專利名稱：用于乙酰氨基苯測定的干法分析元件的制作方法
這是1992年7月15日公開的序號為914915的申請的部分延伸。
本發(fā)明涉及用于檢測在水流體中的乙酰氨基苯的使用干法分析元件的分光光度測定。
乙酰氨基苯是一種廣泛使用的止痛藥。它無需處方就可以買到并且在阿斯匹林對病人可能有問題時經(jīng)常使用。在治療量，血清濃度通常低于50mg/L。如果攝食藥物4小時后血清濃度大于300mg/L，通常觀察到毒性。過量的一個作用是肝毒性。因此顯然需要一種精確檢測血清中乙酰氨基苯濃度的方法。
測定酰苯胺類諸如乙酰氨基苯的己知方法使用芳基酰胺酶(E.C.3.5.1.13)和一種氧化劑。芳基酰胺酶使?；桨返孽０锋I斷開，生成乙酸鹽和苯酚諸如對胺基苯酚。然后使苯胺與成色化合物象苯酚在氧化劑諸如高錳酸鹽或銅或鐵的金屬鹽存在下形成有色化合物象可在615nm處被檢測的靛酚。其它方法使用象高碘酸或過硫酸鹽類的氧化劑。美國專利4,999,288和4,430,433是典型的。
這三種方法的一個缺點(diǎn)是大多數(shù)金屬鹽氧化苯胺非常緩慢，除非它們在堿性PH這種使芳基酰胺酶失活的條件下。
美國專利4675290(1987年6月23日公布，Matsumoto)公開了一種測定肽酶酶活性的方法，它包括用含有肽酶的樣品處理合成的二溴化酰胺(作為底物)從而放出二溴化苯胺；用氧化酶(例如抗壞血酸鹽氧化酶)對該放出的二溴化苯胺氧化，消耗氧并通過所述苯胺在分子式確定的成色劑存在下形成色素。該反應(yīng)在溶液中進(jìn)行。
Matsumoto的方法使用酶并因此可以克服與先有技術(shù)無機(jī)氧化劑沖突的問題。然而，Matsumoto采用合成的二溴化的底物并因此不能直接測試乙酰氨基苯。就用于形成有色苯酚的氧化成色劑而言，當(dāng)在成色反應(yīng)中使用這種鹵化苯酚類時，可以提高給色量是本技術(shù)中顯而易見的。然而，當(dāng)乙酰氨基苯出現(xiàn)在待測生物流體中時，它不是鹵化的并因此是與在Matsumoto的方法中使用的二溴化合成的底物化學(xué)區(qū)分的。
另外，Matsumoto公開了一種溶液測定法。可采用的更方便的測定法涉及＂干＂化學(xué)——一個術(shù)語，指進(jìn)行時使用含有不同＂指觸干燥＂測試元件諸如＂浸漬和讀?。y試條、多層測試元件和類似無件的化學(xué)試劑的方法和技術(shù)。＂干＂法為了重建或分析除了測試樣品之外無需液體。
在溶液測定中采用的試劑當(dāng)適應(yīng)干法模式時經(jīng)常做不好。干法元件使用微量試劑和測試樣品，因此在用于乙酰氨基苯測定的干法元件中，重要的是采用當(dāng)苯胺被氧化連接到成色劑上而形成顏色時給出清晰和準(zhǔn)確的彩色信號的試劑。
選為可能成色劑的化合物其范圍是很寬的。Matsumoto對于那些會在干式化學(xué)現(xiàn)象和過程中表現(xiàn)出色的成色氧化成色劑既沒有建議也沒有提供引導(dǎo)。
希望有一種干法試驗用于測定在含有酶和其它試劑——當(dāng)在干法模式中被結(jié)合和被覆蓋時保持活性并與適宜的成色劑氧化偶合上給出清晰和準(zhǔn)確的彩色信號——的生物流體中的乙酰氨基苯。
本發(fā)明是為在干法模式使用一種提供可檢測的顏色變化和精確測定乙酰氨基苯的成色劑而進(jìn)行選擇。它公開了需用水溶性成色劑以及水不溶性成色劑即使適宜地分散效果也不佳。
本發(fā)明的元件避開了先有技術(shù)指出的無機(jī)氧化劑而使用輕度氧化劑諸如酶或氰鐵酸鹽代替。在干法分析元件里，已知氧化劑象Cu2+和大多數(shù)Fe3+鹽通過交聯(lián)并因此硬化凝膠而破壞凝膠基質(zhì)。使用酶作為氧化劑解決了這個問題。適合的氧化酶包括抗壞血酸氧化酶、乳糖酶和酪氨酸酶。
