專利名稱：多層分析元件的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及材料分析領(lǐng)域的改進(jìn)。具體而言，本發(fā)明涉及用于皮膚及其它固體材料中膽甾醇含量檢測的多層分析元件。
蘇聯(lián)(USSR)作者證書第1054784號介紹了一種類脂物薄層色譜法分析用分析元件，該元件含一種載體(如玻璃板)，板上附一層吸收材料，如硅膠，石膏，硫酸銨及乙酸銅的混合物。該類分析元件不適用人皮膚中膽甾醇檢測。
蘇聯(lián)(USSR)作者證書第1495378號介紹了一種雙層分析元件，該元件含一種載體(如聚乙烯膜)及含固定化氧化酶的明膠層。元件在有胺或水溶液與其中的明膠層相接觸時(shí)變色。該類分析元件也不適用人皮膚中膽甾醇檢測。
加拿大專利第1335968號介紹一種檢測膽甾醇的方法為，使皮膚或其它含膽甾醇表面與通式A-C-B的酶親和性化合物相接觸，其中A為對膽甾醇具親和性的檢測劑，B為可與生色劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物的酶性顯色劑，且C為將顯色劑和檢測劑連結(jié)在一起的膠粘劑。膽甾醇通過生色劑變色檢出。該法之不足在于，溶液及顯色后的反應(yīng)產(chǎn)物不夠穩(wěn)定，膽甾醇含量低時(shí)敏感度及可重復(fù)性極差。
鑒于上述已有分析元件及檢測方法存在不足，有必要結(jié)合現(xiàn)有膽甾醇液相檢測方法的優(yōu)點(diǎn)和帶固體載體多層分析元件在實(shí)用中的便利，開發(fā)新的分析元件。
美國專利第4895704號已提出一種多層分析元件，它含隔水、透光固體載體及一個(gè)親水層，后者至少含一種試劑可與待檢測樣某一組分反應(yīng)生成可經(jīng)光輻射檢出的物質(zhì)。該分析元件包括含光散射顆粒的附加層，含量足以保證光透射率介于10％～2.5％。這種已知的多層分析元件不宜用于皮膚中膽甾醇檢測，顯色反應(yīng)強(qiáng)度低，且待檢測物含量低時(shí)分析襯度高。
發(fā)明概要本發(fā)明旨在提高分析元件的敏感度、可重復(fù)性及顯色反應(yīng)強(qiáng)度，增加顯色時(shí)酶反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間，強(qiáng)化皮膚中膽甾醇含量分析手段，并且拓展其在膽甾醇即時(shí)診斷中的應(yīng)用范圍。
廣義而言，本發(fā)明提供含可與待測樣相互作用試劑、可定量檢測待測樣某一組分的多層分析元件。本發(fā)明多層分析元件包括一種載體和一層附著其上的親水層，后者由明膠，聚乙烯醇或上列的混合物組成且含用量占總重5％～30％的一種顯影劑及生色劑，顯影劑和生色劑重量比為1∶0.3～1∶3.0。顯影劑在所述試劑中的氧化劑作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，故此被氧化后的顯影劑與生色劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。
