專利名稱：用于治療糖尿病的由人熱激蛋白60衍生的新型肽類,其組合物、制法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一些新型肽類即人60KDa熱激蛋白(hsp60)的表位(抗原決定簇)和包含用于診斷與治療胰島素依賴性糖尿病(IDD M)的一些醫(yī)藥組合物。發(fā)明背景1型糖尿病，或者IDDM，是一種由T細胞引起的自體免疫疾病，該T細胞攻擊和消滅位于胰島中產(chǎn)生胰島素的β細胞(Castano和Eisen-barth，1990)。最終成為IDDM的自體免疫過程，開始和發(fā)展時沒有癥狀。只有當β細胞累積損失超過殘留β細胞供給胰島素的能力(量)時，這種病才在臨床上有所表現(xiàn)。的確，葡萄糖體內(nèi)平衡穩(wěn)定的破壞和臨床IDDM，被認為僅在80-90％的β-細胞被免疫系統(tǒng)滅活后才發(fā)生。因此，被確診患有IDDM的病人，必然處于其β細胞自體免疫破壞的晚期階段。而且，初期的臨床前糖尿病的診斷，只能在自體免疫過程開始之后通過檢測β細胞自體免疫性的免疫學標示物而知。因而，醫(yī)療的探索是要找到一個安全的、專一的和有效的方法來關(guān)閉已經(jīng)處于發(fā)展中的自體免疫過程。
本發(fā)明的發(fā)明者們以前曾經(jīng)考察了這一問題，是通過研究NOD(非肥胖型糖尿病)品系小鼠正在發(fā)展中的一些自發(fā)性糖尿病，NOD小鼠被認為是一種人IDDM的可信模型(Castano and Eisenbarth，1990)。NOD小鼠大約生長4周時產(chǎn)生了胰島炎，它開始為一種輕微的胰島周圍浸潤并發(fā)展成嚴重的胰島內(nèi)炎癥。證實為胰島素缺乏的高血糖癥，在我們被試群體中約生長14-17周的雌鼠中，開始產(chǎn)生。在生長35-40周時，幾乎所有的雌NOD小鼠都得了嚴重的糖尿病并在無胰島素治療的情況下大多數(shù)死亡。雄性NOD小鼠有較低的發(fā)病率，原因還不清楚。NOD小鼠的糖尿病已證明是由自體免疫T細胞引起(Bendelac et a1.，1978)。
對各種抗原的T細胞的反應(yīng)性和自體抗體，已經(jīng)在人IDDM病人身上及NOD小鼠體內(nèi)檢測到(Elias，1994)，并且還不清楚是否對任何一個單一的靶抗原的免疫性為該病的主要原因。除了對病因的探討之外就是對治療方法的探討。
已經(jīng)證明，初始NOD小鼠體內(nèi)自體免疫過程能夠得到預(yù)防，辦法是將小鼠在產(chǎn)生糖尿病之前進行各種處理，諸如限制飲食，病毒感染，或者免疫系統(tǒng)的非特異性刺激(Bowman et al.，1994)。NOD糖尿病也可通過對抗原谷氨酸脫羧酶誘發(fā)前糖尿病小鼠的免疫耐受性而得到預(yù)防(Kaufman etal，1993；Tisch et al.，1993)。
在NOD雌鼠體內(nèi)自生發(fā)展的胰島素依賴性糖尿病已證明與各種自身抗原免疫反應(yīng)性有聯(lián)系(Bach，1994)。在這些抗原中，明顯的是來自哺乳動物60KDa熱激蛋白(hsp60)分子序列的P277肽。這相當于人hsp60分子中的殘基437-460(Elias et al.，1991，以色列專利申請?zhí)朜O.94241，PCT專利申請公開WO90/10449)。這種人P277肽具有如下序列Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile-Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp(a.a.437-460 of SEQ ID NO1)前糖尿病NOD小鼠顯示出自生的致糖尿病T細胞應(yīng)答，即對hsp60和對人(2)或鼠P277肽(3)一些變異體作出應(yīng)答。小鼠和人的肽的區(qū)別在于1個氨基酸，這些肽是免疫學上交叉反應(yīng)的(3)。小鼠的某些不易患糖尿病的品系，例如C57BL/6，當用共價共軛于一外來免疫原載體分子(4)上的P277進行免疫時，便會出現(xiàn)短暫的高血糖和胰島炎。并且C57BL/KSJ品系的小鼠會產(chǎn)生對hsp60和對P277的自發(fā)T細胞應(yīng)答，在用能誘發(fā)自體免疫糖尿病(5)的非常低劑量β-細胞毒素鏈脲菌素(STZ)處理之后。
除涉及疾病的表現(xiàn)之外，肽P277還表現(xiàn)出在治愈自體免疫過程是有功能作用的皮下給藥在不完全Freund佐劑(IFA；礦物油)中的P277，會導(dǎo)致阻止年青NOD小鼠(2)或有晚期胰島炎的已生長12-17周NOD小鼠(6，7)的疾病發(fā)展。無論人(6，7)和小鼠(3)的P277的變異體，都是有效的。在MHC11類啟動子上轉(zhuǎn)入hsp60基因的NOD轉(zhuǎn)基因小鼠，顯示出向下調(diào)節(jié)它們的自發(fā)T-細胞增殖應(yīng)答，并且大部分小鼠可避免產(chǎn)生糖尿病(8)。而且，對一些C57BL/KsJ小鼠施用P277，能夠抑制自體免疫糖尿病的產(chǎn)生，在曾經(jīng)接受早期很低STZ劑量的一些小鼠中；但用GAD65分子肽治療小鼠是無效的(9)。
P277肽的一些變異體，其中有一個或兩個半胱氨酸殘基在位6和11上被纈氨酸殘基代替，被分別定名為P277(val6)，P277(Val11)和P277(val6-val11)，這已描述于相應(yīng)的以色列專利申請NO.112094，并顯示出在治療糖尿病方面活性如同P277。