氰鐵酸鹽是不如大多數(shù)Fe3+鹽或其它金屬氧化劑(見表A)強(qiáng)的氧化劑。因此出乎意料的是，氰鐵酸鹽在中性PH不破壞干法元件結(jié)構(gòu)下能夠提供快速反應(yīng)動力學(xué)。適合的氰鐵酸鹽包括堿金屬和堿土金屬氰鐵酸鹽像例如鉀、鈉和鈣氰鐵酸鹽這樣的。優(yōu)選的氰鐵酸鹽是堿金屬氰鐵酸鹽。
相應(yīng)地提供一種用于測定水流體中乙酰氨基苯的含有載體的分析元件，在載體上有至少一個試劑層而在所述的試測層上含有(a)一種芳基酰胺酶；(b)一種氧化酶或一種具有使對胺基苯酚氧化連接到成色劑上形成彩色化合物能力的氰鐵酸鹽。
(c)水溶性、形成顏色的成色劑，具有一般結(jié)構(gòu)
其中R是水溶基團(tuán)，選自-(CH2)nX，其中n為1-5，X是-SO3M，其中M是氫、堿金屬、堿土金屬或銨(NH4+)陽離子或X是-N(R7)3+Z-，每個R7是獨(dú)立選自1-4個碳原子的烷基諸如甲基、乙基、丙基和丁基，而Z是酸性陰離子諸如氯、溴、碘、氟、對甲苯磺酸鹽及類似物，或X是(-OCH2CH2)yOH，其中y為2-5；R1和R6共同表示亞乙基、三亞甲基或形成不完全飽和環(huán)的四亞甲基基團(tuán)；R2、R3和R4分別選自氫、有1-4個碳原子的烷基和有1-4個碳原子的烷氧基。
本發(fā)明的另一具體表現(xiàn)提供了一種用于測定水流體中乙酰氨基苯的方法，包括步驟a.用上述分析元件接觸水成液樣品；和b.使形成的有色化合物的量與流體中的乙酰氨基苯濃度相關(guān)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是水溶性成色劑和或者酶催化的氧化偶合或者氰鐵酸鹽偶合，允許快速反應(yīng)。我們能在57秒內(nèi)形成可檢測的彩色信號。水不溶性成色劑涉及的反應(yīng)慢得多。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)為了在希望的時間(5分鐘)內(nèi)獲得可接受的量的有色產(chǎn)物，必需要聯(lián)合水溶性成色劑和酶。甚至在溶液測定中，為了在5分鐘內(nèi)獲得結(jié)果，氧化酶(例如抗壞血酸鹽氧化酶)不得不在用緩沖劑稀釋之前與水溶性成色劑預(yù)先混合。尚且不知道這樣做的原因。但另一方面不希望被科學(xué)理論局限，申請人認(rèn)為成色劑的水溶性允許它在分析元件中在貯藏期間(即在合成和使用之間)與酶充分地混合。它表現(xiàn)出成色劑和氧化酶在反應(yīng)前先接觸對于在5分鐘內(nèi)得到滿意的彩色反應(yīng)是必要的。


圖1是表示使用1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉(化合物#2，THQSO3H)作為成色劑時本發(fā)明分元件性能的圖。
圖2是表示使用1-(正丁基)-1，2，3，4-四氫喹啉(化合物#1，BTHQ)作為成色劑的對比元件性能的圖。
圖3是表示使用1，2，3，5，6，7-六氫苯并[ij]喹啉(化合物#4，久洛尼定)作為成色劑的另一個對比元件性能的圖。
圖4是表示使用1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉(化合物#2，THQSO3H)作為成色劑并使用氰鐵酸鉀作為氧化劑的本發(fā)明分析元件性能的圖。
