專利名稱：衍生的10,10'-取代的-9,9'-雙吖啶發(fā)光分子和信號溶液的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶(biacridinium)衍生物的合成，用于由這些新分子生產(chǎn)光的新型化學(xué)溶液的制備，以及這些分子在發(fā)光反應(yīng)和測定中的用途。更準確地說，本發(fā)明描述了合成10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶的N-羥基丁二酰亞胺衍生物并證實這種新分子與其它分子如抗體共價結(jié)合的能力以及由這種結(jié)合的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子產(chǎn)生可測量光的能力。本發(fā)明進一步涉及一種在四硼酸鈉水溶液中含有至少一種氧化劑、亞砜、螯合劑、還原糖、和醇的發(fā)光信號溶液，以在化學(xué)測定、核酸測定以及免疫測定中產(chǎn)生有用的高效率光子發(fā)射。
背景技術(shù)：
在各種介質(zhì)中檢測有無物質(zhì)存在或測定物質(zhì)濃度中使用光能測量正成為一種非常有吸引力的方法?，F(xiàn)已有許多生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)體系(Schroeder，et al.，Methods in Enzymology 1724-462(1978)；Zeigler，M.M，和T.O.Baldwin，Current Topics In Bioenergetics，D.Rao Sanadi ed.，(AcademicPress)pp.65-113(1981)；Deluca，M.，Non-Radiometric AssaysTechnologyand Application in Polypeptide and Steroid Hormone Detection，(Alan R.Liss，Inc.)pp.47-60和61-77(1988)；DeJong，G.J.，和P.J.M.Kwakman，J.ofChromatography 492319-343(1989)；McCapra，F(xiàn).等，J.Biolumin.Chemilumin.451-58(1989)；Diamandis，E.P.，Clin.Biochem.23437-443(1990)；Gillevet，P.M.，Nature 348657-658(1990)；Kricka，L.J.，Amer.ClinLab.，Nov/Dec30-32(1990)。
發(fā)光是借助于包括光激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)的任何手段而產(chǎn)生光。化學(xué)發(fā)光是僅通過化學(xué)反應(yīng)而發(fā)射光。它還可定義為在返回到化學(xué)反應(yīng)電子激發(fā)產(chǎn)物的基態(tài)過程中發(fā)射的光(Woodhead，J.S.等，Complementary Immuno-assays.W.P.Collins ed.，(John Wiley & Sons Ltd.)，pp.181-191(1988))。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)可分成酶媒介的反應(yīng)和非酶催反應(yīng)。一些時候以來已知發(fā)光反應(yīng)劑魯米諾在氧化還原酶的酶類(辣根過氧化物酶、黃嘌呤氧化酶、葡糖氧化酶)、H2O2、某些無機金屬離子催化劑或分子(鐵、錳、銅、鋅)、以及螯合劑存在下，在中性-堿性條件中(pH7.0-10.2)可以被氧化，還知道這種氧化作用可導(dǎo)致產(chǎn)生受激中間產(chǎn)物(3-氨基苯二甲酸)，它在衰變返回基態(tài)時發(fā)光(Schroeder，H.R.等，Anal.Chem.481933-1937(1976)；Simpson，J.S.A.等。Nature279646-647(1979)；Baret，A.，U.S.Patent No，4,933,276))。其它用于引起發(fā)光的特異性分子和衍生物除魯米諾以外包括環(huán)狀二酰基酰肼(例如異魯米諾(isoluminols))、雙環(huán)氧丙烷(dioxetane)衍生物、吖啶衍生物以及過氧氧化物(peroxyoxylates)(Messeri，G.等，J.Biolum.Chemilum.4；154-158(1989)；Schaap.A.P.等，Tetrahedron Lett.28935-938(1987)；Givens，R.S等.ACSSymposium Series 383；Luminescence Applications，M.C.Goldberg ed.，(Amer.Chem.Soc.，Wash D.C.，pp.127-154(1989))。能發(fā)光并已被用于分子的超靈敏測量中的另外分子是多環(huán)的和還原硝基多環(huán)芳族烴、多環(huán)芳族胺、熒光胺(fluorescamine)標(biāo)記的兒萘酚胺、以及其它熒光衍生的制劑如香豆素、茚三酮、O-苯二醛、7-氟-4-硝基苯基-2，1，3-噁二唑、萘-2，3-二羧醛(dicarboxaldehydes)、氰苯基[f]異吲哚(isoindoles)以及丹磺酰氯(Simons，S.S.，Jr.and D.F.Johnson，J.Am.Chem.Soc.987098-7099(1976)；Roth，M.，Ahal.Chem.43880-882(1971)；Dunges.W.，同上，49442-445(1977)；Hill，D.W.等，同上，511338-1341(1979)；Lindroth，P.and K.Mopper，同上，511667-1674(1979)；Sigvardson，K.W.and J.W.Birks，同上，55432-435(1983)；Sigvardson，K.W.et al.，同上，561096-1102(1984)；de Montigny，P.et al.，同上，591096-1101(1987)；Grayeski，M.L.and J.K.DeVasto，ibid，591203-1206(1987)；Rubinstein，M.et al.，Ahal.Biochem.95117-121(1979)；Kobayashi，S.-L，et al.，同上，11299-104(1981)；Watanabe，Y.和K.Imai，同上，116471-472(1981)；Tsuchiya，H.，J.Chromatog.231247-254(1982)；DeJong，C.等，同上，241345-359(1982)；Miyaguchi，K.等，同上，303173-176(1984)；Sigvardson，K.W.和J.W.Birks，同上，316507-508(1984)；Benson，J.R.和P.E.Hare，Proc.Nat.Acad.Sci.72619-622(1975)；Kawasaki，T.等，Biomed.Chromatog.4113-118(1990))。
目前有四種已知的非酶催體系吖啶鎓衍生物(McCapra等，英國專利British Patent No.1,461,877；Wolf-Rogers J.等，J.Immunol.Methods 133191-198(1990)；異魯米諾、金屬卟啉(Forgione等，美國專利U.S.Patent No.4.375,972)以及非金屬的四吡咯(Katsilometes，PCT國際專利說明書No.Wo93/23756)。這些體系優(yōu)于酶催體系，它們具有能在數(shù)秒鐘內(nèi)即可導(dǎo)致峰值光輸出量的更快速的動力學(xué)。金屬卟啉是很小的半抗原分子，它能減少抗原結(jié)合中的空間位阻問題。此外，已知是發(fā)光的金屬卟啉分子是那些含有具有發(fā)射率在104以上的順磁金屬離子的金屬卟啉分子(Gouterman，M.，ThePorphyrins，Vol.III，Dolphin，D.，ed.，(Academic Press)48-50，78-87，115-117，154-155(1978)；Canters，G.W and J.H.Van Der Waals，同上，577-578)。還已知金屬卟啉、低卟啉(hypospor phyrin)、偽準(Pseudoriormal)金屬卟啉以及類金屬卟啉(metalloporphyrin-like)分子如金屬二氫卟酚，血紅素、細胞色素、葉綠素、鑭系元素和錒系元素經(jīng)受氧化/還原反應(yīng)處理，這些反應(yīng)無論是初次或二次結(jié)構(gòu)擾動，但都發(fā)生在這些分子的金屬中心，并且還已知它們催化產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)能力已歸屬于這些分子的金屬中心(Eastwood，D.and M.Gouterman，J.Mol.Spectros.35359-375(1970)；Fleischer，E.B.和M.Krishnamurthy，Annals N.Y Academy of Sci.20632-47(1973)；Dolphin，D.等，同上，206177-201；Tsutsui，M.和T.S.Srivastava，同上，206404-408；Kadish，K.M.和D.G.Davis，同上。，206495-504；Felton，R.H.等，同上，206504-516；Whitten，D.G.等，同上，206516-533；Wasser，P.K.W.andJ.-H.Fuhrhop，同上，206533-549；Forgione等，U.S.Patent No.4,375,972；Reszka，K.和R.C.Seally，Photochemistry and Photobiology 39293-299(1984)；Gonsalves，A.M.d′A.R.等，Tetrahedron Lett.321355-1358(1991))。由于反應(yīng)體中可能存在的鐵和其它金屬離子而改變這些反應(yīng)，而且這些金屬離子能干擾并能極大地混淆金屬卟啉共軛濃度的測定(Ewetz，L.和A.Thore，Anal.Biochem.71564-570(1976))。不同的金屬會強烈地影響金屬卟啉的壽命和發(fā)光性能。
