專利名稱：不對稱性梯度電場電泳槽及電泳方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種分離生物大分子物質(zhì)的凝膠電泳槽及電泳方法，屬于生物技術(shù)的大分子分離與分析技術(shù)領(lǐng)域。
凝膠電泳是分離與分析蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子物質(zhì)的常用技術(shù)。凝膠電泳裝置由電泳槽和為之提供電源的電泳儀兩部分(同時工作)組成?，F(xiàn)有的穩(wěn)直流電泳槽(水平電泳槽、垂直電泳槽等)都是在一對正、負電極(通常為一對平行的白金絲電極)之間的正中位置設(shè)定凝膠支承架(板狀或管狀)，電泳時，樣品在正、負電極之間居中放置的近全部長度的凝膠中進行分離。根據(jù)均勻長直導(dǎo)線的電場分布和疊加原理，在這種位于電極對中央位置的凝膠中，電場強度以兩電極之間電泳中線處(與正極和負極的有效電泳距離相等)最弱，由該中線向兩電極方向逐漸增強，呈對稱性梯度分布。因此，在現(xiàn)有的對稱性梯度電場電泳槽中，當樣品加到凝膠靠近電極(通常為負極)一端，向凝膠另一端進行穩(wěn)流或穩(wěn)壓電泳時，電泳圖譜縱向表現(xiàn)為三段性首先在凝膠的加樣一側(cè)，電泳譜帶濃重；而在凝膠的中間區(qū)域，電泳譜帶密集、且多數(shù)粘連為彌散狀；在凝膠的另一側(cè)，電泳譜帶較分散，但單條譜帶較寬。隨著凝膠長度的增加和電泳時間的相應(yīng)延長，上述問題更加明顯。從而限制了凝膠電泳的分離效果和分辨力。產(chǎn)生這一問題的癥結(jié)在于電泳過程中，首先由于樣品生物大分子物質(zhì)的電荷效應(yīng)和凝膠對樣品的分子篩效應(yīng)，較小的、電荷量大的分子泳動快；與此同時，在從樣品槽至兩極間電泳中線這半段凝膠中，全部樣品分子沿著電場強度逐漸減弱的梯度減速泳動，由于較小的分子先進入較低電場強度的凝膠區(qū)域，因而首先減速；電荷量越大，減速的幅度也越大；其后較大的分子則仍以較快速度泳動。結(jié)果，具有不同分子特性(分子量、分子形狀、電荷等)、趨向分開的各種鄰近生物大分子譜帶又相互靠近。典型的情況是，分子特性相近的兩種或多種大分子，在向電泳中線泳動的過程中粘連為單條譜帶或彌散帶。因此，在前半段凝膠中，梯度減弱的電場強度大大削弱了凝膠分子篩效應(yīng)等對樣品生物大分子物質(zhì)的分離效果。另一方面，在這半段凝膠中，單條譜帶沿著電場強度逐漸減弱的梯度，也得到不同程度的濃集，因而分子特性相差很大、未粘連的譜帶，則呈現(xiàn)較清晰的窄帶。越過電泳中線以后，生物大分子又沿著電場強度逐漸增強的梯度加速分離，使相鄰大分子的泳動速度不斷增加差距，在后半段凝膠中，梯度增強的電荷效應(yīng)顯著提高凝膠分子篩效應(yīng)對樣品的分離效果。但由于這半段凝膠的長度不足以使具有微小差異的大分子完全分離，特別是越過電泳中線距離較短(即位于凝膠中間區(qū)域電泳中線附近)的多分子條帶，仍形成多種分子若即若離的彌散帶形。增加凝膠長度并延長電泳時間，一方面可增加譜帶間的電泳距離，但另一方面，由于電泳過程中電阻和產(chǎn)熱量也相應(yīng)增加，因而單條譜帶的縱向擴散距離增大，帶形更加彌散；而且，增加凝膠長度還導(dǎo)致電場梯度增強，使前半段凝膠的分離效果進一步削弱。更大的問題還在于，分子特性相近又沒有越過電泳中線、最終位于前半段凝膠中的生物大分子，始終粘連在單條譜帶或彌散帶中得不到分離。