本發(fā)明的目的是提供另外一些人hsp60肽類，這些肽類將有效地用于診斷和治療IDDM。發(fā)明概述在研究人hsp60分子的一些片段和肽類過程中，料想不到地發(fā)現(xiàn)一些IDDM病人和NOD小鼠會對另外一些hsp60 T細胞抗原決定簇有應(yīng)答，后者可用于IDDM的診斷和治療。這些表位(抗原決定簇)本身或與P277或P277變異體相結(jié)合，這些變異體是選自P277(val6)，P277(val11)和P277(val6-val11)，可以改善治療的有效性。
這些新肽類示于表1表1.Hsp 60合成肽類及其序列肽類 SEQ ID NO1中的殘基序號氨基酸序列(一字編碼)p3 31-50 KFGADARALMLQGVDLLADAp10136-155 NPVEIRRGVILAVDAVIAELp11151-170 VIAELKKQSKPVTTPEEIAQp12166-185 EEIAQVATISANGDKEIGNIp14195-214 RKGVITVKDGKTLNDELEIIp18255-274 QSIVPALEIANAHRKPLVIIAp20286-305 LVLNRLKVGLQVVAVKAPGFp24346-365 GEVIVTKDDAMLLKGKGDKAp29421-440 VTDALNATRAAVEEGIVLGGp30436-455 IVLGGGCALLRCIPALDSLTp32466-485 EIIKRTLKIPAMTIAKNAGVp35511-530 VNMVEKGIIDPTKVVRTALLp39343-366 GKVGEVIVTKDDAM另外一些hsp60肽類，包括定名為P278(相當于在人hsp60序列中的458-474位)，P19(相當于在人hsp60序列中的271-290位)以及P21(相當于在人hsp60序列中的301-320位)，已證明是無效的。已發(fā)現(xiàn)，P278的氨基末端與有效P277肽有三個殘基(NOD)的重迭及P278的羧基末端與有效P32肽由有9個殘基(EIIKRTLKI)的重迭。因而P32的其余11個殘基(PAMTIAKNAGV)是關(guān)鍵性的。
因而本發(fā)明涉及示于表1中的肽類，及其鹽類和功能衍生物。
本發(fā)明進一步的目的是提供一些方法和試劑盒，用本發(fā)明的肽類進行早期診斷IDDM。在IDDM產(chǎn)生過程中，動物會表達hsp60分子，或者一些與其有交叉反應(yīng)的分子，它們能找到適當途徑進入動物的血液和尿中。它們也能表達專門指向這些分子的一些抗體和T細胞。因而，在β細胞被完全破壞和病人注定要成為終生糖尿病之前，血液或尿中存在的hsp60(或與其為交叉反應(yīng)的一些分子)或?qū)ζ渚哂刑禺愋缘囊恍┛贵w或T細胞，都可用于檢測IDDM過程。
在某一病人體內(nèi)IDDM的存在或初始，可通過檢測病人的血液或尿而診斷，即利用本發(fā)明的肽P12或P32作為抗原檢測其中存在的能與人hsp60發(fā)生免疫反應(yīng)一些抗體或T細胞。
因而，本發(fā)明提供了一種方法用于診斷病人體內(nèi)IDDM的存在或初始，包括用本發(fā)明的一種肽作為抗原來檢測所說病人是否存在能與hsp60產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗-hsp60抗體或T細胞，以此一種表明存在能與hsp60產(chǎn)生免疫反應(yīng)的抗hsp60抗體或T細胞的陽性結(jié)果，即指示IDDM存在或初始的高的幾率。
在診斷IDDM的方法中，可對病人檢測是否存在抗hsp60抗體，其中所說的檢測方法可包括一放射性免疫試驗或一ELISA試驗。
對病人還可檢測其是否存在能與hsp60進行免疫反應(yīng)的T細胞。在本發(fā)明這方面一實施例中，試驗方法包括一T細胞增殖檢驗，該檢驗包括如下步驟(I)由病人身上采集的血樣中制備含T細胞的單核細胞級分；(II)向所說的單核細胞級分中添加一種選自本發(fā)明的肽的抗原；(III)在所說的抗原存在下溫育所說的細胞級分，經(jīng)過一適當時間和于一些適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下；(IV)在溫育期結(jié)束前的適當時間向(III)的細胞培養(yǎng)物中，添加一種標記的核苷酸以使所說的標記的核苷酸摻入增殖的T細胞的DNA中；以及(V)通過分析摻入到所說T細胞中的標記核苷酸的量來測定增殖T細胞的量。
在上述步驟(IV)中，所說的標記核苷酸最好是3H-胸(腺嘧啶脫氧核)苷。測定增殖T細胞的量，是用標準方法通過計算T細胞的刺激指數(shù)而得。
在本發(fā)明這方面的另一實施例中，試驗方法包括T細胞的細胞因子(Cytokine)應(yīng)答試驗，其中步驟(I)至(III)與上述T細胞增殖試驗相同，及在第4步(IV)中細胞因子，例如由應(yīng)答的淋巴細胞分泌到培養(yǎng)基中的IFN-r，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα或TGFβ等的存在，是用標準方法用商品試劑盒檢測的。
另一方面，本發(fā)明提供了一種體內(nèi)檢測方法，其中將選自本發(fā)明一些肽類的一種抗原通過皮下注射到病人體內(nèi)，并且觀測出現(xiàn)的可測皮膚反應(yīng)(延遲類型的過敏性；DTH)。
本發(fā)明還涉及一種進行這些試驗的裝置以及進行這些試驗用的一些試劑盒(Kits)。這些試劑盒可被制備成可用于完成本發(fā)明需進行各種試驗的任何一種。每個這樣的試劑盒，包括要進行一項試驗或固定數(shù)目的一些試驗需要的所有材料。例如可用于測定抗hsp60抗體的存在的試劑盒可包含有本發(fā)明的一種固相固定化肽和一標記的抗體，該標記抗體能夠識別要檢測的抗hsp60抗體的恒定區(qū)域，例如標記的抗人Fab。這種試劑盒還可包括使用這種試劑盒的說明書及盛放試劑盒材料的一些容器。任何普通標記物均可使用，例如放射同位素，酶，發(fā)色團或熒光團。典型的放射同位素是碘-125或硫-35。用于這一目的的酶類，包括辣根過氧化物酶，辣根半乳糖苷酶及堿性磷酸(酯)酶。
