專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)定β A4肽聚集度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種確定βA4肽聚集度的方法，特別是使用一種合適的能與這種蛋白質(zhì)結(jié)合的試劑，通過(guò)該試劑與這種蛋白質(zhì)反應(yīng)后測(cè)定未與蛋白質(zhì)反應(yīng)的結(jié)合試劑量來(lái)檢測(cè)這種蛋白質(zhì)。
眾所周知，老年性癡呆病(Alzheimer氏病)患者的大腦中含有由-淀粉樣前體蛋白碎片形成的聚集體或團(tuán)塊，這些蛋白碎片被稱(chēng)作淀粉樣β-肽或βA4肽。這種含42個(gè)氨基酸的βA4肽的氨基酸序列為天冬氨酸-丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-組氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-甘氨酸-酪氨酸-谷氨酸-纈氨酸-組氨酸-組氨酸-谷氨酰胺-賴(lài)氨酸-亮氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-甘氨酸-絲氨酸-天冬酰胺-賴(lài)氨酸-甘氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-亮氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸-纈氨酸-異亮氨酸-丙氨酸(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA)。
有關(guān)βA4肽與老年性癡呆病的大體討論參閱文獻(xiàn)Dennis J.Selko，《科學(xué)美洲》(Scientific American)1991年11月，68-78以及Joseph T.Jarrett等《細(xì)胞》(Cell)，73，1055-1058(1993)。
對(duì)老年性癡呆病一個(gè)潛在的治療方法是應(yīng)用一種含有阻止βA4肽聚集或成團(tuán)塊的活性成分的藥物。因此，我們就需要進(jìn)行一個(gè)篩選試驗(yàn)來(lái)確定這種活性成分或有效的化合物。
對(duì)于測(cè)定蛋白質(zhì)本身，本領(lǐng)域內(nèi)有許多種檢測(cè)方法，如其中一種是利用Bradford染料，即我們通常所說(shuō)的考馬斯亮藍(lán)G250(CoomassieBrilliant Blue G250)。這一點(diǎn)請(qǐng)參閱文獻(xiàn)J.James Sedmak等，《分析生物化學(xué)》(Analytical Biochemistry)，79，544-552(1977)。在這篇文獻(xiàn)中，作者描述了測(cè)定蛋白質(zhì)的方法，但沒(méi)有有關(guān)βA4肽的無(wú)論是聚集態(tài)還是游離態(tài)的資料。
現(xiàn)在迫切需要建立一種檢測(cè)βA4肽的方法以對(duì)這些聚集狀態(tài)的蛋白質(zhì)和游離或非聚集狀態(tài)的蛋白質(zhì)加以區(qū)分并且反映出各種化合物對(duì)該蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)的效果。這一點(diǎn)上H.LeVine，《蛋白質(zhì)科學(xué)》(Protein Science)2，404-410(1993)描述了聚集的淀粉樣蛋白使用硫代黃素T(Thioflavin T)的檢測(cè)。

圖1圖解說(shuō)明βA4肽的非聚集程度與時(shí)間的關(guān)系圖2圖解說(shuō)明βA4肽的非聚集程度的可測(cè)定的特性本發(fā)明涉及一種確定βA4肽聚集度的方法，更具體地講，該方法包括將該蛋白質(zhì)與一種合適的結(jié)合試劑反應(yīng)，該試劑具有只與βA4肽的非聚集狀態(tài)結(jié)合的特性，反應(yīng)后形成一定數(shù)量的被蛋白質(zhì)結(jié)合的試劑。這樣就可以測(cè)定這種被蛋白質(zhì)結(jié)合的試劑量。
眾所周知，老年性癡呆病患者與非老年性癡呆病患者相比，他們大腦中含有被稱(chēng)作βA4肽的含39-42個(gè)氨基酸的淀粉樣蛋白質(zhì)。老年性癡呆病患者大腦中的這種蛋白質(zhì)的聚集或成團(tuán)，從而可對(duì)正常的腦細(xì)胞具有破壞作用，而一旦這些殺傷性的團(tuán)塊或聚集體形成，這種形成就幾乎是不可逆的。因此，一種潛在的老年性癡呆病的治療方法就是給予患者一種能阻止βA4肽形成聚集體或團(tuán)塊的化合物或藥物。