本發(fā)明公開了用于測定乙酰氨基苯的比色測定，其基于乙酰氨基苯的酶催化水解并接著檢測水解的代謝物。更特別地，測定使用第一種酶芳基酰胺酶(E.C.3.5.1.13)使乙酰氨基苯的酰胺鍵斷開以生成乙酸和對胺基苯酚。第二種酶諸如抗壞血酸氧化酶(E.C.1.10.3.3)、酪氨酸酶(E.C.1.14.18.1)或乳糖酶(E.C.1.10.3.2)氧化對胺基苯酚從而與這里定義的水溶性成色劑偶合形成染料。氰鐵酸鹽也可以用于氧化對胺基苯酚。染料在670nm處被檢測。反應(yīng)進(jìn)程如下
在本發(fā)明中有用的水溶性成色劑通過從許多不同的具有相似結(jié)構(gòu)的成色劑中篩選和選擇而被發(fā)現(xiàn)。不溶性的那些不能在測試條件下提供足夠的偶合(干法模式)以對寬動態(tài)范圍的分析物濃度的分析分辨產(chǎn)生足夠的吸收率。在此之前描述的那些結(jié)構(gòu)并且其中R1和R6共同表示三亞甲基，即達(dá)到不完全飽和六元含氮雜環(huán)具有特別希望的吸收最大值(約670nm)，并且在分析元件中特別有用，因為吸收不被干擾物諸如膽紅素——在低波長吸收——屏蔽。優(yōu)選的水溶性品種是1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉。篩選的步驟和其結(jié)果在下文中描述。反應(yīng)結(jié)束形成的有色化合物的量表示測試樣品中乙酰氨基苯的濃度。
把上述試劑涂在載體上來提供本發(fā)明的干分析元件。元件可以形成各種形狀，包括任意所需寬度的細(xì)長條、薄片、載片或小片。
元件可以在手控的或自動化測定技術(shù)中使用。通常，在使用元件中，乙酰氨基苯測定是這樣進(jìn)行的，將元件從供料輥、片料包或其它來源取出，然后，使它與待測試的液體樣品(例如最多到200mL)物理接觸，這樣樣品與試劑接著在元件中相互作用變成混合的。這種接觸可以用任何適宜的方法完成，例如通過浸漬或浸沒元件到樣品中，或優(yōu)選通過用任何適宜的施行方法用手或機(jī)器將樣品液點(diǎn)滴在元件上。
制樣后，元件孵化最多達(dá)5分鐘以促進(jìn)顏色的形成。通過孵化它的意思是在進(jìn)行顏色測定之前使試劑在37℃下保持互相接觸最多5分鐘時間。在該測定中可以被測試的水液體包括—但不局限于——全血、血漿、血清、淋巴、膽汁、尿、脊髓液、唾液、汗和類似物以及糞便分泌物。還可以測定人或動物組織諸如體壁肌、心臟、腎、肺、腦、骨髓、皮膚和類似物產(chǎn)生的液體。
對于液體測定有用的干法分析元件可以根據(jù)US3,992,158和US4,357,363的技術(shù)制備，其內(nèi)容在此全部包括。
簡而言之，本發(fā)明的分析元件包含涂敷在適宜載體上的一層或多層。所有的試劑可以在涂敷在載體上的單層里。優(yōu)選如下文表I中所示試劑被覆蓋在兩個不同的試劑層里。無論包含在相同還是不同的元件層里，所有試劑必須以液體形式相互接觸，造成試劑和反應(yīng)產(chǎn)物可以通過層內(nèi)部并在鄰近層的疊加區(qū)域之間。換言之，當(dāng)元件與水流體接觸時，本發(fā)明的分析成分的所有試劑接著如本文中在前所述被混合。
載體可以是任意適宜的尺寸穩(wěn)定的，優(yōu)選無孔和可穿透的(即射線能透射的)材料，其透過波長在約200和約900nm之間的電磁輻射。透輻射載體特別優(yōu)選通過使用多種輻射探測法提高并簡化出現(xiàn)在這些元件里的可檢測變化的測定。為特別元件選擇的載體應(yīng)與指定的檢測方法(反射、透射或熒光光譜法)相適應(yīng)。有用的載體材料包括聚苯乙烯、聚酯(倒如聚對苯二甲酸乙酯)]、聚碳酸酯、纖維素酯(例如乙酸纖維素)等。
在載體上至少涂一層試劑。試劑層包括含有一種或多種分散在一種或多種合成或天然粘合劑材料，諸如明膠或其它天然存在的膠體中的試劑的指示劑組分，以及不同的合成的親水聚合物諸如聚丙烯酰胺、聚(N-乙烯-2-吡咯烷酮)、聚(丙烯酰胺-共-N-乙烯-2-吡咯烷酮)、上述的共聚物、聚合物或?qū)σ鸭尤肓丝山宦?lián)單體的共聚物。