通過檢測抗hsp60抗體的存在來診斷IDDM存在的試劑盒包括(I)選自本發(fā)明肽類的一種抗原；及(II)能夠識別要檢測的抗hsp60抗體的恒定區(qū)域的一種標記杭體。
通過檢測能與hsp60進行免疫反應(yīng)的T細胞的存在，來診斷IDDM存在的一試劑盒包括(I)選自本發(fā)明肽類的一種抗原；(II)一種適用的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)淋巴細胞(T細胞)；及(III)一種標記的核苷酸用于T細胞增殖試驗，或一種細胞因子，例如干擾素—伽馬試劑盒，用于細胞因子試驗。
對體內(nèi)試驗，該試劑盒僅包括一種本發(fā)明的肽，為注射用的適當形式。
本發(fā)明進一步涉及一種用于預(yù)防或治療IDDM的方法。接種本發(fā)明的一種抗原肽能夠向下調(diào)節(jié)對該抗原的自體免疫性，并有效地產(chǎn)生對IDDM的自體免疫過程的抵抗性。同樣也可以接種對這些抗原有特異性的T細胞或其碎片或活性部分，該T細胞以減毒或無毒力形式存在或在經(jīng)過處理以改善其抗原性之后。如果病人已處于IDDM的臨床前發(fā)病階段，注射這樣一種抗原或T細胞(或其部分)能夠向下調(diào)節(jié)這種抗原的自體免疫性，因而在遭受嚴重的，永久性損傷之前能夠抑制自體免疫。這種肽還能用作一種治療劑來抑制自體免疫過程，甚至已遠遠發(fā)展到后期，例如本發(fā)明的一些發(fā)明人最近在實驗室用肽P277治療NOD小鼠的結(jié)果所示(Elias and Cohen，1994)。
因而，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的制劑，包含有(a)對一種與本發(fā)明的肽具有免疫交叉反應(yīng)性的蛋白或肽已產(chǎn)生出特異性的T細胞，這種細胞已在上述肽存在下溫育而活化；(b)已被照射或以其它方式減毒的上述T細胞；(c)已經(jīng)過處理的上述T細胞，處理包括利用流體靜力學壓力進行壓力處理，用化學交聯(lián)劑處理和/或用一種細胞骨架交聯(lián)劑處理；(d)由上述(a)、(b)或(c)脫落的一些碎片或表面蛋白；或者(e)基本上由對所說的蛋白有特異性的上述(a)受體的可變區(qū)域所組成的一種肽，或其鹽、功能衍生物、前體或活性部分。
在本發(fā)明一優(yōu)選實施例中，該制劑包含有人T細胞，它在體外與本發(fā)明的所說的肽接觸已產(chǎn)生出特異性。
本發(fā)明也提供了一種預(yù)防和治療IDDM的藥物組合物，包括一種藥用可接受的載體和作為活性組分的、有效量的本發(fā)明的肽、其鹽或功能衍生物。
本發(fā)明進一步涉及一種預(yù)防和治療IDDM的方法，包括給需要治療的病人施用一種醫(yī)藥組合物，其中含有本發(fā)明的一種肽，其鹽或功能衍生物，或者一種制劑，其中包含有對本發(fā)明的上述肽已產(chǎn)生出特異性的T細胞。
附圖簡述圖1說明本文所提及的肽在人hsp60分子完整序列上所處位置。
圖2說明NOD小鼠對人hsp60肽P12，P32，P277(val6-val11)及P278的T-細胞增殖應(yīng)答。
圖3是表示NOD小鼠T-細胞對一些肽的增殖應(yīng)答。將3個NOD鼠為一組的n組鼠用溶于IFA(不完全Freund佐劑)中的肽類鼠P12，鼠P277，GAD-P35及MT-P278處理，每個的劑量為25μg在IFA中。在10天之后將導(dǎo)流淋巴結(jié)取出并試驗其對濃度為5、10、20及50μg/ml相當?shù)碾牡脑鲋硲?yīng)答。顯示了在最佳濃度20μg/ml時的刺激作用。在一些培養(yǎng)基對照中得到了如下范圍的cpm計數(shù)小鼠P12，811；小鼠P277，1243；MT-P278，698；以及GAD-P35，1430。肽鼠P38是由鼠hsp60(556-573)衍生的一種肽，它與被試驗的一些肽類沒有序列同源性并被用作一種特異性的負對照樣品。這些實驗是所完成的三次實驗的代表。每次實驗作三份，其SD值由一些柱狀圖表示。在各肽類之間無交叉反應(yīng)性(未示出)。
圖4顯示了肽施用對糖尿病的作用。10-20 NOD小鼠的鼠組，是生長10周的小鼠，用溶于IFA的100μg的鼠P12.P277，P35-GAD及MT-P278或用IFA單獨處理。對這些小鼠每月抽取血樣并觀察高血糖的發(fā)作。與單獨IFA處理的對照組相比較，用P12和P277治療的小鼠大大地得到了保護，P＜0.05。
圖5表示對肽處理應(yīng)答的IgG1，IgG2a及IgG2b抗體同種型小鼠的處理如對圖

所述。對單個樣品進行針對小鼠P12A；P277B；GAD-P35C；及MT-P278D的IgG1，IgG2a及IgG2b同種型抗體的分析。在兩次實驗中得到了相似的效果。這些結(jié)果以每組中的10個單獨小鼠在405nm光吸收(O.D即光密度)表示。在組A和組B中的IgG1，IgG2b抗體存在的水平與C和D組相比顯著水平為P＜0.001。在組A和B中與IgG2a抗體相比在IgG1與IgG2b抗體的水平之間的差別是顯暑的(P＜0.001)。在各抗體之間無交叉反應(yīng)性(未示出)。
圖6表示了各抗體與血液葡萄糖之間沒有關(guān)系。將一組NOD雌鼠用P12(10個小鼠)或用IFA單獨處理(9個小鼠)，如對圖4的插圖描述中所述?？筆12特異性抗體的量(ELISA在血清稀釋1∶50情況下的光密單位，對生長7個月的小鼠測量)對生長7個月小鼠血液葡萄糖濃度作圖。高抗體與血液葡萄糖之間的相關(guān)程度，是P＜0.002。