現(xiàn)發(fā)現(xiàn)潛在用于治療老年性癡呆病的化合物可以通過(guò)篩選試驗(yàn)來(lái)確定，此篩選試驗(yàn)可顯示那些被選樣的候選化合物在體外是否對(duì)βA4肽的聚集有抑制作用。
我們選取了一種適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合試劑。這種試劑或者對(duì)非聚集的淀粉樣肽即βA4肽有選擇性反應(yīng)，或者與聚集的淀粉樣肽發(fā)生選擇性反應(yīng)但不與被篩選的候選化合物發(fā)生反應(yīng)，而在這種反應(yīng)形式中，也就是說(shuō)一旦和這種肽反應(yīng)便顯示出一種可測(cè)量的特性，例如在一定的波長(zhǎng)的光的吸收。一些較合適的結(jié)合試劑包括Bradford染料或稱(chēng)考馬斯亮藍(lán)G250，剛果紅(CongoRed)及硫代黃素T。其中尤其合適的一種結(jié)合試劑是Bradford染料。Bradford染料就是考馬斯亮藍(lán)G250。有關(guān)Bradford染料或考馬斯亮藍(lán)G250的描述參見(jiàn)M.Bradford，《分析生物化學(xué)》，72，248(1976)；A.H.Reisner等，《分析生物化學(xué)》，64，509(1975)；S.Fazukes de St.Groth等，《生物化學(xué)生物物理學(xué)學(xué)報(bào)》(Biochim.Biophys.Acta)71，377(1963)以及J.J.Sedmack等《分析生物化學(xué)》，79，544(1977)，而且這種染料在商業(yè)上是一種標(biāo)準(zhǔn)試劑，(如，加利福尼亞州Hercules伯樂(lè)生命科學(xué)集團(tuán)(Bio-Rad Life Science Group，Hercules，California)提供的蛋白質(zhì)檢測(cè)濃縮顯色試劑)。這種染料只與非集聚的淀粉樣肽βA4反應(yīng)而不與任何集聚的淀粉樣肽反應(yīng)。
剛才我們提到過(guò)有關(guān)Bradford染料的資料(Marion M.Bradford，《分析生物化學(xué)》，72，248-254(1976))，所謂Bradford染料是0.01％(重量/體積)(W/V)考馬斯亮藍(lán)G250，1.7％(W/V)乙醇和8.5％(W/V)磷酸。由伯樂(lè)公司提供的貨號(hào)為500-0006的蛋白質(zhì)檢測(cè)商用濃縮顯色試劑是在Bradford染料基礎(chǔ)上的改進(jìn)近似0.04％(W/V)的考馬斯亮藍(lán)G250溶解于含25％甲醇、50％磷酸及25％水中。這一更改使它更加穩(wěn)定，并延長(zhǎng)了其貨架壽命，由于減少了磷酸的含量使得它的生物危害性減小而不影響它與蛋白質(zhì)結(jié)合的性質(zhì)。它還以如下兩種標(biāo)準(zhǔn)之一的試劑盒的形式供應(yīng)試劑盒1(與牛γ球蛋白)，目錄號(hào)500-0001；試劑盒2(與牛血清白蛋白)，目錄號(hào)500-0002。
實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)準(zhǔn)備好已知濃度的淀粉樣肽，也就是非聚集狀態(tài)的βA4肽。這種非聚集狀態(tài)的βA4肽是通過(guò)利用象Millipore 9050型(MilliporeModel 9050)肽合成儀這種常規(guī)肽合成儀進(jìn)行肽合成而獲得的。例如將10毫克的肽在合適的溫度(如20-25℃)下溶解于一些合適的有機(jī)溶劑如二甲基亞砜(DMSO)或乙腈中配成貯存液(如2,500μM)。這種貯存液可用磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)常規(guī)稀釋(如10倍)成對(duì)照液(如250μM)。先取一份對(duì)照液(如16μL)加入144μL磷酸鹽緩沖鹽水后與25μL結(jié)合劑如Bradford染料反應(yīng)，這樣，結(jié)合劑與非集聚的淀粉樣蛋白反應(yīng)就形成了第一濃度或數(shù)量的結(jié)合了蛋白的結(jié)合劑。這一與結(jié)合劑發(fā)生的反應(yīng)是在結(jié)合劑只選擇性地與非聚集蛋白結(jié)合的條件下完成的。因此，反應(yīng)的條件取決于所選取的特殊的結(jié)合劑以及所要測(cè)量的結(jié)合特性。例如，如要選用Bradford染料，結(jié)合反應(yīng)一般在中性或稍稍偏堿也就是pH值7.0-7.4的環(huán)境中在20-25℃溫度下進(jìn)行5-15分鐘。
