該患者的腫瘤細(xì)胞提呈HLA-A2+并表達(dá)MAGE-3)并在含10％DMSO培養(yǎng)基中于-80℃儲(chǔ)存。將這些血單核細(xì)胞解凍并用熒光素偶聯(lián)的mAb1A3.3標(biāo)記。在ATC3000流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器上挑選CD8β+淋巴細(xì)胞，并將其用25ml培養(yǎng)基以1000個(gè)細(xì)胞/孔接種到V型底96孔微孔中。終體積中包括100μl補(bǔ)加有10％人血清、天冬酰胺-精氨酸-谷氨酰胺、10U/mlr-hu-IL-2和10ng/mlr-hu-IL-7的Iscove’s培養(yǎng)基。C.刺激CD8β+淋巴細(xì)胞將T2細(xì)胞重懸于無血清Iscove’s培養(yǎng)基+1/3(v/v)抗人I類mabW6/32培養(yǎng)物上清中，該T2細(xì)胞提呈HLA-A2但有抗原加工缺陷并因此具有增加的提呈外源肽的能力(Cerundolo等，自然345449(1990))，于4℃溫育30分鐘，然后用來自銫源的100Gy照射。而后離心細(xì)胞并將沉淀重懸于含2.5μg/ml人B2微球蛋白和100μg/mlLB-373-1、LB-373-2或LB-373-3肽的X-Vivo培養(yǎng)基中。在37℃溫育細(xì)胞至少1小時(shí)，然后離心并重懸于補(bǔ)加10％人血清的Iscove’s培養(yǎng)基中。在第0天，將與LB-373-1、LB-373-2或LB-373-3肽預(yù)溫育的3000個(gè)T2細(xì)胞加到含步驟B得到的CD8β+細(xì)胞的微孔中。在第7天，通過加入含10U/mlr-hu-IL-2和10ng/mlr-hu-IL-7的100μl新鮮培養(yǎng)基和6000個(gè)與LB-373-1、LB-373-2或LB-373-3肽預(yù)溫育的LB373-PBLs再刺激微型培養(yǎng)物。這些均按如上所述制備。在第15天，將CD8β+細(xì)胞轉(zhuǎn)移到平底微孔中并通過加入含10U/mlr-hu-IL-2和10ng/mlr-hu-IL-7的100μl新鮮培養(yǎng)基和6000個(gè)與LB-373-1、LB-373-2或LB-373-3肽預(yù)溫育的LB373-PBLs再刺激微型培養(yǎng)物。這些均按如上所述制備。在第16天，由于強(qiáng)烈的增殖，將微型培養(yǎng)物分成兩份(2/3和1/3)。D.CD8β+淋巴細(xì)胞的溶解活性在第21天，用與或未與三種MAGE-3肽之一預(yù)溫育的HLA-A2+靶細(xì)胞測試淋巴細(xì)胞的溶解活性。在第23天，通過加入含10U/mlr-hu-IL-2和10ng/mlr-hu-IL-7的100μl新鮮培養(yǎng)基和25000個(gè)與LB-373-1肽預(yù)溫育的LB373-PBL再刺激微型培養(yǎng)物(1/3)。隨后，通過加入不同的同種異體的HLA-A2+和MAGE-3+照射的黑素瘤細(xì)胞、LG2-EBV飼養(yǎng)細(xì)胞、IL-2(50U/ml)和IL4(±5U/ml)每周對“陽性”微型培養(yǎng)物再刺激。用與或未與三種MAGE-3肽之一預(yù)溫育的HLA-A2靶細(xì)胞測試來自不同微型培養(yǎng)物的淋巴細(xì)胞的溶解活性。在864個(gè)微型培養(yǎng)物中有22個(gè)微型培養(yǎng)物其淋巴細(xì)胞對與Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Arg-Ala-Leu-Val預(yù)溫育的HLA-A2+靶細(xì)胞有更高的溶解活性，這是與未和肽預(yù)溫育的相同靶細(xì)胞相比。隨后每周用不同的HLA-A2+刺激細(xì)胞再刺激“陽性”微型培養(yǎng)物。下表示出某些“CTL克隆”的溶解活性。17.01.94第33天24.01.94第40天10.02.94第57天<p>表中結(jié)果證明所示的三個(gè)CTL系能識別被HLA-A2+靶細(xì)胞提呈的LB-373-1肽，因此證明本發(fā)明的可操作性。應(yīng)意識到的是步驟的次序是不重要的，例如，盡管可能優(yōu)選的是在與CD8β+細(xì)胞接觸之前將APCs與肽合并，然而還可以在加入肽之前將兩種細(xì)胞合并。類似地，可以在細(xì)胞合并之前或之后加入增殖刺激劑。另外，培養(yǎng)條件也可以變化，盡管實(shí)施例示出使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)BMCs，但可以使用任何合適的培養(yǎng)基。任何對于本文的具體實(shí)施例的可能的變動(dòng)對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員均是顯而易見的。在此不再贅述。序列表(1)一般信息(i)申請人皮埃爾·庫利耶皮埃爾·范德布呂根蒂爾瑞·布恩-法勒爾(ii)發(fā)明名稱生產(chǎn)特異于肽和MHC分子復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞的方法(iii)序列數(shù)目4(iv)通訊地址(A)收信人Felfe&amp;Lynch(B)街道805ThirdAvenue(C)城市紐約市(D)州紐約州(E)國家美國(F)郵編10022(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤，5.25英寸，500kb儲(chǔ)存容量(B)計(jì)算機(jī)IBM(C)操作系統(tǒng)PC/DOS(D)軟件Wordperfect(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?8/261,541(B)申請日1994年6月17日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Bauer，JohnA.(B)注冊號32,554(C)案號/文檔號LUD5328(ix)電訊信息(A)電話212-688-9200(B)傳真212-838-3884(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQIDNO1Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His-Ser-Tyr(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)長度9個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQIDNO2Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Arg-Ala-Leu-Val(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQIDNO3A1a-Leu-Ser-Arg-Lys-Val-Ala-Glu-Leu-Val(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特征(A)長度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)渚€性(xi)序列描述SEQIDNO4Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Va權(quán)利要求1.