圖7表示一個IDDM病人供血者的T細胞增殖應(yīng)答(S.I.，即刺激指數(shù))，即對回憶(recall)抗原，對hsp60蛋白以及對hsp60合成肽類的應(yīng)答。
圖8表示一個健康供血者的T細胞增殖應(yīng)答，(S.I.)，即對回憶抗原，對hsp60及對hsp60合成肽類的應(yīng)答。
圖9說明另一IDDM病人供血者的T細胞增殖應(yīng)答(S.I)，即對回憶抗原，對hsp60以及對hsp60合成肽類的應(yīng)答。
圖10A和10B說明兩個IDDM病人供血者的T細胞增殖應(yīng)答，(S.I)，即對hsp60合成肽類的應(yīng)答。
發(fā)明的詳細描述在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求中所提到的“本發(fā)明的肽”或任何一個個體名稱如“肽P12”或“肽P32”等，也包括它們的鹽類和功能衍生物，只要它們保留了這些肽對糖尿病的生物學活性。
本發(fā)明的肽類的“鹽類”在發(fā)明中是指它們的生理學上可接受的有機和無機鹽類。
本文所使用本發(fā)明的肽類的“功能衍生物”包括這樣一些衍生物，它們可通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法制自在氨基酸殘基上以側(cè)鏈存在的一些官能團或N-或C-末端基團，只要保持生理上的可接受性，亦即它們不破壞這種肽的活性，對含有它們的藥用組合物不賦予毒性以及對其抗原性能沒有相反的效應(yīng)，它們也包括在本發(fā)明中。
這些衍生物可以，例如，包括脂肪族羧基酯類，羰基酰胺類即羰基與氨或與伯胺或仲胺的反應(yīng)產(chǎn)物，氨基酸殘基的自由氨基與?；湺?例如烷?；蛱辑h(huán)芳酰基)反應(yīng)形成的一些N一?；苌?，或自由羥基(例如絲氨酸或蘇氨酸殘基)與?；湺嗡纬傻囊恍㎡-?；苌铩?br> 本發(fā)明的肽類，可在醫(yī)藥組合物中用作免疫原，特別是用于減輕和治療IDDM的疫苗，以及作為診斷組合物中的抗原用于診斷IDDM。用已知方法制備的這些藥物或診斷組合物，也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明的醫(yī)療組合物可以口服或進行非腸胃道給藥，例如皮下、肌肉、靜脈、鼻內(nèi)或直腸給藥。
通過下面的一些實施例和附圖對本發(fā)明作非限制方式的說明。
實施例材料與方法(I)小鼠NOD/Lt品系的一些近親繁殖的雌鼠，是由以色列雷霍沃特的魏茨曼(Weizman)科學研究所的動物繁殖中心提供，或由在BarHarbor，ME的Jackson實驗室提供。這些小鼠在生長14至17周自發(fā)產(chǎn)生了類似人IDDM的自體免疫糖尿病。
(II)抗原。肽類是在魏茨曼科學研究所的有機化學部使用一自動多種肽合成器(Abimed model AMS 422；Langenfeld，德國)合成的，是按照該公司的N-a-芴基甲氧基羰基(Fmoc)合成方法進行的。粗產(chǎn)物的純化，是用反相HPLC(高性能液體色譜)在半制備C8一柱(Lichrosorb RP-8，7mm，250×10mm，Merck，達姆斯塔特，德國)上進行。通過線性梯度洗脫得到了各肽的洗脫液，該線性梯度是在0.1％三氟乙酸溶于水中與0.1％三氟乙酸溶于75％乙腈在水中(V/V)之間形成的。一些單一肽產(chǎn)品的純度測定，是用分析反相HPLC和氨基酸分析器進行。肽MT-P278來自分支桿菌屬hsp60的序列(431-447)。肽P277是在天然序列中位6和位11的半胱氨酸(C)被纈氨酸(V)所替代而產(chǎn)生的。兩個C殘基被V替代，大大增強了這種肽的穩(wěn)定性，而不影響其免疫活性V-取代的肽，與天然肽是完全交叉反應(yīng)的，經(jīng)過T細胞和抗體試驗。除非特別說明，所指的是人的序列。鼠P12和鼠P38肽類，都是衍生自鼠hsp60分子并分別相當于其168-188，437-460以及556-573序列。肽GAD-P35是衍生自GAD65分子(524-543)。本文中所用的所有肽類的氨基酸序列，列示于表2。
表2.合成肽類及其序列肽類 SEQ ID NO氨基酸序列(一字編碼)p3 1(31-50) KFGADARALMLQGVDLLADAp101(136-155)NPVEIRRGVMLAVLAVIAELp111(151-170)VIAELKKQSKPVTTPEEIAQp121(166-185)EEIAQVATISANGDKEIGNIp141(195-214)RKGVITVKDGKTLNDELEIIp181(255-274)QSIVPALEIANAHRKPLVIIAp201(286-305)LVLNRLKVGLQVVAVKAPGFp241(346-365)GEVIVTKDDAMLLKGKGDKAp291(421-440)VTDALNATRAAVEEGIVLGGp301(436-455)IVLGGGCALLRCIPALDSLTp321(466-485)EIIKRTLKIPAMTIAKNAGVp351(511-530)VNMVEKGIIDPTKVVRTALLp391(343-366)GKVGEVIVTKDDAMp191(271-290)LVIIAEDVDGEALSTLVLNRp211(301-320)KAPGFGDNRKNQLKDMAIATp278 1(458-474)NEDQKIGIEIIKRTLKIp277(Val) 2 VLGGGVALLRVIPALDSLTPANEDmouse p12 3 EEIAQVATISANGDKDIGNIMT-p2784 EGDEATGANIVKVALEAGAD-p355 SRLSKVAPVIKARMMEYGTTmouse p38 6 PGMGAMGGMGGGMGGGMF