試劑層可以含有緩沖劑。有用的緩沖劑包括磷酸鹽、焦磷酸鹽、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、2{[三(羥甲基)甲基]氨基}-1-乙磺酸(TES)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(EPPES)、2-羥基-3-{N-[三(羥甲基)甲基]氨基}-丙磺酸(TAPSO)和其它PH在6.5至8.5范圍內(nèi)最好是7.5的緩沖劑。緩沖劑可以在元件的任意層或所有層中，或它可以在無其它試劑的一個分離的層里。
一些表面活性劑諸如Olin-10GTM、TXTM-102、TX-405TM、Zonyl FSNTM，但優(yōu)選TX-100TM和TX-165TM(TX表面活性劑是Union Carbide出售的辛苯氧基聚乙氧基乙醇非離子表面活性劑類)可以任意地被包含在試劑層里。一些不同的交聯(lián)劑也是任意的，諸如二乙烯磺酰甲烷、戊二醛等。
元件可以具有多孔的、反射涂布層以均勻地在元件上分布液體試樣。涂布層可以含有試劑，但優(yōu)選它是如下文表I中所示的性質(zhì)不同的層。用于涂布層中的材料是本技術(shù)領(lǐng)域熟知的象，例如在US 4258001和上述引用的專利中公開的制備干化學(xué)元件的那樣。
有用的涂布層可以如在US 4,292,272(1981年9月29日公布，Kitajima等)描述的用纖維材料或者與適宜的粘合劑混合或者織成織物來制備，如在US 4258001(1981年3月24日公開，Pierce等)、US 4430436(1984年2月7日公開，Koyama等)和日本專利公報57(1982)-101760中描述的用聚合組合物或粒狀材料—例如紅色聚合物諸如在US 3992158中公開的——用或不用粘合劑作成細(xì)粒狀來制備。特別有用的涂布層含有硫酸鋇或二氧化鈦。由于樣品通常被直接提供到涂布層上，所以希望涂布層是無向多孔的，意思是由微粒、纖維或聚合的成分之間互相連接區(qū)或孔造成的在層里的孔率在每個方向是相同的。典型的涂布層列在表I中。
在一個具體例子中，涂布層含有N-乙基馬來酰亞胺——一種發(fā)現(xiàn)用于阻擋可存在于測試流體中的干擾物的化合物。通常T.C.Arter等所有的標(biāo)題為Sulfhydryl Complexing Agents inClinical Test Elements的美國申請公開了這一發(fā)明并數(shù)據(jù)隨同編入。
如果希望可以包括其它任意的層例如底層、阻擋輻射層等。元件的層可以含有多種其它需要的但任意的成分，包括表面活性劑、增稠劑、緩沖劑、硬化劑、抑菌劑、抗氧劑、偶合溶劑和其它本領(lǐng)域已知的材料。這些成分的量也屬于本領(lǐng)域工人的技能。
在元件中的變化可以用適宜的分光光度儀——通常為反射儀——采用已知方法例如在US 3,992,158第14-15欄、US 4,357,363第27欄公開的進(jìn)行測定。在酶反應(yīng)中，產(chǎn)物是通過測量與測試樣品接觸的本發(fā)明元件里限定區(qū)域中反射或透射的變化率來測定的。測量的區(qū)域通常從約3至約5mm。
本發(fā)明典型的元件列在下文表1a和1b中。