獲得特異于一種肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞亞群的方法，包括(a)將由血單核細(xì)胞組成的樣品與所述的肽接觸以使所述的肽直接與所述血單核細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合；(b)在利于刺激特異于所述的肽和該肽所結(jié)合的任何MHC分子的復(fù)合物的任何CD8β+細(xì)胞的條件下，將所述的樣品與CD8β+細(xì)胞群接觸；以及(c)獲得特異于步驟(b)得到的所述肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞亞群。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的肽的長度為9-12個(gè)氨基酸。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的肽的長度為9個(gè)氨基酸。4.權(quán)利要求1的方法，其中所述的MHC分子為HLA-A1。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述的肽是Glu-Ala-Asp-Pro-Thr-Gly-His-Ser-Tyr。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述的MHC分子是HLA-A2。7.權(quán)利要求6的方法，其中所述的肽是Phe-Leu-Trp-Gly-Pro-Arg-Ala-Leu-Val。8.權(quán)利要求6的方法，其中所述的肽是Ala-Leu-Ser-Arg-Lys-Val-Ala-Glu-Leu-Val。9.權(quán)利要求6的方法，其中所述的肽是Ala-Leu-Val-Glu-Thr-Ser-Tyr-Val-Lys-Val。10.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在與所述的CD8β+細(xì)胞接觸之前將所述的血單核細(xì)胞與β2微球蛋白接觸。11.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在無血清培養(yǎng)基中將所述的血單核細(xì)胞與所述的CD8β+細(xì)胞接觸。12.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在與所述的CD8β+細(xì)胞接觸之前照射所述的血單核細(xì)胞。13.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將所述的CD8β+細(xì)胞與刺激所述的CD8β+細(xì)胞增殖的試劑接觸。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述的試劑是白介素2。15.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在將步驟(a)得到的所述血單核細(xì)胞樣品與步驟(b)的所述CD8β+細(xì)胞群接觸后，向含有步驟(a)得到的所述血單核細(xì)胞樣品和步驟(b)的所述CD8β+細(xì)胞群的培養(yǎng)物中加入另外一定量的所述的肽。16.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括向所述的培養(yǎng)物中加入CD8β+增殖刺激試劑。17.權(quán)利要求15的方法，其中所述的試劑是白介素2。18.鑒定能產(chǎn)生胞溶性T細(xì)胞應(yīng)答的肽/MHC復(fù)合物的方法，包括(a)將由血單核細(xì)胞組成的樣品與所述的肽接觸以使所述的肽直接與所述血單核細(xì)胞表面上的MHC分子結(jié)合；(b)在利于刺激特異于所述的肽和該肽所結(jié)合的任何MHC分子的復(fù)合物的任何CD8β+細(xì)胞的條件下，將所述的樣品與CD8β+細(xì)胞群接觸；以及(c)確定是否產(chǎn)生胞溶性T細(xì)胞應(yīng)答。19.權(quán)利要求18的方法，其中所述的肽的長度為9-12個(gè)氨基酸。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的肽的長度為9個(gè)氨基酸。21.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括在與所述的CD8β+細(xì)胞接觸之前將所述的血單核細(xì)胞與β2微球蛋白接觸。22.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括在無血清培養(yǎng)基中將所述的血單核細(xì)胞與所述的CD8β+細(xì)胞接觸。23.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括在與所述的CD8β+細(xì)胞接觸之前照射所述的血單核細(xì)胞。24.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括將所述的CD8β+細(xì)胞與刺激所述CD8β+細(xì)胞增殖的試劑接觸。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述的試劑是白介素2。26.權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括在將步驟(a)得到的所述血單核細(xì)胞樣品與步驟(b)的所述CD8β+細(xì)胞群接觸后，向含有步驟(a)得到的所述血單核細(xì)胞樣品和步驟(b)的所述CD8β+細(xì)胞群的培養(yǎng)物中加入另外一定量的所述的肽。27.權(quán)利要求26的方法，進(jìn)一步包括向所述的培養(yǎng)物中加入CD8β+增殖刺激試劑。28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的試劑是白介素2。全文摘要本發(fā)明涉及獲得特異于一種肽/MHC復(fù)合物的胞溶性T細(xì)胞亞群的方法。文檔編號G01N33/569GK1171156SQ95193563公開日1998年1月21日申請日期1995年6月14日優(yōu)先權(quán)日1994年6月17日發(fā)明者皮埃爾·庫利耶,皮埃爾·范德布呂根,蒂爾瑞·布恩-法勒爾申請人:路德維格癌癥研究所