根據(jù)反應(yīng)的結(jié)合劑的特性選取合適的檢測(cè)方法，將用此方法測(cè)得的第一份蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合劑的濃度或量記為第一個(gè)值X1(如用Bradford染料時(shí)在波長(zhǎng)595nm下的吸光度為0.7)。
另取第二份對(duì)照液，由于βA4肽的聚集是在一段時(shí)間內(nèi)形成的，所以第二份在適合的溫度下(如37℃左右)孵育一段合適的時(shí)間(如24-72小時(shí))使它形成聚集體，然后加入結(jié)合劑并只與非聚集狀態(tài)的淀粉樣肽反應(yīng)，形成了第二個(gè)濃度或量的與蛋白結(jié)合的或稱(chēng)反應(yīng)的結(jié)合劑。由于聚集的淀粉樣肽不與結(jié)合劑發(fā)生反應(yīng)，這樣，這部分就不能被檢測(cè)到。再測(cè)量被蛋白結(jié)合的結(jié)合劑的量(如在一定的波長(zhǎng)(如595nm)及室溫下用分光光度計(jì)測(cè)用Bradford染料反應(yīng)后的吸光度)，就得到了第二個(gè)值X2，它代表已經(jīng)與非聚集的淀粉樣肽反應(yīng)的結(jié)合劑的量。
隨著聚集體的產(chǎn)生，結(jié)合或稱(chēng)已反應(yīng)的結(jié)合劑的濃度與已發(fā)生的聚集程度成反比，因此，第二個(gè)值X2比第一個(gè)值X1小就提示βA4肽已發(fā)生了一定程度的聚集。
為了能夠定性地篩選能夠治療老年性癡呆病的化合物，取同等量的第三份對(duì)照液，將它加入候選的化合物后，同樣在合適的條件下孵育一段時(shí)間(如37℃孵育48小時(shí))，之后加入合適的結(jié)合劑，如Bradford染料，并檢測(cè)此液體或混合物，如用普通的分光光度計(jì)進(jìn)行分光測(cè)定，得到一個(gè)反應(yīng)的結(jié)合劑的值。如果此候選的化合物沒(méi)有抗聚集的作用，則得到的這個(gè)值X3近似等于X2；相反，如果X3比X2大30-40％，則可認(rèn)為這個(gè)候選的化合物具有抑制淀粉樣肽聚集的作用。
為了實(shí)施上述的篩選試驗(yàn)，淀粉樣肽相對(duì)選擇的結(jié)合劑的濃度典型地應(yīng)在1500-1800的范圍(淀粉樣肽/結(jié)合劑)；淀粉樣肽對(duì)候選的化合物的濃度典型地應(yīng)地在4-40倍(候選的化合物/淀粉樣肽)。
聚集的程度可以用下面的方法定量地檢測(cè)出來(lái)。首先將同等份數(shù)的對(duì)照液按一系列時(shí)間段進(jìn)行孵育，隨著時(shí)間的增加，聚集的程度也加大，在每段孵育時(shí)間結(jié)束時(shí)加入結(jié)合劑，如Bradford染料，并進(jìn)行測(cè)量，如在595nm波長(zhǎng)下測(cè)用Bradford染料后的吸光度，這樣，就可得出每個(gè)時(shí)間段的聚集了的淀粉樣肽與所對(duì)應(yīng)的非聚集的淀粉樣肽的濃度或百分比。結(jié)合劑可衡量非結(jié)合(或結(jié)合)的蛋白。用新鮮蛋白所得的數(shù)值(非聚集蛋白，X1)減去這一數(shù)值就可計(jì)算出聚集的淀粉樣肽的量并用百分比表示。這樣就可以得到象圖1所示的那樣一條在一系列時(shí)間點(diǎn)上(如24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)及96小時(shí))及所對(duì)應(yīng)的未聚集的肽的百分比的反比曲線。上述操作步驟均相同，只是在每個(gè)孵育時(shí)間段加結(jié)合劑并測(cè)量此混合物以得到X值。這樣聚集或非聚集的肽的相互關(guān)系就可以通過(guò)分光光度計(jì)所讀出的X值(如圖1所說(shuō)明的用Bradford染料時(shí)在595nm波長(zhǎng)下的吸光度)建立起來(lái)。正象圖1所說(shuō)明的那樣，得到了一條由所讀取的X值對(duì)應(yīng)非聚集蛋白的百分比的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，而從中可以得到已聚集蛋白的百分比。