本發(fā)明的目的，就是針對現(xiàn)有電泳槽及電泳方法固有的理論缺陷，創(chuàng)造一類利用不對稱性電場強度梯度分離和分析生物大分子物質(zhì)的凝膠電泳槽和電泳方法，以顯著提高凝膠電泳的分離效果和分辨力。
本發(fā)明的不對稱性梯度電場電泳槽和電泳方法，包括水平電泳槽和垂直電泳槽及相應(yīng)的電泳方法。其技術(shù)特征在于①每一組樣品的分離凝膠及該凝膠的支承架(2)，位于正、負電極(1)之間電泳中線(3)一側(cè)的半電場(即不對稱性梯度電場)中。②符合上述技術(shù)特征①所述的電泳槽，其正、負電極之間的有效電泳距離增加一倍于現(xiàn)有相應(yīng)電泳槽的凝膠支承架的長度(10～20cm)。③符合上述技術(shù)特征①和②所述的單不對稱性梯度電場電泳槽和電泳方法，使具有單排樣品槽的凝膠一端位于電泳中線附近，凝膠另一端則與電極(通常為正極)靠近，一組樣品在電場強度梯度增強的凝膠中電泳。④符合上述技術(shù)特征①和②所述的雙不對稱性梯度電場水平板電泳槽和電泳方法，將具有雙排樣品槽的水平凝膠及其支承架(2)(板狀)，設(shè)置于正、負電極之間的居中位置、并相應(yīng)地增加一倍于單排樣品槽凝膠支承架的長度(10～20cm)；兩組樣品梳插槽分別定位在水平制膠架(與凝膠支承架相匹配)的一端部和中間線附近；電泳時，凝膠具樣品槽(4)的一端與一電極(1)(通常為負極)靠近、凝膠上另一樣品槽(4)相應(yīng)地位于電泳中線(3)附近，兩組樣品分別在電場強度梯度增強和梯度減弱的半長水平凝膠中，同時進行相同方向(5)的電泳。⑤符合上述技術(shù)特征①和②所述的雙不對稱性梯度電場垂直板電泳槽，其上、下電極緩沖液槽的直視平面圖為近等大小的長方形，上槽(6)略小于下槽(7)，兩根白金絲直線電極(1)分別位于上、下槽內(nèi)與槽寬度平行的各一底側(cè)，雙垂直的凝膠支承架(2)的高度與上槽的長度近等(約20cm)。電泳時，加在兩塊垂直板凝膠上端的兩組樣品，分別在電場強度梯度增強和梯度減弱的雙垂直凝膠中同時自上而下地進行異型比照電泳。
應(yīng)用本發(fā)明的單不對稱性梯度電場電泳槽和電泳方法，陰離子(或陽離子)樣品在從電泳中線附近的樣品槽向正極(或負極)端的近全長凝膠中分離，產(chǎn)生的有益效果表現(xiàn)為(1)由于該電泳槽和電泳方法產(chǎn)生梯度增加的電荷效應(yīng)，顯著地增強凝膠分子篩效應(yīng)的分離效果，因而對于樣品中分子特性相近、現(xiàn)有電泳技術(shù)不易于或不能分離的生物大分子，可有效地分開；(2)樣品中各種生物大分子在凝膠中勻加速分離，因而譜帶均勻地分散于全長凝膠中，分辨力顯著提高；(3)結(jié)合SDS變性凝膠電泳所測定的樣品生物大分子的分子量，與該分子的遷移距離成線性關(guān)系，從而避免了現(xiàn)有電泳方法必須進行對數(shù)轉(zhuǎn)換并繪制標準分子量曲線的復(fù)雜程序，顯著提高測定的準確性，并降低對標準物復(fù)雜性的要求；(4)隨著凝膠長度的適當增加，電場梯度相應(yīng)增強，使電泳譜帶的分散度增加、分離的分子范圍擴大，從而進一步提高分離效果；(5)對于一定的樣品生物大分子混合物，使之有效分離所需的凝膠長度和電泳時間均比現(xiàn)有技術(shù)縮短，從而降低成本并提高工作效率。