(III)對肽類應(yīng)答而產(chǎn)生的T細胞增殖小鼠，將生長9周的NOD小鼠或其它品系的小鼠在后足爪墊中用0.1ml的含有25μg肽的乳液進行免疫，肽是置于完全Freund佐劑(CFA；Difco，Detroit，MI)與等體積的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。在10天后取出導(dǎo)流蟈淋巴結(jié)并在各種肽類(5μg/ml)存在下使用[3H]-胸(腺嘧啶脫氧核)苷摻入法(Elias et al.，1991)檢測三份培養(yǎng)基中的淋巴細胞懸浮物中的增殖情況。這些結(jié)果以刺激指數(shù)(SI)表示在試驗肽存在下的平均cmp與無肽的對照培養(yǎng)物的平均cmp之比。標準誤差總是小于平均值的10％。
(IV)治療處理和隨后觀察。將在PBS中的100mg肽類與等體積的IFA進行乳化并通過皮下注入到生長10周的NOD雌鼠，如已述方法(Elias andcohen，1995)。對照小鼠的給藥僅為在IFA中的等體積的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)。用血液葡萄糖傳感器(Medisene.INC.，Waltham，MA)每月監(jiān)視在上午10點鐘的非禁食血液葡萄糖。血液葡萄糖大于11.1mmol/L的小鼠被認為已患糖尿病；這種葡萄糖濃度比在無糖尿病小鼠中測得的平均血液葡萄糖濃度大3個標準偏差點(deviations)(Elias and Cohcn，1995)。胰島的組織觀察是用蘇木精和暑紅(四溴熒光素)對切片染色進行。這些切片由兩個觀察者單獨評定，他們不了解各鼠組的實情況。利用卡方試驗(Chisquare test)來確定各種治療之間的統(tǒng)計學差別。
(V)血清抗體，小鼠每月取血檢測抗體應(yīng)答。用已述方法進行ELISA試驗(ELisa et al.，1991)。簡言之，將一些平底Maxisorb板(Nunc，Roskilde，丹麥)涂抹以檢測抗肽抗體，涂抹以100ml/孔的肽于PBS中，濃度為10mg/ml，室溫經(jīng)過2小時，隨之在4℃溫育過夜。在用肽溫育之后，將這些板沖洗并以7％BSA(Sigma)在PBS中在37℃封閉2小時。將血清稀釋1∶50然后加入，在37℃經(jīng)過2小時，隨后用100ml/每孔的山羊抗小鼠IgG(伽馬鏈F C特異的)溫育2小時，后者是結(jié)合于堿性磷酸酯酶(Jackson，philadelphia，賓夕法尼亞)。在沖洗之后，將這些板與底物，二乙醇胺(Sigma)溫育并用-ELISA讀出機在405nm讀出。
實施例1.NOD小鼠中hsp60表位的定位試驗NOD小鼠中hsp60肽類P12.P32，P277(val6-val11)及P278的免疫原性，是在鼠后足爪墊中用在CFA中乳化了的肽類使鼠免疫，在10天之后，試驗排出淋巴結(jié)細胞的增殖應(yīng)答，如上節(jié)(III)所述。如表2所示，肽類中P277(val6-val11)，P12及P32是強烈免疫原的，而P278是非免疫原的。
實施例2用P277(val6-val11)，P12或P32治療NOD小鼠為了試驗看P12和P32肽類是否能夠像P277(val6-val11)一樣來阻滯糖尿病的發(fā)展，將P277(val6-val11)，P12或P32肽類(100μg在0.1ccIFA乳液中)以皮下注射施用給Jackson實驗室(Bar-Harbor，ME)的10-12個生長9周的NOD/Lt雌鼠。糖尿病，確定為穩(wěn)定血液葡萄糖水平超過11.1mmol/l，對生長25周的小鼠作了檢測。對照小鼠是未給藥處理或用P278處理。
如表3所示，P277(val6-val11)，P12及P32治療糖尿病是有效的，在未處理的小鼠中或在P278處理的小鼠中糖尿病的發(fā)病率為90％，而P277(val6-val11)，P12及P32處理的小鼠的發(fā)病率分別為10％、20％、30％。另一方面，對照P278肽沒有治療作用。
表3 hsp60肽類的治療效果肽 糖尿病(％)死亡率(％)受試者數(shù)目none 90 50 100p278 90 45 100p277(val6-val11) 10*5*100p1220*10*10P3250*25*20*P＜0.05可能兩種或三種hsp60表位肽類相結(jié)合會比僅一種肽更有效，這由于多種T細胞種群在這樣的治療中受到影響。實施例3剛新診斷的IDDM病人對hsp60，277(val6-val11)，P12及P32顯示出T細胞增殖應(yīng)答為測定T細胞對各種hsp60肽類的應(yīng)答，曾從最近診斷(2周至4個月)為IDDM患者的外周血液中取淋巴細胞，試驗T細胞增殖。將10-20ml的血液移入含有肝素(heparin)作為凝血劑的無菌管中用PBS 1∶2稀釋；分離外周單核細胞(PBMC)，通過用在Lymphoprep Layer離心分離血液。檢驗PBMC在三份樣品中T細胞增殖，在各種抗原(10μg/ml)存在下經(jīng)過6天，使用[3H]胸(腺嘧啶脫氧核)苷摻入法作為增殖的檢測方法。所試驗的抗原為人hsp60或hsp60肽類P277(val6-val11)，P12及P32以及對照肽P278。T細胞的增殖應(yīng)答可用刺激指數(shù)(SI)來描述SI是T細胞的肽刺激胸(腺嘧啶脫氧核)苷摻入與背景(無抗原加入)胸(腺嘧啶脫氧核)苷引入之間的比例。
這些結(jié)果可綜合如下表4表4. 對下述肽的T細胸增殖應(yīng)答(SI)患者hsp60 p277(V) p12p32p27815.64.5 4.01.10.527.55.0 4.51.30.838.05.6 1.27.10.743.41.0 1.92.90.951.21.1 1.71.0N.D.