一種具體的候選化合物所得到的X值就可以象圖2所說(shuō)明的那樣，通過(guò)與對(duì)照的對(duì)比而定量地以抑制蛋白聚集的百分比的方式得出來(lái)。
實(shí)施例1將β淀粉樣肽(又稱(chēng)做βA4)按10mg/ml(或2500μM)的濃度溶于100％的二甲基亞砜(DMSO)中。在測(cè)定前將其用pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋到1mg/ml(或250μM)并按每孔16μl的量加入到96孔板的每一樣品孔中(最終的濃度是25μM)。所有的處理均一式三份。
在這一實(shí)例中，候選的化合物按三種濃度(250μM，500μM和1mM)加入試驗(yàn)孔中。每一孔的總體積用PBS加到160μl。對(duì)照孔中則不加入化合物只用PBS將體積加至160μl。用保護(hù)膜將96孔板封起并在37℃孵育48小時(shí)。
孵育結(jié)束后，將板取出并向所有帶樣品的孔中加入25μlBio-Rad蛋白檢測(cè)染色試劑(Bradford染料)。同時(shí)利用新鮮肽(被認(rèn)為是未聚集的)的吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。用吸量管將染料混勻并將板在2500轉(zhuǎn)/分(rpm)的速度下快速離心以去除氣泡。
加入染料15分鐘后用Dynatech MR5000讀板儀在595nm波長(zhǎng)讀取吸光度。由于加入了一種含8個(gè)氨基酸的(谷氨酰胺-賴(lài)氨酸-亮氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-谷氨酸，QKLVTTAE)叫作A41920t肽的候選化合物，從未處理的聚集肽與處理的聚集肽之間的差計(jì)算出β淀粉樣肽聚集的下降百分比。在A41920t分別為250μM、500μM及1mM(或1000μM)的不同濃度時(shí)，下降的百分比分別是48.1％、52.44％及32.26％。
實(shí)施例2重復(fù)實(shí)例1的步驟，只是向含有16μl的1mg/ml的淀粉樣肽的孔中加入10μl 30％的過(guò)氧化氫。向那些孔中加入134μl的PBS使其最終體積為160μl。將板封好在37℃孵育48小時(shí)。
孵育結(jié)束后，象實(shí)例1那樣將板取出，并向每個(gè)含樣品的孔中加入25μl的Bio-Rad蛋白檢測(cè)染色試劑(Bradford染料)。同樣利用新鮮肽(被認(rèn)為是未聚集的)的吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。用吸量管將染料混勻并將板在2500轉(zhuǎn)/分(rpm)的速度下快速離心以去除氣泡。
加入染料15分鐘后用Dynatech MR5000讀板儀在595nm波長(zhǎng)讀取吸光度。通過(guò)減去背景并分析新鮮的及被過(guò)氧化氫處理過(guò)的β淀粉樣肽的吸光度之差來(lái)估測(cè)聚集的量。這種差值用超過(guò)新鮮或未聚集的肽的百分比來(lái)表示。在48小時(shí)后聚集的百分比為97.7％。
實(shí)施例3將過(guò)氧化氫用萄糖胺聚糖及多硫酸戊聚糖替代，其余步驟同實(shí)例2。聚集增加的百分比分別是40.8％(0.5μM時(shí))、57.1％(5μM時(shí))及62.9％(50μM時(shí))。
實(shí)施例4將A41920t用1-(5′-氧代己基)-3-甲基-7-丙基-2，6-(1H，3H)-嘌呤二酮(又稱(chēng)作丙戊茶堿)取代，其余的步驟同實(shí)例1。聚集減少的百分比分別為29.68％(500μM)和37.4％(1mM或1000μM)。序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名Hoechst Marion Roussel，Inc.(B)街道2110E.Galbraith Rd.