表1a使用氧化酶的乙酰氨基苯元件履蓋度g/m2*試劑/涂層 有效范圍 實(shí)際樣品硫酸鋇 75-120 100纖維素 1-208表面活性劑TX-405TM0.2-4 1.6Estane聚氨基甲酸乙酯彈性纖維 1-1512.3馬來酰亞胺 0.1-3.0 1.0底層聚乙烯吡咯烷酮0.5-2.5 1.0試劑層1未硬化的凝膠 4-24 6表面活性劑TX-165TM0.005-0.10.01HEPES緩沖劑 2-10 2.4抗壞血酸氧化酶50,000-300,000 1U/m2175,000 1U/m2芳基酰胺酶1,000-50,000 1U/m25,000 1U/m2試劑層2未硬化的凝膠 4-24 6成色劑THQSO3H0.2-21.0HEPES緩沖劑 2-10 4.8表面活性劑TX-165TM0.005-0.10.01注*g/m2只有抗壞血酸氧化酶和芳基酰胺酶是1U/m2。TX-405TMTX-100TM辛苯氧基聚乙氧烷族TX-165TMUnion Carbide出售的乙醇Triton X-100TMTHQSO3H表1的化合物2，即1-(3-磺基丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉EstaneB.F.Goodrich出售的聚酯/聚氨基甲酸乙酯聚合物HEPES4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙基磺酸表1b使用氰鐵酸鹽的乙酰氨基苯元件履蓋度g/m2*試劑/涂層有效范圍實(shí)際樣品硫酸鋇75-120100纖維素1-20 8表面活性劑TX-405TM0.2-4 1.6Estane聚氨基甲酸乙酯彈性纖維 1-15 12.3馬來酰亞胺0.1-3.0 1.0底層聚乙烯吡咯烷酮0.5-2.5 1.0試劑層1未硬化的凝膠4-246表面活性劑TX-165TM0.005-0.1 0.01HEPES緩沖劑 2-102.4氰鐵酸鉀0.1-5.0 1.8芳基酰胺酶 1,000-50,000 1U/m25,000 1U/m2試劑層2未硬化的凝膠4-246成色劑THQSO3H 0.2-2 1.0HEPES緩沖劑 2-104.8表面活性劑TX-165TM0.005-0.1 0.01注*g/m2只有芳基酰胺酶是1U/m2。TX-405TMTX-100TM辛苯氧基聚乙氧烷族TX-165TMUnion Carbide出售的乙醇Triton X-100TMTHQSO3H表1的化合物2，即1-(3-磺基丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉EstaneB.F.Goodrich出售的聚酯/聚氨基甲酸乙酯聚合物HEPES4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙基磺酸使用下列方法發(fā)現(xiàn)在抗壞血酸氧化酶存在下與鄰一胺基苯酚偶合在溶液里給出強(qiáng)烈顏色化合物的成色劑。在用于定量測定乙酰氨基苯的干法分析元件里這些成色劑的性能被進(jìn)一步測試。
3mL的0.1M TRIS緩沖劑在PH 7.5與300μL的含有0.04M成色劑的溶液混合后被測試。在該溶液中加入150μL的抗壞血酸氧化酶(4000U/mL)、150μL的芳基酰胺酶溶液(70U/mL)和150μL的乙酰氨基苯溶液(300mg/L)。5分鐘后在37℃下在能觀察到λmax波長處測量每種染料的吸收度。設(shè)定每種染料溶液的波譜在λ＝300-800nm之間以便測定每種染料的λmax。在5分鐘后具有大于0.3的吸收度的成色劑被認(rèn)為對于在于法分析元件中使用是清意的(0.3值是通過減去成色劑在染料的λmax的波長處的值求得的)。每個代號的成色劑在300mg/L乙酰氨基苯的吸光值列于表II中。下面9種化合物是那些作為可能成色劑所測之中的
表II為乙酰氨基苯測定選擇的成色劑成色λmax吸光度
670nm 0.36(乳狀液)
670nm 0.65
600nm 0.104.