66.71.3 5.24.5N.D.
710.3 3.9 1.26.0N.D.
81.31.2 1.51.1N.D.大于2.0的刺激指數(shù)被認為是正(陽)性應(yīng)答。
N.D＝未測定；P277(V)＝P277(Val6-Val11)。
可以看出，大多數(shù)患者對hsp60(6/8)有應(yīng)答，并且所有hsp60有應(yīng)答的6個患者也對至少三種hsp60肽類之一有應(yīng)答P12，P32或P277(Val6-Val11)。因而，對這組肽的應(yīng)答，可用于表征對完整hsp60分子應(yīng)答的個體。
實施例4T細胞增殖應(yīng)答在前糖尿病NOD小鼠中曾對鼠P277肽反應(yīng)而產(chǎn)生的自發(fā)T細胞應(yīng)答作過試驗(Elias et al.，1991；Birk et al.，1996)，并試驗了其對較大片段鼠hsp60分子的應(yīng)答，后者含有鼠P277序列(Birk et al.，1996)。為了檢測鼠hsp60分子上其它T細胞表位，將這些鼠用互相重迭的hsp60序列的肽庫處理，發(fā)現(xiàn)所有小鼠對鼠P277和對鼠P12均作出了強烈反應(yīng)(應(yīng)答)(圖3)。對NOD小鼠為免疫原的其它肽類有MT-P278肽(在分支桿菌hsp60分子中的殘基458-474)和GAD-P35(在GAD65分子中的殘基524-543)。圖3說明MT-P278為強烈免疫原性，同鼠P277和鼠P12一樣；GAD-P35也是免疫原的，但卻較低。
對生長3-16周的雌性NOD小鼠作縱向(Longitudinal)研究表明，在其脾中(未示出)對鼠P12沒有自發(fā)性反應(yīng)，雖然觀察到了對鼠P277和完整鼠hsp60均有應(yīng)答。因而，在4個免疫原肽中，包括P12和P277來自鼠hsp60分子，GAD-P35來自與糖尿病有關(guān)的GAD65分子，及MT-P278為一種外來免疫原，僅對鼠P277和對MT-P278檢測到了自發(fā)應(yīng)答。
肽治療處理按照曾顯示可用于鼠P277的方法(Elias et al.，1991；Elias andCohen，1994；Elias and Cohen，1995)，對生長10周的雌性NOD小鼠用在IFA中乳化的每一種肽(100mg)一次皮下注射進行處理。觀測小鼠出現(xiàn)糖尿病的情況，直到生長8個月。圖4表明，肽鼠P277和鼠P12均在抑制糖尿病發(fā)生方面有效(P＜0.05)。相比之下，用肽MT-P278或GAD-P35處理，與單獨用IFA處理沒有什么差別。3次實驗的結(jié)果基本上相同?？贵w類用鼠肽P277成功地治療STZ一誘發(fā)的糖尿病，與出現(xiàn)抗肽抗體并主要為IgG1和IgG2b同種型有聯(lián)系(Elias ant Cohen，1996)。因而又檢測了肽處理過的NOD小鼠的血清抗體。圖5表明，兩種肽對抑制糖尿病有效，它們?yōu)槭驪12和鼠P277，同時對誘發(fā)IgG1和IgG2b同種型的強抗體效價也是有效的(P＜0.001)。在這些試驗組中，IgG1和IgG2b抗體效價也大大高于IgG2a抗體效價(P＜0.001)。用肽MT-P278或CAD-P35處理的小鼠的應(yīng)答并不強烈；GAD-35處理過的小鼠沒有任何一個產(chǎn)生出特異性IgG1抗體，并且在10個MT-P278處理過的小鼠中僅有兩個產(chǎn)生出IgG1同種型抗體。用MT-P278或CAD-P35處理過的小鼠，產(chǎn)生了很低滴度的一些IgG2b抗體(P＜0.001)。因而，抑制糖尿病方面的有效性是與誘發(fā)抗體應(yīng)答并且主要為IgG1和IgG2b同種型抗體應(yīng)答有聯(lián)系。
有效治療應(yīng)答與抗體效價之間的關(guān)系是通過生長7個月的小鼠個體中血液葡萄糖濃度與抗體濃度比較來證實的。圖6表明，具有較高效價的抗鼠P12抗體趨于有較低的血糖濃度；反之，用鼠P12處理過的小鼠，產(chǎn)生出很少的針對鼠P12的抗體，趨于有較高的血糖(P＜0.002)。
討論本實施中提出的一些結(jié)果表明，鼠hsp60分子的肽P12，與肽P277一樣，在治療接近明顯高血糖暴發(fā)的小鼠可說是有效的。與P277相反，在前糖尿病NOD小鼠的脾中，沒有觀察到對P12反應(yīng)的自發(fā)T細胞增殖應(yīng)答。因而，在外周血中可檢測到的自發(fā)抗肽增殖應(yīng)答，對于一種肽阻滯糖尿病自體免疫過程并不是必須的。
肽P277并非唯一能調(diào)節(jié)NOD糖尿病的hsp60肽這一觀察意義重大?？梢韵胂?，在NOD糖尿病中hsp60的參與，可能是由于hsp60的P277肽與一些更特異于β-細胞的未知分子之間的相像而引起的(Cohen，1991)。然而，兩個不同的hsp60片段，P277和P12，完全不可能均相像于提出的但未知的β-細胞分子的片段。在肽治療中P12的有效性支持這樣的結(jié)論，即在糖尿病中起作用的hsp60類分子是hsp60本身(Birk et al，1996)。