非金屬卟啉次卟啉-IX HCl已被證實是引起溶液中魯米諾產(chǎn)生光的媒介(Katsilometes，G.W.，上文)。
在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中和在非同位素配位體結(jié)合測定的研究中，使用發(fā)光的吖啶酯和酰胺衍生物已有報導(dǎo)和評論(Weeks，I.等，Clin.Chem.29/81474-1479(1983)；Weeks，I.和J.S.Woodhead，Trends in Anal，Chem.7/255-58(1988))。在有H2O2和NaOH氧化試劑(pH 13.0)存在下產(chǎn)生閃爍型動力學(xué)光子的極短暫的有效發(fā)射(＜5秒)是這種體系的特征。
吖啶酮和各種取代的吖啶和吖啶酮的制備方法已有綜述(Acridines，Acheson，R.M和L.H.Orgel，(Interscience Publishers，N.Y.)pp.8-33，60-67，76-95，105-123，148-173，188-199，224-233(1956))。以前還對在碳-9原子中兩個吖啶殘基結(jié)合而形成雙吖啶進行過描述和評論(Gleu，K.R.Schaarschmidt，Berichte 8909-915(1940))。這些努力導(dǎo)致合成10，10′-二甲基-10，10′-二苯基-和10，10′-二乙基-9，9′-雙吖啶鎓硝酸鹽分子。還報導(dǎo)了這些分子在暴露于堿性溶液中的過氧化氫時可發(fā)出光(Gleu，K.和W.Petsch，Angew.Chem.4857-59(1935)；Gleu，K.和R.Schaarschmidt，Berichte8909-915(1940))。
由光澤精(10，10′-二甲基-9，9′-雙吖啶鎓硝酸鹽)產(chǎn)生光的機理已廣泛地研究并把該機理歸因于一系列氫氧化物的離子親核加成到吖啶鎓鹽及其還原產(chǎn)物(頗哪醇)中，通過主要的最終產(chǎn)品N-甲基吖啶酮的氧化作用而完結(jié)(Janzen，E.G.等，J.Organic Chem，3588-95(1970)；Maeda.K.等，Bul.Chem.Soc.Japan 50473-481(1977)；Maskiewicz，R.等，J.Am.Chem.Soc.，101/185347-5354(1979)；Maskiewicz，R.等，同上，101/185355-5364(1979))。
10-甲基吖啶在碳-9原子上的改性和衍生作用促使產(chǎn)生具有不同程度穩(wěn)定性的一些有用的化學(xué)發(fā)光分子(Law，S.-J.，等，J.Biolum.Chemilum.488-98(1989))。當(dāng)這些分子暴露于0.1mol/L硝酸中的0.5％w/v過氧化氫后接著暴露于單獨的含0.25mol/L的氫氧化鈉溶液后會產(chǎn)生持續(xù)不到5秒鐘的閃光。
發(fā)光衍生物、發(fā)光衍生的分子或衍生的發(fā)光分子按本發(fā)明定義是一種由官能團或能改變前體分子的化學(xué)反應(yīng)性和性能的基團共價結(jié)合產(chǎn)生的分子，而結(jié)果導(dǎo)致形成適于結(jié)合到分析物或特定結(jié)合配體的發(fā)光分子，希望在測定的發(fā)展中使用。在10，10′兩個位置中的一個或兩個上，N-羥基丁二酰胺的衍生作用是本發(fā)明優(yōu)選的發(fā)光衍生物。只有衍生化合物或分子是通過第一化合物或第一分子反應(yīng)而形成(或能使其形成)新化合物或新分子時，這種化合物或這種分子才能是第一化合物或第一分子的“衍生物”，在保留第一化合物或第一分子至少部分結(jié)構(gòu)時，新化合物或新分子或小于或大于第一化合物或第一分子。當(dāng)用于本發(fā)明時，術(shù)語“衍生物”還可包括“發(fā)光的衍生物”。
在本發(fā)明之前，就已完成了衍生發(fā)光的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶的合成。以前，知道的發(fā)光的雙吖啶(例如光澤精)不含有可以使該分子與另外分子共軛的活性基團(單個或多個)。直到現(xiàn)在，雙吖啶也僅有學(xué)術(shù)意義而用于研究光產(chǎn)生和反應(yīng)離子類相互反應(yīng)的機理上。
在光導(dǎo)材料(例如光學(xué)纖維束)的表面上使用發(fā)光反應(yīng)是研究發(fā)光傳感器或探針的基礎(chǔ)(Blum，L.J.等，Anal.Lett.21717-726(1988))。這種發(fā)光可通過特異性蛋白結(jié)合(抗體)而調(diào)節(jié)并能在探針表面的微型環(huán)境中進行。然后在同種(無分離)試樣的制劑中用光子測量設(shè)備測量光輸出量(Messeri，G-等，Clin，Chem.30653-657(1984)；Sutheland，R.M.等，ComplementaryImmunoassays，Collins，W.P.，ed.，(John Wiley & Sons，Ltd.)pp.241-261(1988))。
現(xiàn)已證明帶電荷的合成聚合物(聚-N-乙基-4-乙烯基吡啶鎓溴化物，PEVP)通過帶電荷的共軛分子經(jīng)靜電的相互作用而能完全抑制光的產(chǎn)生。這一點在由帶負電荷的過氧化物酶的酶催化提高魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中特別予以研究。低分子量電解質(zhì)的加入將會消除這一抑制作用從而支持了所觀察作用的靜電性質(zhì)(Valsenko，S.13.等，J.Biolum.Chemilum.4164-176(1989))。
發(fā)光的毛細管電泳凝膠、凝膠轉(zhuǎn)移或印跡(Southem，Western，Northernand Dot)是提供蛋白和核酸基因材料定量測定技術(shù)的實例。這些技術(shù)可配合放大分析物表達的方法，例如探針、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))帶、RFLP(限制性片段長度多態(tài)現(xiàn)象)法以及放大基因表達的其它方法和其它分析物而使用(Stevenson，R.，Biotech，Lab.84-6(1990))。
提高通過合成能產(chǎn)生大量光子發(fā)射的雙吖啶分子和通過改進現(xiàn)存的信號溶液的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)所得的光輸出量，并具有在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)期間能提供更高光強度的新信號溶液，將有利于改進測定的靈敏度。經(jīng)信號溶液配方的操作來調(diào)制光輸出動力學(xué)的能力，特別有利于制作對各種用途的測定方法(所述用途如基因探針、傳感器、激素等)。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面是檢測樣品中雙吖啶發(fā)光衍生物存在的方法。該方法包括該樣品與一種信號溶液接觸以便通過化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生可測量的發(fā)射光并用測光儀器或裝置測量發(fā)射的光。
本發(fā)明第二方面是合成發(fā)光衍生的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶分子的方法，所述雙吖啶分子能結(jié)合到分析物或結(jié)合到分析物的結(jié)合配體或結(jié)合到分析物結(jié)合配體的配位體。這些分子在其分子的其它位置上，如碳原子1-8，都可能具有另外的取代基。
本發(fā)明第三方面是針對適用于化學(xué)測定、配位體結(jié)合測定、免疫測定或核苷酸測定中發(fā)射可測量光的化學(xué)發(fā)光體系。該體系包括在大約10.0-約14.0范圍的pH下，具有活化和氧化勢比能的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶，結(jié)合到分析物、或結(jié)合到分析物的結(jié)合配體或結(jié)合到分析物結(jié)合配體的配位體上并含有能克服該雙吖啶固有氧化勢的氧化劑或氧化劑組合物。在該體系中雙吖啶起發(fā)光標(biāo)記(觸發(fā)器或標(biāo)簽)的作用以適用于化學(xué)測定、同種、異種競爭性和多層免疫測定、配位體結(jié)合測定以及核苷酸測定中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。在雙吖啶標(biāo)記接觸具有親核反應(yīng)劑和氧化劑或多種氧化劑的信號溶液時會產(chǎn)生出光。