670nm 0.2
表II-續(xù)為乙酰氨基苯測定選擇的成色劑成色劑λmax吸光度
500 nm0.23
650 nm0.12
600 nm0.14
550 nm0.06
表II-續(xù)為乙酰氨基苯測定選擇的成色劑成色劑λmax 吸光度
650 nm 0.04化合物是水不溶性的。所用化合物的DMF溶液加入到分析液中。
表II的數(shù)據(jù)表明，表中的成色劑只有化合物1、2和4符合吸光度標(biāo)準(zhǔn)，并因此值得為用于干法分析元件測試(即入＝670，吸光度大于0.3)，而化合物2結(jié)果靈敏性最差?；衔?和4不加二甲基甲酰胺(DMF)就不溶。當(dāng)這些化合物溶于成色劑(2，4-二-正-戊基苯酚)溶劑中并然后涂敷在本發(fā)明的干法元件上時(下文實(shí)施例1、2和3)，它們就比化合物#2產(chǎn)生了非常低的信號。結(jié)果在圖1、2和3中表示。
制備1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉(化合物#2，THQSO3H)1，2，3，4-四氫喹啉(4.76g，40摩爾)和1，3-丙烷磺內(nèi)酯(4.88g，40摩爾)在50mL試劑級乙腈中的混合物在氮?dú)鈿夥罩屑訜岵⒒亓鬟^夜。冷卻至室溫后，再冷卻至冰浴溫度， 濾生成的白色固體并用冷乙腈洗滌。產(chǎn)率為8.1g(84％)，產(chǎn)物熔點(diǎn)高于200℃。核磁共振(NMR)和元素分析表明產(chǎn)物與設(shè)計的結(jié)構(gòu)一致。NMR(D2O)7.45(s，4H)，2.8-4.0(m，8H)，2.2(T，2H)。實(shí)施例1成色劑THQSO3H(No.2)在分析元件里制備后，把偶合化合物#2涂敷到表1a所示的本發(fā)明的元件里并在改變已知水中已酰氨基苯濃度的試驗(1.0、5.4、10.0、19.0、30.0、39.0、52.0、98.0、202.0和294.0mg/L)中測試其性能?？梢愿鶕?jù)美國專利3,992,158、4,357,363和4,258,001的技術(shù)進(jìn)行元件的涂敷。
圖1所示的動態(tài)響應(yīng)指出采用這種成色劑在整個設(shè)計的動態(tài)區(qū)域內(nèi)(1-30mg/dL)見到的靈敏度好。對比實(shí)施例2成色劑1-(正丁基)1，2，3，4-四氫喹啉(化合物#1，BTHO)用在分析元件里如實(shí)施例1那樣制備分析元件并用改變乙酰氨基苯濃度的樣品點(diǎn)滴上，除了用偶合化合物#1(BTHQ)代替化合物#2(THQSO3H)以外。還因為化合物No.1不是水溶性的，它不得不分散在2-4-二-正-戊基苯酚里。
圖2所示的結(jié)果表明在分析元件里這種成色劑無用并且提供的動態(tài)區(qū)域非常窄。對比實(shí)施例成色劑1，2，3，5，6，7-六氫苯并[i，j]喹啉(化合物#4，久洛尼定)在分析元件里如實(shí)施例1那樣制備分析元件并用乙酰氨基苯變化濃度的樣品點(diǎn)滴上，除了用偶合化合物#4(久洛尼定)代替化合物#2(THQSO3H)以外。因為化合物No.4不是水溶性的，它不得不分散在2，4-二-正-戊基苯酚里。
圖3所示的結(jié)果表明這種成色劑提供非常窄的動態(tài)區(qū)域并因此對我們的目的無用。實(shí)施例2在元件里酪氨酸酶作為氧化劑如實(shí)施例1那樣進(jìn)行本實(shí)施例，除了用另一種氧化劑酪氨酸酶6400U/m2代替175000U/m2抗壞血酸氧化酶以外。在670nm處用反射型顯象密度測定法測量密度響應(yīng)。通過為產(chǎn)生的密度推導(dǎo)密度/前置量活動曲線和從樣品的密度預(yù)測樣品的乙酰氨基苯含量來制定前置量。