肽MT-P278和GAD-P35不能抑制糖尿病的產(chǎn)生與發(fā)展，說明并不是任何一種自身抗原或任何一種自發(fā)的T細胞增殖抗原能夠用于抑制自體免疫過程。有趣的是，MT-P278不能誘發(fā)高效價的抗體或保護性，雖然事實是它們的肽對T細胞是強烈免疫原性的(未發(fā)表的觀點評論)。然而，誘發(fā)任何特異性的抗體不一定能對NOD糖尿病有作用；用BSA治療NOD小鼠，它誘發(fā)了高效價的抗體以及強烈的T細胞應(yīng)答(未示出)，但卻未抑制糖尿病的發(fā)生(Elias and Cohen，1994)。雖然我們沒有發(fā)現(xiàn)GAD-P35像其它肽類那樣對T細胞是強烈的免疫原性肽(圖3)，然而一些NOD小鼠的實驗報告證明對其肽有自發(fā)的T細胞應(yīng)答(Kaufman et al.，1989)。
最后，有效治療與誘發(fā)對肽有特異性的抗體之間的聯(lián)系說明，P12和P277的醫(yī)療作用可能與Th2-型T細胞的活化有關(guān)，后者有助于誘發(fā)一些特異性的IgG1抗體，和通過IL-4的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)的一些抗體(Mossman andCoffman，1993)。這些T細胞能夠抑制Thl T細胞，它被認為破壞β-細胞(Katz et al.，1995；Liblau et al.，1995)。的確，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)P277肽治療NOD糖尿病是與脾中產(chǎn)生IL-4和IL-10 T細胞的猛增有聯(lián)系，并且與在脾中和在胰島中產(chǎn)生INF-γ的T細胞下降有關(guān)(未發(fā)表的報告)。對肽應(yīng)答時攜帶Th2同種型的肽一特異性抗體的出現(xiàn)，似乎是有利應(yīng)答的指標。
實例5IDDM患者可表現(xiàn)出T細胞應(yīng)答的其它肽類共有26個新近診斷的(在IDDM診斷后1-16周)IDDM病人記錄案例。病人的年齡范圍是從5歲到60歲。按照他們對人hsp60和對人hsp60合成肽類(示于表1和表5)，即部分人hsp60蛋白序列，的反應(yīng)所產(chǎn)生的外周血液T細胞增殖應(yīng)答，對這些病人作了篩選分類。
還分析了病人的T細胞對一些標準記憶抗原諸如破傷風類毒素，念珠菌(Candida albecans)以及流感病毒等的反應(yīng)所產(chǎn)生的T細胞增殖的應(yīng)答，并且如果刺激指數(shù)(S.I.)為2或更大則認為是陽性(見下述)。
利用如下方法檢驗了增殖情況細胞制備和細胞增殖方法從IDDM病人身上或從健康對照人身上抽取50ml外周血液并補充以10IU/ml的肝素。加入2體積的PBS(其中無鈣和鎂)。用10ml的小管混合血液-PBS制劑。將10ml體積的Ficoll加入血液混合物，隨后在室溫20-24℃以2.000rpm離心分離30分鐘(brake off)。用10ml移液管收取在buffy層中的外周血液T細胞并轉(zhuǎn)移到一個新的50ml試管中。將體積30至40mlPBS(無鈣和鎂)加入到收取的T細胞中。將這種物質(zhì)混合并在室溫下以1.000rpm離心分離20分鐘(brake on)。
將上清液吸出，并將細胞團再懸浮于無AIM-V血清的培養(yǎng)液中(GIBCO.USA)。培養(yǎng)基含有AIM-V補充以1％的丙酮酸鈉，1％的L-谷氨酰胺(每個200mM)，1％的青霉素/鏈霉素(10.000U/ml/10.000mg/ml)及2％的Hepes(1M，pH7.3)?；蛘呤褂肦PMI補充以來自血庫的10％AB血清。然后將細胞混合物在室溫以2.000rpm離心分離10分鐘(brakeon)。將上清液再吸出并將細胞團再懸浮在一個較小體積的新鮮AIM-V中(10-20ml)。將細胞再懸浮和計數(shù)。用錐蟲蘭對細胞計數(shù)和細胞存活性進行檢測。對這一步是使用血球計和光顯微鏡。
然后將細胞濃度調(diào)節(jié)到2×106細胞/ml于AIM-V介質(zhì)中。將每孔中體積為100μl的細胞轉(zhuǎn)移到96孔微滴定板的每個孔中。然后加入100μl介質(zhì)，該介質(zhì)含有2倍所推薦的抗原濃度(參見下面的抗原和濃度表)。試驗進行四份。4個孔是用無抗原的細胞和介質(zhì)作為對照進行試驗。將這些板在37℃下在5％CO2濕潤的孵化器中培養(yǎng)7天。在培養(yǎng)期的第6天，加入1μCi/孔的3H-胸(腺嘧啶脫氧核)苷。將培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)18小時，然后收取。細胞增殖是通過向DNA中摻入3H-胸(腺嘧啶脫氧核)苷進行檢測的，這是用閃爍液體和β-計數(shù)器讀出器確定的。
試驗過的一些抗原 濃度破傷風類毒素(Connaught Lab，Inc，Pen.美國) 5g/ml白色的念株菌(Miles，wa.美國) 20μg/ml重組人hsp60(StressGen，加拿大)2-5μg/ml人hsp60合成肽類 20μg/ml增殖應(yīng)答的測定是按照T細胞DNA中胸(腺嘧啶脫氧核)苷3H的摻入進行的(Elias et al.，1991)。在使用被試驗的一些抗原，或作為對照的無抗原(僅用介質(zhì))培養(yǎng)的細胞之間比較了每分鐘的放射性計數(shù)(CPM)。其增殖數(shù)值以刺激指數(shù)(S.I.)表示有抗原的平均CPM除以無抗原的平均CPM。S.I.值大于或等于2者，便被認為是正陽性的。
這些結(jié)果表明，人hsp60或hsp60-肽反應(yīng)性個體的比率在IDDM病人中(為84％)高于在健康人中的比率(30％)。Fisher精確試驗的差別P值為0.0044，這是很顯著的。