作為標(biāo)記特別有利的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶比已知的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記更靈敏(即可檢測更少量的分析物)，并且能通過控制信號溶液配方而進行光產(chǎn)生動力學(xué)的改進，結(jié)果導(dǎo)致持續(xù)至少0.1秒并可長達6秒鐘的穩(wěn)定光產(chǎn)生的動力學(xué)。
本發(fā)明第四方面是合成具有強有力的發(fā)光性能的新穎10-取代的雙吖啶的方法。該方法包括取代基的酯化、原料(吖啶酮)的烷基化，這種分子的二聚作用和必要時的用N-羥基丁二酰胺衍生化。
本發(fā)明第五方面是化學(xué)發(fā)光的信號溶液，該溶液與一種是發(fā)光分子的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記起反應(yīng)時能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。該信號溶液在約10.0-約14.0的pH下，含有0.02M四硼酸鈉(硼砂)、亞乙基二胺四乙酸(EDTA)、二甲基亞砜(DMSO)、D(-)果糖、過氧化鉀(KO2)和2-甲基-2-丙醇。在化學(xué)發(fā)光標(biāo)記是吖啶鎓衍生物、光澤精、光澤精發(fā)光衍生物、雙吖啶、雙吖啶發(fā)光衍生物、環(huán)狀二?；ｋ禄虻龊舷拢龇磻?yīng)在1ng/ml標(biāo)記濃度時，將會產(chǎn)生至少20∶1的噪聲光子發(fā)射比的信號，持續(xù)至少0.1秒。按標(biāo)記和信號溶液成分濃度的變化而定，在1ng/ml標(biāo)記濃度下，信號比可為50∶1、100∶1、200∶1、500∶1，甚至700∶1和更高。還可控制發(fā)射持續(xù)多達6秒鐘或更長時間。
還要說明的是這種信號溶液能激發(fā)吖啶鎓衍生物，光澤精和10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶化學(xué)發(fā)光，在光輸出中引起顯著的提高，并由用以前已知的信號溶液所得的輸出改變光輸出動力學(xué)。
附圖的簡要說明

圖1是表示實驗結(jié)果的直方圖，該實驗是在用本發(fā)明信號溶液閃爍時比較信號試劑(零)、光澤精和10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶的相對化學(xué)發(fā)光。
圖2是表示在本發(fā)明標(biāo)記與抗體接合時從其掃描分光光度測量得到的結(jié)果圖。
圖3是代表信號的線性曲線，該信號是10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記的抗體與本發(fā)明信號溶液閃爍時獲得的。
圖4是說明在不同的本發(fā)明信號試劑配方下所得的光輸出動力學(xué)的變化性的動力學(xué)研究。
圖5是合成10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶二硝酸鹽的N羥基丁二酰胺衍生物的優(yōu)選方法圖示流程圖。
本發(fā)明的詳細描述盡管本申請中的單詞和術(shù)語具有其標(biāo)記的定義，但下列定義還是用于本發(fā)明的具體實施方案中。
正如本發(fā)明所定義的，一種信號溶液含有一種試劑或一組試劑，當(dāng)試劑與特異性發(fā)光分子或特導(dǎo)性發(fā)光媒介分子結(jié)合時，將會引起光的產(chǎn)生。發(fā)光標(biāo)記或標(biāo)簽按本發(fā)明的描述是一種結(jié)合到分析物、分析物的結(jié)合配體或分析物結(jié)合配體的配位體上的物質(zhì)，這種結(jié)合可以是直接的(例如共價地)或間接的(例如，通過特異性合物質(zhì)(蛋白)、生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物素蛋白橋)結(jié)合，當(dāng)這種物質(zhì)與信號溶液結(jié)合時或發(fā)生光或引起要產(chǎn)生的光。發(fā)光標(biāo)記是一種發(fā)光分子(即發(fā)出光的物質(zhì))。
按本發(fā)明定義，發(fā)光分子是一種物質(zhì)，這種物質(zhì)在受到化學(xué)溶液成分的電子激發(fā)后，在軌道電子衰減到基態(tài)時將會發(fā)出光子(多個光子)。
如本發(fā)明中所用，發(fā)光反應(yīng)劑是一種游離的發(fā)光分子(即未結(jié)合到分析物、分析物的結(jié)合配體或分析物結(jié)合配體的配位體的發(fā)光分子)。同樣如本發(fā)明中所用，單個術(shù)語“發(fā)光分子”也能包括多個“發(fā)光分子”。此外，如本發(fā)明中所用，單個術(shù)語“發(fā)光媒介分子”也能包括多個發(fā)光媒介分子。
如本發(fā)明中所用，信號溶液是由游離分子(即未結(jié)合到分析物、分析物的結(jié)合配體或分析物結(jié)合配體的配位體的)所組成。同樣如本發(fā)明中所用單個術(shù)語“發(fā)光分子”也包括多個“發(fā)光分子”。另外，如本發(fā)明中所用，單個術(shù)語“發(fā)光媒介分子”也包括多個發(fā)光媒介分子。
本發(fā)明針對合成能直接或間接地結(jié)合到分析物、分析物的結(jié)合配體、或分析物結(jié)合配體的配位體的發(fā)光的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶衍生物分子的方法。
本發(fā)明還針對用于在樣品中檢測具有活化和氧化勢比能的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物的存在方法。該方法包括將樣品與信號溶液接觸，該信號溶液含有至少一種能降低10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶活化或氧化勢比能的氧化劑。10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶和氧化劑反應(yīng)通過化學(xué)發(fā)光而產(chǎn)生發(fā)射光。用于說明10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶的化學(xué)發(fā)光產(chǎn)生光的假設(shè)機理是在將親核試劑如氫氧化物離子開始加入到雙吖啶，結(jié)果導(dǎo)致9，9′-碳原子間的二聚物分裂。按上文Janzen等人，Maeda等人、和Maskiewicz等人的討論，這種分裂將產(chǎn)生能被氧化以產(chǎn)生光的兩個N-甲基吖啶酮分子。電子從適當(dāng)?shù)陌l(fā)光分子中排除導(dǎo)致受激中間體的形成；該中間體在發(fā)光分子衰減至基能態(tài)時發(fā)射光子。然后優(yōu)選地是用光度測量儀或裝置如Berthold Lumat LB 950發(fā)光計對光進行測量。由于沒有干擾和沒有用于檢測溶液中熒光團所用的通常熒光法所存在的自身吸收問題，這種方法是更靈敏也更準確。
過氧化鉀對于克服10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶的氧化勢是優(yōu)選的。然而，過氧化鉀和其它氧化劑如四氧化鋨或過氧化氫一起，同樣是能克服10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶固有的氧化勢的另外的氧化劑混合物。
本發(fā)明還針對適于發(fā)射用于化學(xué)測定、配位體結(jié)合測定如免疫測定或核苷酸測定中的可測量光的化學(xué)發(fā)光體系。這種體系含有在約10.0-約14.0的pH下，結(jié)合到分析物或分析物的結(jié)合配體或分析物的結(jié)合配體的配位體的具有氧化勢的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物，和至少一種能降低10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶氧化勢的氧化劑。10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶主要起標(biāo)記(即標(biāo)簽或示跡物)作用并且在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中能產(chǎn)生光。免疫測定可以是同種的或異種的以及是競爭性的或多層的測定。當(dāng)把10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶暴露于一種或多種氧化劑時，10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶借助于化學(xué)發(fā)光而產(chǎn)生光。