基于元件的密度響應(yīng)得到的前置量(表III)與在測試元件上的試驗流體里的已知乙酰氨基苯沈度完全發(fā)生聯(lián)系。在元件里使用酪氨酸酶作氧化劑的實(shí)施例表III乙酰氨基苯含量 密度響應(yīng)值(mg/dL)at670nm前置量(mg/dL)0.1 .165 0.10.5 .178 0.51.0 .190 0.91.9 .220 1.93.0 .251 3.03.9 .280 4.15.2 .307 5.29.8 .495 10.020.9 .650 20.829.4 .723 29.4實(shí)施例3在元件里使用氰鐵酸鉀作為氧化劑制備后，偶合化合物#2被涂敷在如表1b中所示的使用氰鐵酸鉀作為氧化劑的本發(fā)明元件里。在改變已知人血清中已酰氨基苯濃度的化驗(0.0、10、24、50、100、146、193、247、295、350和391mg/L)中測試其性能。
圖4所示的動態(tài)響應(yīng)指出氰鐵酸鹽在整個設(shè)計的動態(tài)區(qū)域(1-30mg/dL)內(nèi)提供了好的靈敏性。在表1b的元件結(jié)構(gòu)里使用其它金屬鹽(表A)太緩慢了。當(dāng)與其它試驗的氧化劑相比時，出乎意料的是氰鐵酸鹽基于其較低的氧化還原電勢產(chǎn)生了較快的動力學(xué)。
表A材料氧化還原電勢 反應(yīng)速率硫酸鋼+0.34V慢氯化鋼+0.34V慢硝酸鐵+0.77V很慢硝酸銀+0.59V很慢硝酸銀+0.81V很慢氰鐵酸鉀 +0.46V很快本發(fā)明通過特別涉及其優(yōu)選具體實(shí)例而作了詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可以進(jìn)行有效的變化和改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.一種含有載體的分析元件，用于在水流體中測定乙酰氨基苯，在載體上有至少一個試劑層并在所述的試測層里含有(a)一種芳基酰胺酶；(b)一種氧化劑，選自由一種酶和一種氰鐵酸鹽組成的組中，具有氧化偶合對胺基苯酚到成色劑上以形成顏色化合物的能力；和(c)水溶性的、形成顏色的成色劑，具有一般結(jié)構(gòu)
其中R是水溶基團(tuán)，選自-(CH2)nX，其中n為1-5，X是-SO3M，其中M是氫、堿金屬、堿土金屬或銨(NH4+)陽離子，或X是-N(R7)3+Z-，每個R7是獨(dú)立選自1-4個碳原子的烷基；Z是酸性陰離子；或X是(-OCH2CH2)yOH，其中y為2-5。R1和R6共同表示亞乙基、三亞甲基或形成不完全飽和環(huán)的四亞甲基基團(tuán)；R2、R3和R4分別選自氫、有1-4個碳原子的烷基和有1-4個碳原子的烷氧基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的含有載體的分析元件，用于在水流體中測定乙酰氨基苯，在載體上有至少一個試劑層并在所述試劑層里含有(a)一種芳基酰胺酶；(b)一種氧化酶，是有使對胺基苯酚氧化偶合到成色劑上形成彩色化合物的能力；和(c)水溶性的、形成顏色的成色劑，具有一般結(jié)構(gòu)
其中R是水溶基團(tuán)，選自-(CH2)nX，其中n為1-5，X是-SO3M，M是氫、堿金屬、堿土金屬或銨(NH4+)陽離子，或X是-N(R7)3+Z-，每個R7是獨(dú)立選自1-4個碳原子的烷基；Z是酸性陰離子；或X是(-OCH2CH2)yOH，其中y為2-5。R1和R6共同表示亞乙基、三亞甲基或形成不完全飽和環(huán)的四亞甲基基團(tuán)；R2、R3和R4分別選自氫、有1-4個碳原子的烷基和有1-4個碳原子的烷氧基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的含有載體的分析元件，用于在水流體中測定乙酰氨基苯，在載體上有至少一個試劑層并在所述試劑層里含有(a)一種芳基酰胺酶；(b)一種氰鐵酸鹽，具有使對胺基苯酚氧化偶合到成色劑上形成彩色化合物的能力；和(c)水溶性的、形成顏色的成色劑，具有一般結(jié)構(gòu)