本發(fā)明多層分析元件用于膽甾醇檢測時(shí)，所用試劑為如前通式A-C-B定義的酶親和性化合物，其中酶顯色劑B為過氧化酶。此時(shí)，顯影劑在過氧化氫中的過氧化酶作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，故此顯影劑被氧化后與生色劑反應(yīng)生成標(biāo)示皮膚中膽甾醇含量的有色產(chǎn)物。優(yōu)選實(shí)施方案的說明所用顯影劑優(yōu)選下式的化合物
其中R，R′及R″可相同也可不同，且各自分別為氫原子，烷基或鏈烷醇基。這類化合物的例子包括N，N-二乙基對苯二胺，對乙基氨基-鄰甲苯胺，對-[N-乙基-N-(β-羥乙烯基)氨基]-苯胺，對-[N-乙基-N-(β-甲磺酰氨基乙基)氨基]-鄰甲苯胺，對-[N-乙基-N-(β-羥乙基)氨基]-鄰甲苯胺，以及對-[N-丁基-N-(γ-磺酰丙基)氨基]-苯胺。
二乙基對甲苯二胺，乙氧基乙基對苯二胺，乙基甲磺酰氨基乙基對甲苯二胺，乙氧基乙基對甲苯二胺，丁磺酰丙基對苯二胺，或二乙基對苯二胺也可用作顯影劑。
生色劑可采用吡唑酮-5，苯甲酰乙酸或萘酸的衍生物。舉例而言，適選生色劑包括1-(2，4，6-三氯苯基)-3-十五烷基-氨基苯基-氨基吡唑酮，3，5-二羧苯基十八烷基氨基-1-氧-2-萘酸，2-氯-5-[γ-(2，4-二-四胺苯氧基)-丁酰氨基)-苯胺-α-N-苯甲酰海因酰新戊酰乙酸，間-(N-乙基-N-十八烷基)-氨基-對苯甲酰乙酰胺苯磺酸，間羧基-間-{N-(對氯-間-(N-鄰十八烷基-羥基苯甲?；阴；?氨基)苯?；被?-羧酸，鄰苯氧基-間-(5-氧-1，2-吡唑啉-3-基)苯磺酸，2-甲基十八烷基氨基-5′-磺酰苯胺苯甲酰乙酸，2′-氯-5′-(3″，5″-二羧苯基磺氨基)-苯胺基-2-十八烷氧基苯甲酰乙酸，十八烷基氨基-1-氧-4-硫-2-萘酸，2′-甲基十八烷基氨基-5′-磺酰苯胺基-1，2-羥萘酸，以及1-(4′-苯氧基-3′-磺苯基)-3-甾基-氨基吡唑酮。
生色劑可以微囊、微?；蚍稚⒌姆肿泳鶆蚍植荚谟H水層中，這取決于生色劑的性質(zhì)。如欲使生色劑在親水層以微?；蚍肿討B(tài)分布，則采用具親水性(極性)支鏈的化合物。如欲使生色劑以微囊態(tài)分布，則采用具憎水性(非極性)支鏈的化合物。
載體優(yōu)選由聚對苯二甲酸乙二醇酯，聚乙烯或三硝基纖維素親水膜制得。無色聚合物，紙或聚乙烯包覆紙也可采用。
親水層也可含增濕和鞣制劑。增濕劑可保證載體上親水層以不變的均一厚度，優(yōu)選2-100微米涂敷。鞣制劑可保證多層分析元件所需的物理-力學(xué)性能。乙酸鉻及2，4-二氯-6-羥三唑-1，3，5的一鈉鹽可用作鞣制劑。
本發(fā)明多層分析元件可用于醫(yī)學(xué)和藥學(xué)，以及刑事領(lǐng)域。它不僅可用于膽甾醇檢測，也可用于檢測氯離子和葡萄糖，故便于囊纖維病、糖尿病以及高血脂癥的診斷。
下列非限制實(shí)施例進(jìn)一步說明。實(shí)施例1制得一個(gè)用于皮膚中膽甾醇檢測的多層分析元件，方法是，在厚50微米的對苯二甲酸膜載體上涂敷一層光成象明膠，膠中含75％(重量)親水性紫色生成劑，后者由1-(2，4，6-三氯苯基)-3-十五烷基-氨基苯基-氨基吡唑酮組成。該生色劑平均粒徑小于0.1微米。明膠層含7.5％(重量)的N，N-二乙基對苯二胺，后者系以分子水平分散的顯影劑。該層中也含乙酸鉻鞣制劑該多層分析元件分別用于患者手外皮及健康人皮膚外皮中膽甾醇的檢測。取如前式A-C-B(其中酶顯色劑B為過氧化酶)的酶親和化合物水溶液各一滴，涂于每一人的掌皮。經(jīng)1分鐘培養(yǎng)后，干燥或以棉球除去液體。在同一處，滴涂一滴過氧化氫，隨即即刻使多層分析元件緊貼并壓實(shí)于皮表面1分鐘。其后，在流水中沖洗分析元件15～20秒。將所得色跡與帶刻度的色標(biāo)對比，或以分光光度方法如LCD(液晶顯示)分光光度計(jì)測定色點(diǎn)的強(qiáng)度，則得檢測結(jié)果。