這種體系對檢測分析物如核酸、抗體、抗原、半抗原或半抗原的共軛物、大分子、蛋白或聚合物是特別有效的。在該體系中對分析物的結(jié)合配體可以是核苷酸探針、抗體、抗原、半抗原、半抗原共軛物、大分子、蛋白或聚合物。
用于本發(fā)明的配位體意指連接的或結(jié)合的分子并且可包括抗原、抗體、半抗原、半抗原共軛物、大分子、蛋白或除了蛋白的聚合物如聚烴、聚甘油酯或多糖。
用于本發(fā)明中的半抗原共軛物是連接到另外分子的小分子(即分子量低于6000道爾頓的分子)。特別合適的半抗原共軛物是甾類分子-10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶共軛物。通過生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生素蛋白橋分析物可結(jié)合到結(jié)合配體或結(jié)合配體可結(jié)合到配位體。配位體也可以是生物素、抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，而分析物也可通過生物素-抗生物素蛋白、生物素-鏈霉抗生物素蛋白體系而結(jié)合到10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶。當(dāng)該體系包含10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶，發(fā)光標(biāo)記和作為氧化劑的過氧化鉀時，該體系可提供高靈敏度(抗體或抗原檢測可高達10-6-10-20摩爾)。當(dāng)該體系含有螯合劑、DMSO、D(-)果糖、2-甲基-2-丙醇、含水四硼酸鈉和能克服氧化勢的氧化劑組合物時，可獲得更高的靈敏度(抗體或抗原檢測可高達10-22摩爾)。
盡管化學(xué)發(fā)光體系在pH約10-約14范圍內(nèi)是有效的，但優(yōu)選pH是約12.5-13.5。
該體系中的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)簽與其它試劑一起的化學(xué)發(fā)光性能使該體系特別適合于開發(fā)許多的半抗原和大分子分析物的超靈敏測定，對分析物10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶能直接或間接地接合例如激素、維生素、毒素、蛋白、傳染性和接觸傳染試劑、化學(xué)品、藥品、腫瘤標(biāo)記、受體、生物素、抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白和基因材料。10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶還能直接或間接地連接到特異性結(jié)合蛋白如用于化學(xué)發(fā)光測定研究中的抗體。
本發(fā)明還進一步針對發(fā)射用于化學(xué)測定、免疫測定、配位體結(jié)合測定或核酸測定中的可測量光的化學(xué)發(fā)光體系，該體系包括具有特定氧化勢的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶，結(jié)合到分析物、分析物的結(jié)合配體或分析物的結(jié)合配體的配位體并且還包括信號溶液，該溶液含有在約10.0-約14.0的pH下的氧化劑、過氧化鉀或含四氧化鋨和過氧化鉀的氧化劑組合物。
在本發(fā)明與信號溶液一起使用的發(fā)光分子實例是吖啶鎓衍生物、蝶啶、蝶啶衍生物、光澤精、光澤精衍生物、熒光素、熒光素衍生物、環(huán)狀二?；ｋ?魯米諾或異魯米諾)，吖啶鎓衍生物如二甲基吖啶鎓酯或熒光素和光澤精衍生物如由N-羥基二丁酰胺衍生產(chǎn)生的衍生物是優(yōu)選的。
此外，這種化學(xué)發(fā)光體系適合同種和異種測定，包括競爭性和多層免疫測定。如上所述當(dāng)信號溶液含有EDTA、DMSO、D(-)果糖、至少一種氧化劑、2-甲基-2-丙醇和含水的四硼酸鈉時，該體系的靈敏度特別高。另外，分析物可以是核酸、抗原、抗體、半抗原、半抗原共軛物、大分子、蛋白或聚合物。同種測定將包括使用標(biāo)記發(fā)光的抑制劑如聚離子。聚陽離子如聚(4-乙烯基吡啶鎓重鉻酸鹽)可抑制例如未結(jié)合的次卟啉IX二鹽酸鹽(DPIX)所標(biāo)記的化合物，而聚陽離子如聚(乙烯基烷基)將抑制未結(jié)合的帶正電荷的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶所標(biāo)記的化合物。在測定的情況下未結(jié)合意指如果化合物例如是抗原-標(biāo)記共軛物，那么就不結(jié)合到例如抗體上或者如果化合物是抗體-標(biāo)記共軛物，則就不結(jié)合到抗原，以此類推。
本發(fā)明還針對在化學(xué)發(fā)光異種測定中使用10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶檢測樣品中二元分析物的存在方法。適于檢測的合適分析物是核酸、抗體、抗原、半抗原、半抗原共軛物、大分子、聚合物或蛋白。另外，該方法可以是化學(xué)測定法、核苷酸測定法或配位體結(jié)合測定法如免疫測定法。該法還可以是所有這些測定法中的任何組合。本發(fā)明還涉及10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)簽結(jié)合到第一分析物或結(jié)合到該分析物的結(jié)合配體或結(jié)合到該分析物結(jié)合配體的配位體以及將不同的標(biāo)簽或標(biāo)記如非金屬四吡咯發(fā)光分子或能引起化學(xué)發(fā)光的分子如酶結(jié)合到第二分析物或第二分析物的結(jié)合配體或第二分析物結(jié)合配體的配位體。分析物可以是聚核苷酸鏈、化學(xué)活性化合物質(zhì)如二氫卟酚e或免疫活性化合物如抗體、抗原、半抗原、半抗原共軛物、大分子、蛋白或聚合物。
一般來說，在二元多層型免疫測定中，在第一分析物上的位點的結(jié)合配體接合到固相如玻璃、聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯上，因而，使該涂覆過的固相與樣品和該分析物上第二位點的第二結(jié)合配體相接觸。第二結(jié)合配體與標(biāo)記(例如10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶衍生物)結(jié)合。對于第二分析物來說存在著同樣情況只是標(biāo)記和結(jié)合配體當(dāng)然不同。洗滌固相并使結(jié)合的共軛物暴露在合適的一種或多種信號溶液中。一般來說，在競爭性測定中，固相是被涂上有限濃度的對所關(guān)心的各分析物是特異性的結(jié)合配體。然后使該固相與樣品和具有可測量的結(jié)合到10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶的第一分析物和可測量的結(jié)合到其它發(fā)光標(biāo)記的第二分析物相接觸。接觸后，洗滌固相以除去任何未結(jié)合的共軛物。在多層型或競爭性兩種測定情況下，洗過的固相可分開處理，首先只使用兩種標(biāo)記中的一種特異性信號溶液，其中標(biāo)記和溶液反應(yīng)以引起發(fā)射光，有關(guān)該特異性標(biāo)記的分析物量可用測量發(fā)射出的光而確定的，然后使固相分開與另外的化學(xué)發(fā)光信號溶液接觸，該信號溶液對有關(guān)另一個分析物的第二標(biāo)記或標(biāo)簽是特異性的，從而該標(biāo)記和信號溶液反應(yīng)也會產(chǎn)生發(fā)射光。再測量，從第二反應(yīng)發(fā)出的光，就決定樣品中所存在的第二分析物的量。
因為作為兩種不同標(biāo)記的結(jié)果所產(chǎn)生的光具有不同的性質(zhì)(即通過各標(biāo)記放出的光，波長可以不同或在兩種標(biāo)記間每秒鐘反應(yīng)產(chǎn)生的實際光量不同)，所以不可能用一種信號溶液去處理洗過的固相，該信號溶液通過兩共軛物同時產(chǎn)生光，微分運算產(chǎn)生的光并測量光以確定樣品中每個分析物的量。人們能夠利用時間解析的發(fā)光分析如在熒光計中所用的進行微分運算作為兩種不同的標(biāo)記結(jié)果發(fā)出的光(lovgren，T.and K.Pettersson，luminescenceImmunoassay and Molecular Applications，Van Dyke，K.and R.Van Dyke eds.，CRC Ress，Boca Raton，Ann Arbor，Boston，MA，pp.233-254(1990))。