其中R是水溶基團(tuán)，選自-(CH2)nX，其中n為1-5，X是-SO3M，M是氫、堿金屬、堿土金屬或銨(NH4+)陽離子，或X是-N(R7)3+Z-，其中每個R7是獨(dú)立選自1-4個碳原子的烷基；Z是酸性陰離子；或X是(-OCH2CH2)yOH，y為2-5。R1和R6共同表示亞乙基、三亞甲基或形成不完全飽和環(huán)的四亞甲基基團(tuán)；R2、R3和R4分別選自氫、有1-4個碳原子的烷基和有1-4個碳原子的烷氧基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的含有載體的多層分析元件，用于在水流體中測定乙酰氨基苯，從所述載體依次在其上具有并在流體中接觸(a)一個或多個其中含有芳基酰胺酶的層；具有氧化偶合對胺基苯酚到偶合劑上形成有色化合物能力的氧化酶；如權(quán)利要求1中定義的水溶性的、形成顏色的成色劑；和(b)一個多孔的涂布層。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的元件，其中氧化酶選自由抗壞血酸酶、乳糖酶和酪氨酸酶組成的組中。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的元件，其中成色劑是1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的元件，進(jìn)一步含有用于保持元件的PH在約6.5至約8.5范圍內(nèi)的緩沖劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的元件，進(jìn)一步含有馬來酰亞胺。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的含有載體的多層分析元件，用于在水流體中測定乙酰氨基苯，從所述載體依次在其上具有并且在流體中接觸(a)一個或多個其中含有芳基酰胺酶的層；具有氧化偶合對胺基苯酚到成色劑上形成有色化合物能力的氰鐵酸鹽；如在權(quán)利要求1中定義的水溶性的、形成顏色的成色劑；和(b)一個多孔的涂布層。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的元件，其中氰鐵酸鹽是堿金屬的氰鐵酸鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求3的元件，其中成色劑是1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉。
12.根據(jù)權(quán)利要求3的元件，進(jìn)一步含有保持元件PH在約6.5至8.5范圍內(nèi)的緩沖劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求3的元件，進(jìn)一步含有馬來酰亞胺。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的含有載體的多層分析元件，用于在水流體中測定乙酰氨基苯，從所述載體依次在其上具有第一和第二試劑層，其中第一試劑層中含有1-(3-磺丙基)-1，2，3，4-四氫喹啉；第二試劑層中含有抗壞血酸酶或氰鐵酸鹽和芳基酰胺酶；和一個多孔涂布層。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的元件，進(jìn)一步含有馬來酰亞胺。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的元件，其中馬來酰亞胺在涂布層。
17.在水流體中測定乙酰氨基苯的方法，包括步驟a.用權(quán)利要求1、2、3或14的分析元件與水流體樣品接觸；和b.將生成的彩色化合物的量與流體中乙酰氨基苯的濃度關(guān)聯(lián)。
全文摘要
用于檢測在水流體中的乙酰氨基苯進(jìn)行的分光光度測定使用了干法分析元件，元件含有一個載體，其上具有一個或多個試劑層，試劑層含有重要的酶-芳基酰胺酶—使乙酰氨基苯的酰胺鍵斷開生成對胺基苯酚；和一種輕度氧化劑來氧化對胺基苯酚以使它連到一種水溶性成色劑上形成一種在670nm處可讀取的染料。本方法對于血清和血漿樣品是精密準(zhǔn)確的，相對不受明顯干擾。元件也允許在動態(tài)范圍廣的區(qū)域進(jìn)行測定。
文檔編號G01N33/52GK1155658SQ96110799
公開日1997年7月30日 申請日期1996年6月22日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月22日
發(fā)明者T·C·阿特, J·C·毛克, J·R·舍弗, R·F·溫特科恩 申請人:莊臣臨床診斷有限公司