應(yīng)用本發(fā)明的雙不對稱性梯度電場電泳槽和電泳方法，將樣品分別加在凝膠靠電極端的樣品槽和電泳中線附近的樣品槽中，可同時在電場強度梯度增加和梯度減弱的凝膠中分別進行異型電泳。除產(chǎn)生上述有益效果外，在電場強度梯度減弱的凝膠中，樣品中分子特性相差大、不粘連的大分子條帶得到不同程度的濃集，使這類條帶的清晰度和檢測靈敏度增加。因而通過對相同樣品在異型電場中電泳圖譜的比照分析，可增加信息量。


圖1是本發(fā)明的雙不對稱性梯度電場水平板電泳槽主要結(jié)構(gòu)部位和電泳方法示意圖，其中有一對白金絲電極(1)、凝膠支承架(2)、電泳中線(3)和樣品槽(4)的相對位置及電泳方向(5)。圖2是本發(fā)明的雙不對稱性梯度電場垂直板電泳槽的主要結(jié)構(gòu)示意圖，其中還有電極緩沖液上槽(6)和下槽(7)。
本發(fā)明的具體實施方案如下在一內(nèi)框長44cm、寬14cm、高8cm的長方形有機玻璃槽內(nèi)底部兩端，分別固定一根長度大于14cm、直徑為0.2mm的白金絲直線電極，并引入槽外與電極插孔連接；在槽內(nèi)底部距一端2cm至22cm之間，固定一長20cm、寬14cm、高4cm的中空(便于水循環(huán)冷卻)的凝膠支承架，并制作與之相匹配的可活動的水平制膠架(底面積接近20×14cm2)和多齒樣品梳；在制膠架上距一端1cm處，設(shè)定樣品梳插槽。即制成單不對稱性梯度電場水平板電泳槽。電泳前，先在預(yù)置好樣品梳的水平制膠架中灌制長度為20cm、寬近14cm、厚度為3mm的凝膠板，待凝膠充分凝固后，去樣品梳，使樣品槽所在的凝膠位置靠近電極間電泳中線、凝膠另一端靠近正電極；在電泳槽中加適宜的堿性電極緩沖液至剛好浸沒凝膠水平面；連接電極線；加樣后接通電源，進行穩(wěn)流或穩(wěn)壓電泳。即獲得本發(fā)明的單不對稱性梯度電場電泳槽及電泳方法的有益效果。
將上述電泳槽加長為46cm，凝膠支承架(2)改造為長40cm、高5cm、距槽兩端均為3cm(即位于槽中間)，并制作與之匹配、可活動的水平制膠架(底面積接近40×14cm2)和兩組同型多齒樣品梳；在制膠架上距一端1cm和21cm處，分別設(shè)定兩組樣品梳插槽。即制成雙不對稱性梯度電場水平電泳槽。制膠時，先在預(yù)置好兩組樣品梳的水平制膠架中灌制長度為40cm的板狀凝膠；電泳時，使凝膠上距一端1cm的樣品槽(4)位于負電極一側(cè)，則另一樣品槽(4)位于距電泳中線(3)1cm處。相同的兩組樣品分別在電場強度梯度增強和梯度減弱的半長凝膠中進行同一方向(5)的水平電泳，可獲得本發(fā)明的全部有益效果。
雙不對稱性梯度電場垂直板電泳槽，其上、下電極緩沖液槽的直視平面圖為近等大小的長方形，上槽(6)略小于下槽(7)，上槽外框為20cm×18cm×3cm，其中在上槽兩端的18cm×3cm端框上緣中央，設(shè)置16cm×2cm的凹缺；下槽內(nèi)框為22cm×20cm×4cm。兩根白金絲電極(1)分別位于上、下槽內(nèi)與槽寬度平行的各一側(cè)；雙垂直的凝膠支承架(2)(板狀)平面的高度(含上槽端框的2cm凹缺深度)為21cm。其制膠架和樣品梳結(jié)構(gòu)、制膠和加樣方法均類似現(xiàn)有技術(shù)，采用不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)(含濃縮膠3cm和分離膠)。電泳時，位于兩塊垂直板凝膠上端樣品槽中的兩組陰離子(或陽離子)樣品，由負極(或正極)向正極(或負極)方向，分別在電場強度梯度增強和梯度減弱的雙垂直凝膠中同時自上而下地進行異型電泳?？色@得本發(fā)明的全部有益效果。