也可利用發(fā)射性能方面的差異如波長(Kleinerman，M.等，Luminescenceof Organic and Inorganic Materials，Kallmann，H.P.和G.M.Sprush eds.，International Conference，New York University Washington Square，Sponsored byAir Force Aeronautical Research Laboratory，Army Research Office，CurhamOffice of Naval Research，N.Y.U.，pp.197-225(1961))。
對于使用雙吖啶衍生物的二元分析物測定的優(yōu)選發(fā)光標(biāo)記是一種吖啶衍生物，如二甲基吖啶鎓酯或者非金屬四吡咯，然而一些其它的以上討論過的發(fā)光標(biāo)記也是合適的。優(yōu)選非金屬四吡咯是DPIX。對于通過DPIX標(biāo)記引起發(fā)射光的優(yōu)選信號溶液包括在pH約10.0-約14.0下，反，反-5-(4-硝基苯基)-2，4-戊二醛(Pentadienal)、二-2-乙基己基磺基丁二酸鈉、發(fā)光反應(yīng)劑魯米諾、葡萄糖、芐基三甲基氫氧化銨、氫過氧化枯烯、仲高碘酸三鈉、過氧化鉀和EDTA。最適于使結(jié)合的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶閃光的信號溶液包括在約10.0-約14.0pH下的0.02M硼砂、EDTA、DMSO、D(-)果糖、過氧化鉀、2-甲基-2-丙醇和含水的四硼酸鈉。假若分析物共軛物中之一是酶標(biāo)記的分析物共軛物，則對該酶的底物可包含在信號溶液中。
另外，本發(fā)明針對用于樣品中檢測二元分析物的化學(xué)發(fā)光同種測定。在競爭性測定中，固相被涂上對每種不同分析物是特異性的結(jié)合配體。在四吡咯用作一種標(biāo)記的場合下，固相可另外涂上發(fā)光反應(yīng)劑。然后將這樣涂覆過的固相接觸樣品，已結(jié)合到10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記的已知量的一種分析物、已結(jié)合到不是雙吖啶的發(fā)光標(biāo)記的、已知量的另一種分析物和聚離子(如聚N-乙基-4-乙烯基吡啶 溴化物、重鉻酸聚-4-乙烯基嘧啶鎓(pyrimidinium)、聚氯乙烯、聚(乙烯醇)、或聚(乙烯芐基氯))，它能通過阻止克服未結(jié)合共軛物的發(fā)光標(biāo)記的氧化勢而抑制未結(jié)合的雙吖啶發(fā)光標(biāo)記共軛物如抗-TSH-10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶(Vlasenko，S.B.等，J.Biolum.Chemilum.4164-176(1989))。在必須抑制未結(jié)合發(fā)光標(biāo)記的抗體共軛物如DPIX抗體共軛物的測定中，可使用聚陽離子。接觸后，固相再用一種信號溶液處理，這種信號溶液既能通過兩共軛物同時產(chǎn)生發(fā)射光，也能分別使固相與一種對標(biāo)記有特異性的信號溶液接觸并測量發(fā)射光，然后再單獨使固相與對借助于另外共軛物的標(biāo)記而發(fā)射光是特異性的一種信號溶液接觸。
本發(fā)明另外還針對一種化學(xué)發(fā)光信號溶液，該溶液包含在約10.0-約14.0的pH下約150mM-約450mM過氧化鉀的水溶液，優(yōu)選在緩沖溶液中有300mM。優(yōu)選緩沖劑是四硼酸鈉但另外的溶液如氨基丁三醇(trizma)堿和硼酸也能起良好的作用。與這種信號溶液一起的優(yōu)選用作標(biāo)記的發(fā)光分子是吖啶和10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶衍生物。然而當(dāng)與K2O信號溶液一起使用時單一的異魯米諾和次卟啉IX·2HCl與發(fā)光反應(yīng)劑魯米諾也是合適的標(biāo)記。當(dāng)緩沖過的信號溶液中的K2O與發(fā)光分子如10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶或其衍生物或發(fā)光標(biāo)記共軛物如雌甾二醇17B-10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶或抗-TSH-10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶起反應(yīng)時，則在1ng/ml標(biāo)記濃度下可產(chǎn)生至少0.1秒的噪聲光子發(fā)射比至少為20∶1的信號。根據(jù)標(biāo)記而定，使用這種信號溶液和多種雙吖啶標(biāo)記的共軛物在1ng/ml標(biāo)記濃度下信號比可為50∶1、100∶1或200∶1以及更大。發(fā)射也可控制直到持續(xù)多達6秒鐘或更長。
本發(fā)明還進一步針對一種發(fā)光信號溶液，該溶液包含在約10.0-約14.0的pH下，含有0.02M硼砂水溶液、EDTA、DMSO、D(-)果糖，過氧化鉀、和2-甲基-2-丙醇。該信號溶液可觸發(fā)10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶衍生物共軛物化學(xué)發(fā)光，使光輸出大大增加并使用上面已知信號溶液所得的輸出改變光輸出動力學(xué)。當(dāng)這種溶液與發(fā)光標(biāo)記或發(fā)光標(biāo)記共軛物如10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶-抗體或抗-TSH-10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶反應(yīng)時，在1ng/ml的標(biāo)記濃度下可產(chǎn)生噪聲光子發(fā)射比為500∶1的信號持續(xù)至少0.1秒(見圖3)。另外，根據(jù)溶液和特定標(biāo)記共軛物的變化，在1ng/ml的標(biāo)記濃度下信號比可以是50∶1、100∶1甚至700∶1和更高。也可把發(fā)射控制到持續(xù)多達6秒鐘或更長。
另外，本發(fā)明針對一種信號溶液，該溶液包含在約10.0-約14.0pH下，在硼砂水溶液中，有EDTA、DMSO、D(-)果糖、過氧化鉀和2-甲基-2-丙醇。優(yōu)選的用該信號溶液的本發(fā)明的所有方面中，就成分、成分加入順序以及成分濃度而言，該信號溶液是按實施例2所說明的程序制備的。然而，成分也可以按另一種順序加入并且其它也合適的濃度可以是-硼砂0.005-0.05M的緩沖水溶液-EDTA0.002-02mM-DMSO0-8μl/ml的上述硼砂緩沖溶液-D(-)果糖，2-mg/ml的緩沖溶液-過氧化鉀210-365mM-2-甲基-2-丙醇0.05-0.25ml/ml的緩沖溶液當(dāng)這種溶液與發(fā)光標(biāo)記如10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶起反應(yīng)時，發(fā)光反應(yīng)劑在1ng/ml的發(fā)光標(biāo)記下，可產(chǎn)生噪聲光子發(fā)射比至少為300∶1的信號。另外，根據(jù)標(biāo)記，在1ng/ml的標(biāo)記濃度下，信號比可以是50∶1、100∶1、200∶1等等。發(fā)射也可控制持續(xù)多達6秒鐘或更長。
實施例110，10′-取代的-9，9′-雙吖啶衍生物的合成合成衍生的發(fā)光雙吖啶分子的這條途徑包括按上面Acheson和Orgel所述通過二苯基胺-2-羧酸和N-苯甲酰基-二苯基胺-2-羧酸的環(huán)化而合成吖啶酮。(所有的化學(xué)品和溶劑都是由Sigma/Aldrich，st.Louis，U.S.A和Pacific Pac公司，Hollister，CA獲得的)。吖啶酮也可從Sigma/Aldrich購買。
除了制備吖啶酮以外，可以合成取代分子的甲基脂以便在吖啶酮的10-碳原子上共價結(jié)合。本文用于雙吖啶分子衍生用的取代基分子是一種具有一官能團的分子，該官能團能使雙吖啶進一步衍生或使雙吖啶連結(jié)到另外分子如抗原、抗體等。通常本發(fā)明過程中所用的取代基分子的分子量約10,000或10000以下。在本實施例中，進行了取代基分子α-溴-對-甲苯甲酸的甲基酯化。在分子的一端具有良好的離去基團(一個或多個)(如鹵原子(一個或多個))而在該分子的另一處有官能團(一個或多個)的其它分子，該分子也可作為取代基分子并且能成功地酯化。這種類型的另外取代基分子的優(yōu)良實例是碘乙酸。使取代基分子在10％的三氟化硼的甲醇溶液中反應(yīng)(每克取代基分子優(yōu)選加入25ml的三氟化硼-甲醇)而完成酯化。反應(yīng)可在室溫下持續(xù)至少10小時并在分液漏斗中用二氯甲烷萃取甲酯。萃取液用H2O洗兩次，用0.1M碳酸氫鈉洗一次再用H2O洗兩次。在rotavapor RE120旋轉(zhuǎn)式汽化器上于60℃使體積減少至干。甲酯合成的另一方法是用醚接著加入重氮甲烷再使用含5％濃硫酸的甲醇處理。