分別以現(xiàn)有液相法和本發(fā)明多層分析元件測定血液及皮膚中的膽甾醇含量，結(jié)果如表1所示。
表1測試組 已有方法測定 本發(fā)明測定血膽甾醇含量 皮膽甾醇含量 皮膽甾醇含量健康人(24人)185±25 1.9±0.30.13±0.04前鞏膜患者(29人)228±32 2.8±0.50.32±0.07對同一組患者依次進(jìn)行10次檢測，考察顯色反應(yīng)的可重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于8％。
多層分析元件分別隔一周和六個(gè)月，得同樣重復(fù)結(jié)果。
檢測時(shí)間需2～3分鐘，準(zhǔn)備時(shí)間約3分鐘。使用該多層分析元件，可制成配套儀器，供患者自檢。實(shí)施例2制得一個(gè)用于皮膚中膽甾醇檢測的多層分析元件，方法是，在白色聚乙烯包覆光成象紙載體上涂敷一層含藍(lán)色生色劑的聚乙烯醇，生色劑由3，5-二羧苯基十八烷基氨基-1-氧-萘酸組成。聚乙烯醇尚含對乙基氨基-鄰甲苯胺顯影劑。
該多層分析元件用于外皮中膽甾醇檢測，步驟同實(shí)施例1所述，得基本相同結(jié)果。實(shí)施例3制得一個(gè)柔性多層分析元件，方法是，在厚100微米、經(jīng)電暈放電等離子體親水處理的聚乙烯膜載體上涂敷一層明膠與聚乙烯醇的混合物，層中尚含親水性黃色生色劑分散物，也即2-氯-5-[γ-(2，4-二-四胺苯氧基)-丁酰氨基)-苯胺-α-N-苯甲?；Ｒ蝓；挛祯Ｒ宜?。明膠及聚乙烯醇層尚含對-[N-乙基-N-(β-羥乙烯基)氨基]-苯胺顯影劑。
該多層分析元件用于皮中膽甾醇檢測，步驟同實(shí)施例1所述，得基本相同結(jié)果。
權(quán)利要求
1含可與待測樣相互作用的試劑、可定量檢測待測樣某一組分的多層分析元件，該元件包括一種固體載體和一層附著其上的親水層，后者由明膠，聚乙烯醇或上列的混合物組成且含用量占總重5％～30％的一種顯影劑及生色劑，顯影劑和生色劑重量比為1∶0.3～1∶3.0，顯影劑在所述試劑中的氧化劑作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，由此被氧化后的顯影劑與生色劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。
2權(quán)利要求1的多層分析元件，其中，所述顯影劑為下式的化合物
其中R，R′及R″可相同也可不同，且各自分別為氫原子，烷基或鏈烷醇基。
3權(quán)利要求2的多層分析元件，其中，所述顯影劑為選自下列一組的一種化合物N，N-二乙基對苯二胺，對乙基氨基-鄰甲苯胺，對-[N-乙基-N-(β-羥乙烯基)氨基]-苯胺，對-[N-乙基-N-(β-甲磺酰氨基乙基)氨基]-鄰甲苯胺，對-[N-乙基-N-(β-羥乙基)氨基]-鄰甲苯胺，以及對-[N-丁基-N-(γ-磺酰丙基)氨基]-苯胺。