權(quán)利要求
1.一種分離與分析生物大分子物質(zhì)的穩(wěn)直流電泳槽和電泳方法，其特征在于每一組樣品的分離膠及該凝膠的支承架(2)，位于正、負電極(1)之間電泳中線(3)一側(cè)的半電場即不對稱性梯度電場中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電泳槽和電泳方法，其特征在于正、負電極間的電泳距離增加一倍于現(xiàn)有電泳槽凝膠支承架的長度(10～20cm)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的單不對稱性梯度電場電泳槽和電泳方法，包括水平電泳槽和垂直電泳槽及相應(yīng)的電泳方法，其特征在于具有單排樣品槽(4)的凝膠一端位于電泳中線附近，凝膠另一端與電極(通常為正極)靠近；一組樣品在電場強度梯度增強的凝膠中電泳分離。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的雙不對稱性梯度電場水平板凝膠電泳槽和電泳方法，其特征在于具有雙排樣品槽的水平板凝膠及其支承架(2)，設(shè)置于正、負電極(1)之間的居中位置，并增加一倍于單排樣品槽凝膠支承架的長度(10-20cm)，兩組樣品梳的插槽分別定位在水平制膠架(與凝膠支承架相匹配)的一端部和中間線附近；電泳時，凝膠端部的樣品槽(4)與一電極靠近、凝膠上另一樣品槽(4)則位于電極間電泳中線(3)附近，兩組樣品分別在電場強度梯度增強和梯度減弱的半長凝膠中同時進行水平方向地電泳。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的雙不對稱性梯度電場垂直板凝膠電泳槽和電泳方法，其特征在于上、下電極緩沖液槽的直視平面圖為近等大小的長方形，上槽(6)略小于下槽(7)，兩根白金絲電極(1)分別位于上、下槽內(nèi)與槽寬度平行的各一底側(cè)，雙垂直的凝膠支承架(2)的高度與上槽的長度近等；電泳時，位于兩塊垂直板凝膠上端的兩組樣品，分別在電場強度梯度增強和梯度減弱的雙垂直凝膠中同時自上而下地電泳。
全文摘要
本發(fā)明是一種不對稱性梯度電場電泳槽及電泳方法,屬于生物技術(shù)的大分子分離與分析技術(shù)領(lǐng)域。該電泳槽中,具有單排樣品槽的凝膠及其支承架偏一電極設(shè)置,使凝膠具樣品槽的一端位于電泳中線附近、另一端與電極靠近。一組樣品在電荷效應(yīng)梯度增強的凝膠中電泳,可顯著提高分離效果和生物大分子條帶的分辨力。具有雙排樣品槽的凝膠及其支承架,設(shè)置于電極間居中位置,兩組樣品分別在電荷效應(yīng)梯度增強和梯度減弱的凝膠中同時進行比照電泳。
文檔編號G01N27/447GK1191310SQ9611705
公開日1998年8月26日 申請日期1996年8月8日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月8日
發(fā)明者方繼朝 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院