合成中的下一個步驟是吖啶酮的烷基化。為完成這一點，往100ml的無水四氫呋喃(THF)中加5.4mM吖啶酮和6.5mM氫化鈉。再使該混合物于70℃下氬氣中攪拌回流2小時。往該混合物中加5.5mM的取代基甲酯(例如α-溴-對-甲苯甲酸甲酯)再使混合物在70℃下攪拌回流10-13小時。在用2％甲醇的二氯甲烷溶液進行硅膠薄層色譜(Baker化學(xué)公司，Phillipsburg，PA)發(fā)現(xiàn)Rf＝0.2的斑點表示水解的吖啶酮-10-取代基；Rf＝0.4的第二斑點表示未反應(yīng)的吖啶酮；Rf＝0.5的第三斑點(非常小)是未知副產(chǎn)物；Rf＝0.6的第四斑點是吖啶酮-10-取代基甲酯(吖啶酮-10-對-甲苯甲酸甲酯)；Rf＝0.9的第五斑點是未反應(yīng)的取代基甲酯。反應(yīng)混合物是呈含沉淀物的淡檸檬黃-棕色，沉淀物(含有基本上水解的吖啶酮-10-取代基)過濾掉后棄去。濾液用乙酸乙酯和水在分液漏斗中萃取以除去剩余的鹽和水解的物質(zhì)。雜質(zhì)留在水相中。有機相(乙酸乙酯相)的體積用旋轉(zhuǎn)汽化器于60℃下減少至干。然后加入二氯甲烷，未反應(yīng)的(不溶解)吖啶酮沉淀物過濾掉。再把二氯甲烷萃取液在二氧化硅-40柱上用3％乙酸乙酯的二氯甲烷溶液洗脫并純化。吖啶酮-10-對-甲苯甲酸甲酯經(jīng)洗脫后含在第一黃色譜帶內(nèi)。用甲醇代替乙酸乙酯-二氯甲烷洗脫液再次使這物質(zhì)用旋轉(zhuǎn)汽化器濃縮(經(jīng)該旋轉(zhuǎn)汽化器上部的連續(xù)的加料管)。純化過的吖啶酮-10-取代基甲酯沉淀成為淡黃色結(jié)晶物質(zhì)。該沉淀物過濾后用甲醇洗(產(chǎn)率約50％)。這些分子及其酸前體是具有(例如)吖啶酮-10-對-甲苯甲酸及其NHS衍生物的活性熒光團，在403nm下激發(fā)，并在440nm下發(fā)射；而吖啶酮-10-乙酸及其NHS衍生物，在398nm下激發(fā)，并在438nm下發(fā)射。
吖啶酮-10-取代的中間體(例如吖啶酮-10-乙酸)通過把8.45g的2-氯苯甲酸、7.80g N-苯基甘氨酸、11.00g無水碳酸鉀和0.30g Cu++粉劑在6ml H2O中充分混合而可直接進行合成。然后使該混合物置于160℃下的油浴上回流過夜。緩慢地加入乙醇再把產(chǎn)物溶解于水中，過濾后用HCl沉淀。把整個的混合物再次過濾以便除去未消耗掉的2-氯苯甲酸然后使留在那種濾液中的油狀體結(jié)晶。使濾液溶于NaOH中，過濾，加乙酸后再次過濾混合物以便進一步除去未反應(yīng)的2-氯苯甲酸。產(chǎn)物通過加入HCl而沉淀(酸性產(chǎn)物)再干燥。然后用過量的苯萃取并通過溶解在乙酸鈉溶液中并在活性炭下煮沸，用HCl再次沉淀而進行一步地純化。純化產(chǎn)物經(jīng)再次過濾并由稀甲醇中結(jié)晶而得到白色沉淀物(熔點165-167℃)。
也可以合成吖啶酮-10-取代的分子(例如吖啶酮-10-乙酸)，通過將500mg(2.7mM)吖啶酮、礦物油中的130mg 80％NaH和50ml無水THF的混合物在氬氣下回流2-4小時。然后加入碘乙酸(540mg，2.7mM)并將混合物在氬氣下再繼續(xù)回流10小時。過濾沉淀物再使濾液在反相柱在20-30％的乙醇洗脫條件下加以純化。然后使這種純化物料干燥并溶解于THF中，用4N NaOH水解10小時。加水后過濾混合物。濾器用水洗滌，再用1N HCl使混合物的pH達到8.0。最終的純化是在用10-30％甲醇水溶液的反相硅膠柱上進行的，在旋轉(zhuǎn)汽化器(例如RE 120)上使體積減小并用1N HCl于pH2.5下進行再沉淀過夜。通過離心收集產(chǎn)物再用水洗一次。于凍干器上干燥(產(chǎn)率接近40％)。
通過吖啶酮-10-取代基甲酯與三氯氧化磷(POCl3)反應(yīng)而進行吖啶酮-10-對-甲苯甲酸甲酯向季銨化的9-氯-吖啶-10-對-甲苯甲酸甲酯的轉(zhuǎn)化。在每一50mg純化甲酯中加入1ml的POCl3然后使該混合物在120℃的油浴上回流1小時。
通過加入1g冷鋅金屬和10ml冷凍的冷的濃HCl/100mg的9-氯-吖啶-10-對-甲苯甲酸甲酯，可以在冷凍條件下反應(yīng)1-10小時，而進行9-氯-吖啶-10-對-甲苯甲酸甲酯的二聚化和脫酯化。這一反應(yīng)是劇烈的，并必須在冷凍條件下進行1-10小時。然后把沉淀過濾掉再用水洗。酸性濾液的純化是在硅膠C-18的反相柱上完成的。該柱先用甲醇預(yù)處理接著用0.1N硝酸再用0.01M的磷酸鹽緩沖劑處理。濾液的洗脫首先用0.01M磷酸鹽緩沖液中的甲醇來進行以除去副產(chǎn)物、未反應(yīng)的物料和鹽。附著在柱頂端的產(chǎn)物，(10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶鹽，一種雙取代的雙吖啶)，再用30-90％甲醇的0.1N硝酸液洗脫(甲醇的濃度可從30％提高到90％以除去所有的產(chǎn)物)。用約50％甲醇的0.1N硝酸液洗脫的產(chǎn)物是黃色譜帶。然后將質(zhì)子化純化的二聚物-二硝酸鹽(10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶二硝酸鹽)在60℃下在旋轉(zhuǎn)汽化器使之濃縮至很小體積(5ml)再凍干至干。用Perkin-Elmer 552分光光度計的掃描分光光度測定法揭示其特征性吸光度，在460nm處有一初始肩狀峰，435nm處是第一峰，415nm處是第二個肩狀峰，370nm處是主峰，而在355nm處是肩狀拖尾峰(見圖2)。用Bruker ARX 400儀器(Rheinstetten-FO，德國)的NMR曲線可在3.9ppm處產(chǎn)生一個峰，它表明有連結(jié)到二聚體10位氮上的亞甲基碳和在7-9ppm間有多個芳族碳峰。
二聚物和N-羥基丁二酰胺(NHS)通過加入(在攪拌下)211微摩爾(μM)的二環(huán)己基碳化二亞胺于無水二甲基甲酰胺(DMF)中的141μM的二聚物中(0.5ml/mg的二聚物)而進行衍生化。往該混合物中加211μM的可以在室溫下反應(yīng)10小時的N-羥基丁二酰胺。把在該反應(yīng)過程中形成的脲沉淀物過濾掉。這種標(biāo)記的NHS-酯在琥珀色小瓶內(nèi)是非常穩(wěn)定的(至少一年)。在反相TLC上主峰在用0.01M磷酸鹽緩沖液中的90％甲醇洗脫時不移動(在長波長的紫外光下起點處有一黃色斑)，但用0.1硝酸/70％甲醇(v/v)時，移動Rf＝0.2。
10，10′-對-甲苯酰-NHS-9，9′-雙吖啶二硝酸鹽衍生物與抗體的接合始于把100μl的衍生物DMF溶液加到在pH 7.4PBS中的1mg抗體中。在本實施例中多克隆抗體結(jié)合到刺激甲狀腺激素的β-鏈上，然而，任何抗體、分析物、聚合物或結(jié)合蛋白都可使用。這種混合物可以在室溫下反應(yīng)10小時然后往抗體-衍生物混合物中加入54μl的1mg/ml的d-L-賴氨酸并使其再反應(yīng)3小時。這一步驟對于充滿在發(fā)光衍生物-抗體共軛物上的未反應(yīng)NHS位點是必須的。
該抗體-10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶共軛物是在20cm Biogel P-10柱(BioRad；Hercules，CA)上用pH 7.4的含10mM二元磷酸鉀和0.1M NaCl的緩沖液洗脫而進行純化的。抗體共軛物是在柱的第一餾份中洗脫它可用TLC和分光光度測定法監(jiān)測?？贵w共軛物有兩個分光光度峰，在365nm(標(biāo)記的小峰)和抗體的275nm峰并且用實施例2描述的本發(fā)明信號溶液下能成功地閃爍，導(dǎo)致非常迅速的光發(fā)射動力學(xué)(見圖4)。
弱酸性環(huán)境(0.01N HNO3)能穩(wěn)定標(biāo)記并能對噪聲比給出最強的信號。含0.2μl吐溫-20/ml PSS的洗滌液用HNO3調(diào)到0.01N在必須分離的測定中產(chǎn)生良好的影響。在剛要閃爍前使標(biāo)記暴露于5μl的終洗液中也可增強信號。
實施例2信號溶液的制備用于由新型發(fā)光分子產(chǎn)生光的信號溶液配制如下攪拌下在每100ml 0.02M四硼酸鈉中加入下列物質(zhì)a)0.744mg(0.02mM)亞乙基二胺四乙酸(EDTA)b)100μl二甲基亞砜(DMSO)c)400mg(0.02M)D(-)果糖d)1996mg(280mM)過氧化鉀(KO2)e)17ml2-甲基-2-丙醇實施例3對比10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽和雙一N-甲基吖啶鎓二硝酸鹽(光澤精)的測定如圖1所示，本例是對由單獨信號溶液(條1)、蒸餾水中的1.9nM(毫微摩爾)濃度的光澤精(條2)、和蒸餾水中的1.3nM濃度的10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶二硝酸鹽(條3)獲得的信號進行對比。信號溶液按照實施例2制備。該測定用的條件是在一式三份的12×75mm聚苯乙烯管(VWRScientific公司，Philadelphia，PA)中的5μl水中加入300μl信號溶液，以得到零信號。每個發(fā)光分子的信號是通過在Berthold Lumat中用300μl信號溶液稀釋5μl的標(biāo)記閃爍三份而獲得的。