4權(quán)利要求1的多層分析元件，其中，所述顯影劑為選自下列一組的一種化合物二乙基對甲苯二胺，乙氧基乙基對苯二胺，乙基甲磺酰氨基乙基對甲苯二胺，乙氧基乙基對甲苯二胺，丁磺酰丙基對苯二胺，以及二乙基對苯二胺。
5權(quán)利要求1的多層分析元件，其中，所述生色劑為選自一組由吡唑酮-5、苯甲酰乙酸或萘酸的衍生物組成的化合物中的一種。
6權(quán)利要求5的多層分析元件，其中，所述生色劑為選自下列一組的一種化合物1-(2，4，6-三氯苯基)-3-十五烷基-氨基苯基-氨基吡唑酮，3，5-二羧苯基十八烷基氨基-1-氧-2-萘酸，2-氯-5-[γ-(2，4-二-四胺苯氧基)-丁酰氨基)-苯胺-α-N-苯甲酰海因酰新戊酰乙酸，間-(N-乙基-N-十八烷基)-氨基-對苯甲酰乙酰胺苯磺酸，間羧基-間-{N-(對氯-間-(N-鄰十八烷基-羥基苯甲?；阴；?氨基)苯?；被?-羧酸，鄰苯氧基-間-(5-氧-1，2-吡唑啉-3-基)苯磺酸，2-甲基十八烷基氨基-5′-磺酰苯胺苯甲酰乙酸，2′-氯-5′-(3″，5″-二羧苯基磺氨基)-苯胺基-2-十八烷氧基苯甲酰乙酸，十八烷基氨基-1-氧-4-硫-2-萘酸，2′-甲基十八烷基氨基-5′-磺酰苯胺基-1，2-羥萘酸，以及1-(4′-苯氧基-3′-磺苯基)-3-甾基-氨基吡唑酮。
7權(quán)利要求5的多層分析元件，其中，所述生色劑為粒徑小于0.1微米的憎水性化合物。
8權(quán)利要求7的多層分析元件，其中，所述憎水性化合物為1-(2，4，6-三氯苯基)-3-十五烷基氨基苯基-氨基吡唑酮，或2-氯-5-[γ-(2，4-二-四胺苯氧基)-丁酰氨基)-苯胺-α-N-苯甲酰海因酰新戊酰乙酸。
9權(quán)利要求1的多層分析元件，其中，所述親水層厚介于2～100微米。
10權(quán)利要求1的多層分析元件，其中，所述親水層尚含至少一種增濕劑。
11權(quán)利要求1的多層分析元件，其中，所述親水層尚含至少一種鞣制劑。
12在通式A-C-B的酶親和性化合物存在下檢測膽甾醇的多層分析元件，其中A為對膽甾醇具親和性的檢測劑，B為含過氧化酶的酶性顯色劑，且C為將顯色劑和檢測劑連結(jié)在一起的膠粘劑；所述元件包括一種固體載體和一層附著其上的親水層，后者由明膠，聚乙烯醇或上列的混合物組成且含用量占總重5％～30％的一種顯影劑及生色劑，顯影劑和生色劑重量比為1∶0.3～1∶3.0，顯影劑在過氧化氫中的過氧化酶作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，由此被氧化后的顯影劑與生色劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。
13權(quán)利要求12的多層分析元件，其中，所述顯影劑為下式的化合物
其中R，R′及R″可相同也可不同，且各自分別為氫原子，烷基或鏈烷醇基。
14權(quán)利要求13的多層分析元件，其中，所述顯影劑為選自下列一組的一種化合物N，N-二乙基對苯二胺，對乙基氨基-鄰甲苯胺，對-[N-乙基-N-(β-羥乙烯基)氨基]-苯胺，對-[N-乙基-N-(β-甲磺酰氨基乙基)氨基]-鄰甲苯胺，對-[N-乙基-N-(β-羥乙基)氨基]-鄰甲苯胺，以及對-[N-丁基-N-(γ-磺酰丙基)氨基]-苯胺。