，P.O.Box 156300(C)城市Cincinnati(D)州Ohio(E)國(guó)家美利堅(jiān)合眾國(guó)(F)郵編(ZIP)45215-6300(G)電話513-948-7369(H)傳真513-948-7961(I)電傳214320(ii)發(fā)明名稱(chēng)測(cè)定βA4肽聚集度的方法(iii)序列數(shù)目1(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM兼容PC機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentln Release#1.0，Version#1.30(EPO)(vi)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 08/515,606(B)申請(qǐng)日1995年8月16日(2)有關(guān)序列1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度42個(gè)氨基酸(B)類(lèi)型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)漕?lèi)型線形(ii)分子類(lèi)型蛋白(xi)序列描述序列1Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys1 5 1015Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile20 25 30Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala35 40
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定βA4肽聚集度的方法，包括(a)使用一種合適的能與βA4肽結(jié)合的試劑與它發(fā)生反應(yīng)，該試劑具有只與βA4肽的非聚集狀態(tài)結(jié)合的特性，反應(yīng)后形成一定數(shù)量的無(wú)蛋白質(zhì)的結(jié)合試劑；以及(b)測(cè)量被蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合試劑的所述量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述合適的結(jié)合試劑是在游離狀態(tài)與被蛋白結(jié)合狀態(tài)間顯示光譜學(xué)特征的可檢測(cè)差別的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述合適的結(jié)合試劑包括考馬斯亮藍(lán)G250染料。
4.一種確定抑制βA4肽聚集的化合物的方法，包括(a)用一種合適的結(jié)合試劑與含有游離的βA4肽的樣品反應(yīng)一段合適的時(shí)間，以形成蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合劑從而得到蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合劑樣品；(b)測(cè)量所說(shuō)蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合劑樣品得到第一個(gè)與蛋白結(jié)合的結(jié)合劑的量相關(guān)的參考測(cè)量值；(c)所說(shuō)的蛋白結(jié)合的結(jié)合劑樣品與所選的候選化合物反應(yīng)一段合適的時(shí)間以形成一個(gè)試驗(yàn)樣品；及(d)測(cè)量試驗(yàn)樣品得到第二個(gè)參考測(cè)量值，確定第一個(gè)與第二個(gè)參照測(cè)量值差別的程度。
5.根據(jù)權(quán)梨求4的方法，其中所述合適的結(jié)合試劑是在游離狀態(tài)與被蛋白結(jié)合狀態(tài)間顯示光譜學(xué)特征的可檢測(cè)差別的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述結(jié)合試劑包括Bradford試劑。
全文摘要
公開(kāi)了一種檢測(cè)β A4肽聚集度的方法。該方法包括用能夠只與非聚集態(tài)β A4肽結(jié)合的適當(dāng)結(jié)合試劑與該蛋白反應(yīng),形成一定量的蛋白結(jié)合的結(jié)合試劑。然后測(cè)定蛋白結(jié)合的結(jié)合試劑的量。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1193385SQ96196312
公開(kāi)日1998年9月16日 申請(qǐng)日期1996年7月23日 優(yōu)先權(quán)日1995年8月16日
發(fā)明者S·格亞爾, J·W·保爾, N·G·里德?tīng)? S·R·薩哈斯拉布赫 申請(qǐng)人:赫徹斯特馬里恩魯斯公司