實施例4在提高抗體-TSH-10，10′-對-甲苯酰-9，9′-雙吖啶共軛物稀釋度條件下驗證信號線性的測定如圖3所示，本例驗證抗體共軛物的發(fā)光功能度和信號與提高稀釋度的線性關(guān)系。抗體-TSH-10，10′-對-甲苯酰-9，9′-雙吖啶共軛物由10- 9g/ml稀釋到1018g/ml并且用200μl信號試劑使每份5μl稀釋液一式三份在Berthold Lumat中閃爍并記錄信號的量值。結(jié)果如下10-9g/ml-12,000,000計數(shù)/秒；10-12g/ml-570,000計數(shù)/秒；1013g/ml-37,119計數(shù)/秒；10-14g/ml-3,510計數(shù)/秒；10-15g/ml-556計數(shù)/秒；10-16g/ml-304計數(shù)/秒；10-17g/ml-240計數(shù)/秒；1018g/ml-229計數(shù)/秒；0.0g/ml-102計數(shù)/秒。
本說明書中提到的所有出版物和專利申請都作為參考引入本文，與每份單獨出版物或?qū)＠暾執(zhí)貏e地和個別地予以指明的是同樣作為參考引入。
現(xiàn)在本發(fā)明已充分描述，很明顯對本技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員來說在沒有偏離所附權(quán)利要求的精神或范圍下可以對本發(fā)明進行許多變化和改進。
權(quán)利要求
1.一種組合物，它含有結(jié)合到抗原、抗體或半抗原的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶(biacridine)。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶是一種10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶、10，10′-對-甲苯酰-9，9′-雙吖啶、10，10′-乙酰-9，9′-雙吖啶或10，10′-乙酸-9，9′-雙吖啶。
3.一種組合物，它含有10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶鎓(biacridinium)二硝酸鹽。
4.一種組合物，它含有10，10′-乙酸-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽。
5.一種用于發(fā)射對化學(xué)測定、免疫測定、配位體結(jié)合測定或核苷酸測定有用的可測量光的化學(xué)發(fā)光體系，所述體系包括在pH約10.0-約14.0下，具有氧化勢的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物，具有能克服10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物的氧化勢的一種氧化劑或氧化劑組合物的信號溶液，所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物是結(jié)合到分析物、或分析物的結(jié)合配體或分析物結(jié)合配體的配位體。
6.權(quán)利要求5的化學(xué)發(fā)光體系，其中所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物是10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶或10，10′-乙酸-9，9′-雙吖啶。
7.權(quán)利要求5的化學(xué)發(fā)光體系，還含有緩沖溶液、螯合劑、亞砜、還原糖、和醇。
8.具有氧化劑組合物的權(quán)利要求7的化學(xué)發(fā)光體系，其中，10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物是一種10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶或10，10′-乙酸-9，9′-雙吖啶，緩沖溶液是四硼酸鈉水溶液，螯合劑是EDTA、亞砜是DMSO，還原糖是D(-)果糖和醇是2-甲基-2-丙醇。
9.權(quán)利要求5的化學(xué)發(fā)光體系，其中，所述分析物是核酸、抗原、抗體、半抗原、半抗原共軛物、大分子、蛋白或聚合物。
10.權(quán)利要求5的化學(xué)發(fā)光體系，其中，所述結(jié)合配體是核苷酸探針、抗原、抗體、半抗原、半抗原共軛物、大分子、蛋白或聚合物。
11.權(quán)利要求5的化學(xué)發(fā)光體系，其中，所述配位體是抗原、抗體、半抗原、半抗原共軛物、大分子、蛋白或聚合物。
12.權(quán)利要求6的化學(xué)發(fā)光體系，其中，所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光衍生物通過生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物素蛋白橋而結(jié)合到分析物、分析物的結(jié)合配體或分析物結(jié)合配體的配位體上。
13.用于發(fā)射在化學(xué)測定、配位體結(jié)合測定或核酸測定中有用的可測量光的化學(xué)發(fā)光體系包括結(jié)合到分析物或分析物的結(jié)合配體或分析物結(jié)合配體的配位體的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記，和一種信號溶液，該溶液含有在約10.0-約14.0pH下的氧化劑過氧化鉀或包括四氧化鋨和過氧化鉀的氧化劑組合物。
14.權(quán)利要求13的化學(xué)發(fā)光體系，其中所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記是10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽、10，10′-對-甲苯酰-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽、10，10′-乙酰-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽或10，10′-乙酸-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽。
15.權(quán)利要求13的化學(xué)發(fā)光體系，其中所述信號溶液包含氧化劑組合物并還包含緩沖溶液、螯合劑、亞砜、還原糖、和醇。
16.權(quán)利要求13的化學(xué)發(fā)光體系，其中所述緩沖溶液是含水的四硼酸鈉，螯合劑是EDTA、亞砜是DMSO，還原糖是D(-)果糖并且該體積還包含醇2-甲基-2-丙醇。
17.權(quán)利要求13的化學(xué)發(fā)光體系，其中所述雙吖啶標(biāo)記是通過生物素-抗生物素蛋白或生物素-鏈霉抗生物素蛋白橋結(jié)合到分析物、分析物的結(jié)合配體或分析物結(jié)合配體的配位體上的。
18.一種在化學(xué)發(fā)光同種試樣中使用10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶以檢測樣品中分析物的存在或測定其量的方法，該法包括(a)提供一種涂有對所述被分析物是特異性的結(jié)合配體的固相；(b)使所述固相與所述樣品和預(yù)定量的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶分析物共軛物以及預(yù)定量的能阻止未結(jié)合的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶-分析物共軛物引起發(fā)光的聚陰離子接觸，所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶具有氧化勢，至少一些所述結(jié)合配體與至少一些所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶-分析物共軛物相結(jié)合；(c)使來自(b)的固相與信號溶液接觸，該信號溶液在pH約10.0-約14.0下，含有能克服10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶在結(jié)合的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶-分析物共軛物中的氧化勢的一種氧化劑或氧化劑組合物進行發(fā)射光；和(d)測量在(c)中所發(fā)射的光量，其中所述發(fā)射光的量與所述樣品中存在的分析物量成正比。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶是10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶衍生物或10，10′-乙酸-9，9′-雙吖啶衍生物。
20.權(quán)利要求18的方法，其中信號溶液還包含緩沖劑水溶液、螯合劑、亞砜、還原糖和醇。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述信號溶液包含氧化劑四氧化鋨和過氧化鉀并且還包含含水的四硼酸鈉、EDTA、DMSO、D(-)果糖和2-甲基-2-丙醇。