15權(quán)利要求12的多層分析元件，其中，所述顯影劑為選自下列一組的一種化合物二乙基對甲苯二胺，乙氧基乙基對苯二胺，乙基甲磺酰氨基乙基對甲苯二胺，乙氧基乙基對甲苯二胺，丁磺酰丙基對苯二胺，以及二乙基對苯二胺。
16權(quán)利要求12的多層分析元件，其中，所述生色劑為選自一組由吡唑酮-5、苯甲酰乙酸或萘酸的衍生物組成的化合物中的一種。
17權(quán)利要求16的多層分析元件，其中，所述生色劑為選自下列一組的一種化合物1-(2，4，6-三氯苯基)-3-十五烷基-氨基苯基-氨基吡唑酮，3，5-二羧苯基十八烷基氨基-1-氧-2-萘酸，2-氯-5-[γ-(2，4-二-四胺苯氧基)-丁酰氨基)-苯胺-α-N-苯甲酰海因酰新戊酰乙酸，間-(N-乙基-N-十八烷基)-氨基-對苯甲酰乙酰胺苯磺酸，間羧基-間-{N-(對氯-間-(N-鄰十八烷基-羥基苯甲酰基乙?；?氨基)苯?；被?-羧酸，鄰苯氧基-間-(5-氧-1，2-吡唑啉-3-基)苯磺酸，2-甲基十八烷基氨基-5′-磺酰苯胺苯甲酰乙酸，2′-氯-5′-(3″，5″-二羧苯基磺氨基)-苯胺基-2-十八烷氧基苯甲酰乙酸，十八烷基氨基-1-氧-4-硫-2-萘酸，2′-甲基十八烷基氨基-5′-磺酰苯胺基-1，2-羥萘酸，以及1-(4′-苯氧基-3′-磺苯基)-3-甾基-氨基吡唑酮。
18權(quán)利要求16的多層分析元件，其中，所述生色劑為粒徑小于0.1微米的憎水性化合物。
19權(quán)利要求18的多層分析元件，其中，所述憎水性化合物為1-(2，4，6-三氯苯基)-3-十五烷基-氨基苯基-氨基吡唑酮，或2-氯-5-[γ-(2，4-二四胺苯氧基)-丁酰氨基)-苯胺-α-N-苯甲酰海因酰新戊酰乙酸。
20權(quán)利要求12的多層分析元件，其中，所述親水層厚介于2～100微米。
21權(quán)利要求12的多層分析元件，其中，所述親水層尚含至少一種增濕劑。
22權(quán)利要求12的多層分析元件，其中，所述親水層尚含至于少一種鞣制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及含可與待測樣相互作用的試劑、可定量檢測待測樣某一組分的多層分析元件,該元件包括一種固體載體和一層附著其上的親水層,后者由明膠、聚乙烯醇或上列的混合物組成且含用量占總重5%～30%的一種顯影劑及生色劑,顯影劑和生色劑重量比為1∶0.3～1∶3.0,顯影劑在所述試劑中的氧化劑作用下發(fā)生氧化反應(yīng),由此被氧化后的顯影劑與生色劑反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。本發(fā)明多層分析元件可用于醫(yī)學(xué)和藥學(xué),以及刑事領(lǐng)域。它可用于膽甾醇、氯離子和葡萄糖檢測,故便于囊纖維病、糖尿病以及高血脂癥的診斷。
文檔編號G01N33/52GK1173224SQ95197367
公開日1998年2月11日 申請日期1995年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月16日
發(fā)明者A·M·馬利夫, Y·B·巴布里尤克, I·A·科徹托夫, A·S·帕福諾夫, Y·M·勞普克英, A·B·拉伯夫斯基 申請人:2860601加拿大有限公司