22.一種在化學(xué)發(fā)光的異種測定中使用10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶以檢測樣品中第一和第二分析物的存在的方法，該法包括(a)提供一種涂有第一特異性結(jié)合配體和第二特異性結(jié)合配體的固相，所述第一結(jié)合配體對所述第一分析物是特異性的而所述第二結(jié)合配體對所述第二分析物是特異性的；(b)使所述固相與所述樣品和與非-雙吖啶標(biāo)記-第一分析物共軛物和10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記-第二分析物共軛物接觸，至少一些所述第一分析物共軛物結(jié)合到至少一些所述第一結(jié)合配體和至少一些所述第二分析物共軛物結(jié)合到至少一些所述第二結(jié)合配體上；(c)通過洗滌所述接觸的固相而把未結(jié)合的共軛物從結(jié)合的共軛物中分離出來；(d)使(c)中所述洗滌過的固相通過化學(xué)反應(yīng)或與對所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶是特異性的信號溶液或與對所述非雙吖啶標(biāo)記是特異性的信號溶液接觸以產(chǎn)生光；(e)檢測或測量從(d)中所述反應(yīng)中產(chǎn)生的所述光；(f)使來自(d)的固相與對所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記是特異性的信號溶液接觸，只要(d)中的信號溶液對所述非雙吖啶標(biāo)記是特異性的溶液，或與對所述非雙吖啶標(biāo)記是特異性的信號溶液接觸，只要(d)中的溶液是對所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記是特異性的溶液，以便通過化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光；(g)檢測或測量由(f)中的所述反應(yīng)發(fā)出的所述光；和(h)由步驟(e)和(g)中所檢測或測量的光而檢測所述第一和所述第二分析物和確定所述第一或所述第二分析物的量。
23.權(quán)利要求22的方法，其中，所述10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶標(biāo)記是10，10′-對-甲苯甲酸-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽、10，10′-對-甲苯酰-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽、10，10′-乙酰-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽或10，10′-乙酸-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽。
24.權(quán)利要求22的方法，其中，非雙吖啶標(biāo)記是次卟啉IX·2HCl。
25.權(quán)利要求24的方法，其中，來自(c)的洗滌固相在步驟(f)中與對次卟啉IX·2HCl是特異性的所述信號溶液接觸，所述信號溶液在約10.0-約14.0pH下，包括反，反-5-(4-硝基苯基)-2，4-戊二醛、二-2-乙基己基磺基丁二酸鈉、魯米諾或異魯米諾、葡萄糖、芐基三甲基銨氫氧化物、氫過氧化枯烯、仲高碘酸三鈉、和EDTA。
26.權(quán)利要求23的方法，其中，來自(c)的洗滌固相在步驟(f)中與對10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶是特異性的所述信號溶液接觸，所述溶液包括四硼酸鈉水溶液、EDTA、DMSO、D(-)果糖、K2O和2-甲基-2-丙醇。
27.一種化學(xué)發(fā)光信號溶液，它在約10.0-約14.0pH下包含緩沖水溶液、螯合劑、亞砜、還原糖、一種或多種氧化劑和醇。
28.權(quán)利要求27的化學(xué)發(fā)光信號溶液，它還包含四氧化鋨。
29.權(quán)利要求27的化學(xué)發(fā)光溶液，它包含氧化劑四氧化鋨和過氧化鉀、含水的四硼酸鈉、EDTA、DMSO、D(-)果糖和2-甲基-2-丙醇。
30.用于測定流體樣品中未知量生物活性分析物的存在或測量其濃度的配位體結(jié)合測量方法中，這種存在或濃度是通過使用標(biāo)記和信號溶液而確定的，以產(chǎn)生可檢測或可測量的反應(yīng)產(chǎn)物，其改進包括使用10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶作標(biāo)記和一種在四硼酸鈉水溶液中的EDTA、DMSO、D(-)果糖、KO2和2-甲基-2-丙醇混合物作信號溶液。
31.用于經(jīng)化學(xué)發(fā)光多層測定法而檢測樣品中分析物的存在或其量的方法中，采用了信號溶液和發(fā)光分子標(biāo)記的化合物，該化合物結(jié)合到所述分析物或所述分析物的結(jié)合配體或所述被分析物結(jié)合配體的配位體上，其改進包括使用10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶-標(biāo)記化合物作為所述發(fā)光分子標(biāo)記的化合物，能阻止未結(jié)合雙吖啶標(biāo)記的化合物中的雙吖啶引起發(fā)光的預(yù)定量聚陰離子，以及作為所述信號溶液的一種溶液，該溶液包括在約10.0-約14.0pH下，在四硼酸鈉水溶液中的EDTA、DMSO、D(-)果糖、過氧化鉀和2-甲基-2-丙醇。
32.一種用于產(chǎn)生可測量光的化學(xué)發(fā)光體系，它通過至少兩種不同的分子產(chǎn)生并用于化學(xué)測定、配位體結(jié)合測定、免疫測定或核苷酸測定以檢測樣品中一種以上分析物，該體系包括在約10.0-約14.0pH下，結(jié)合到第一分析物或所述第一分析物的結(jié)合配體或所述第一分析物結(jié)合配體的配位體的次卟啉IX·2HCl，結(jié)合到第二分析物或所述第二分析物的結(jié)合配體或所述第二分析物結(jié)合配體的配位體的10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶發(fā)光標(biāo)記，含有反，反-5-(4-硝基苯基)-2，4-戊二醛、二-2-乙基己基磺基丁二酸鈉、魯米諾、葡萄糖、芐基三甲基銨氫氧化物、氫過氧化枯烯、仲高碘酸三鈉、過氧化鉀以及亞乙基二胺四乙酸的混合物的第一信號溶液和包含在四硼酸鈉水溶液中的EDTA、DMSO、D(-)果糖、KO2和2-甲基-2-丙醇的混合物的第二信號溶液。
33.權(quán)利要求32的發(fā)光體系，它還包含預(yù)定量的聚陽離子。
34.權(quán)利要求32的發(fā)光體系，它還包含預(yù)定量的聚陰離子。
35.一種制備10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶衍生物的方法包括(a)合成取代基分子的甲酯，所述取代基分子具有至少一個官能團；(b)通過吖啶酮、氫化鈉、無水四氫呋喃以及來自步驟(a)的甲酯化合而使吖啶酮烷基化以形成吖啶酮-10-取代基-甲酯；(c)使來自步驟(b)的所述吖啶酮-10-取代基-甲酯與三氯氧化磷反應(yīng)以形成季銨化的9-氯-吖啶-10-取代基-甲酯；(d)使來自步驟(c)的9-氯-吖啶-10-取代基-甲酯與鋅金屬和濃鹽酸反應(yīng)以形成季銨化的、脫酯的、二聚的、10，10′-取代基-9，9′-雙吖啶鹽；(e)使來自步驟(d)的雙吖啶鹽與硝酸反應(yīng)以形成10，10′-取代基-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽，和(f)通過使所述二聚體二硝酸鹽與碳化二亞胺和N-羥基丁二酰胺在二甲基甲酰胺中反應(yīng)而使來自步驟(e)的所述二聚體二硝酸鹽再衍生化以形成雙-NHS-10，10′-取代基-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽。
36.一種組合物，它包含雙-NHS-10，10′-對-甲苯酰-9，9′-雙吖啶鎓二硝酸鹽。
37.一種組合物，它包含雙-NHS-10，10′-乙酰-9，9′-雙吖啶二硝酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶分子及其衍生物的合成。這些分子已被證明在pH約10.0-約14.0的信號溶液的存在下通過化學(xué)發(fā)光可催化光的產(chǎn)生，在產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號有效的濃度下，它具有螯合劑、亞砜、還原糖、氧化劑或氧化劑組合物、醇以及四硼酸鈉水溶液。這些10，10′-取代的-9，9′-雙吖啶可單獨或接合到半抗原或大分子上使用并可在化學(xué)發(fā)光，同種或異種測定的制劑中作為標(biāo)記使用。它們還可與其它的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子結(jié)合使用以產(chǎn)生多種分析物的化學(xué)發(fā)光測定。
文檔編號G01N33/533GK1155931SQ95194681
公開日1997年7月30日 申請日期1995年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月24日
發(fā)明者喬治·W·卡特西羅米特斯 申請人:喬治·W·卡特西羅米特斯