兩個代表性IDDM病人和一個健康個人的增殖應(yīng)答，即對hsp60合成肽類，和對各種回憶抗原反應(yīng)產(chǎn)生的增殖應(yīng)答，表示于圖7，8及9。表5說明兩個hsp60合成肽類(P19，P21)的個別例子，即沒有IDDM病人對其反應(yīng)和應(yīng)答(也見圖10A和10B)。
可以看出，每一個病人對回憶抗原(Candida，破傷風類毒素，或流感病毒)以及人hsp60蛋白質(zhì)和各種人hsp60肽類有響應(yīng)。對照人僅對對照回憶抗原有響應(yīng)。
表1顯示了至少一個IDDM病人有響應(yīng)的hsp60合成肽類的序列。每一個這種肽對治療IDDM具有潛在的治療作用。
表5 IDDM病人對其沒有響應(yīng)的hsp60合成肽類及其序列肽類SEQ ID No1中的殘基序號氨基酸序列(一字編碼)P19 271-290LVIIAEDVDGEALSTLVLNRP21 301-320KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT上述一些具體實施例已充分揭示了本發(fā)明的一般性質(zhì)，致使其他人能夠，應(yīng)用本領(lǐng)域熟知的知識(包括本文引用的參考文獻內(nèi)容)，容易地改變和/或?qū)⑦@些具體實施例適應(yīng)于各種應(yīng)用，無需作更多實驗，但都不脫離本發(fā)明的一般概念。因此，這些適應(yīng)和改變都應(yīng)落在已揭示的這些實施例的等同含義和范圍內(nèi)，都是基于本發(fā)明的教導(dǎo)。很清楚，本發(fā)明說明書中的用語和術(shù)語是用于描述目的而不是用于限制，因而本說明書的一些術(shù)語和用語能被普通技術(shù)人員按照本發(fā)明的教導(dǎo)和結(jié)合以本技術(shù)領(lǐng)域的人的知識得到解釋。參考文獻Bach JF.(1994)為一種自身免疫病的胰島素依賴性糖尿病。《內(nèi)分泌述評》15516-542。
Bendelac A.，Carnaud C.，Boitard C.，bach JF.(1987)自身免疫糖尿病從非肥胖型糖尿病小鼠向健康新生小鼠的有性生殖傳遞。對L3T4+ Ly+-2+T細胞的要求?！秾嶒炨t(yī)學雜志》166823-32。
Birk Os.，Elias D.，Weiss AS，Rosen A.，Van-der Zee R.，walker MD，CohenIR.(1996)非肥胖糖尿病小鼠糖尿病普遍存在的小鼠hsp60是自體免疫T細胞的β-細胞靶抗原?！蹲泽w免疫雜志》，9159-166。
Bowman MA，leiter EH and Atkinson MA.(1994)非肥胖型糖尿病小鼠的糖尿病防治牽涉人類疾病治療作用《今日免疫學》，15115-20。
Castano L.，Eisenbarth GS.(1990)l型糖尿病人、小鼠和家鼠慢性自體免疫疾病?！睹庖邔W年度述評》，8647-79。
Cohen IR.(1991)在關(guān)節(jié)炎和糖尿病病理中對侶伴蛋白的自體免疫，《免疫學年度述評》，9567-589。
E1ias，Dana.(1994)非肥胖型糖尿小鼠一種用于自體免疫胰島依賴性糖尿病的模型?！蹲泽w免疫糖尿病模型》，為參考手冊指南，第147-61頁。
Elias D.，Cohen IR.(1995)用熱激蛋白60肽p277治療非肥胖型糖尿病小鼠自體免疫糖尿病和胰島炎。《糖尿病》，441132-1138。
Elias D.，Reshef T.，Birk OS.，Van der Zee R.，walker MD.，CohenIR.(1991)。用人65 Kda熱激蛋白的T細胞表位(抗原決定簇)接種抗自體免疫小鼠糖尿病?！睹绹鴩铱茖W院院刊》，883088-91。
Elias D.and Cohen IR.(1994)對非肥胖型糖尿病小鼠的糖尿病的肽治療。《柳葉刀》(英國一家醫(yī)學期刊名)，343704-706。
Elias D.，Cohen IR(1996)hsp60肽p277防止由毒素鏈脲菌素誘發(fā)的自體免疫糖尿病?！短悄虿　?正在印刷中)。
Katz JD，Benoist C.，Mathis D.(1995)。在胰島素依賴性糖尿病中的T助細胞亞組?！犊茖W》，2681185-1188。
Kaufman DL.，Clare-Salzler M.，Tian J.，F(xiàn)orsthuber T.，Ting GSP，Robinson P.，AtkinsonMA，Sercarz EE，tobin AJ，Lehmann PV.(1993)。在鼠類胰島素依賴性糖尿病中T細胞對谷氨酸脫羧酶耐受性的自發(fā)損失。《自然》36669-72。
Liblau RS，Singer SM，McDevitt HO.(1995)在器官特異自體免疫疾病的病理中的Th1和Th2CD4+T細胞。
《今日免疫學》1634-38。
Mossman TRR，Coffman RL.(1989)TM1和TH2細胞不同的淋巴因子分泌圖樣導(dǎo)致不同的功能性質(zhì)。《免疫學年度述評》9145-173。
Tisch R.，Yang XD，Singer SM，Liblav RS，F(xiàn)uggar L.，McDevitt HO.(1993)在非肥胖糖尿病小鼠體內(nèi)對谷氨酸脫羧酶的免疫應(yīng)答與胰島炎的聯(lián)系。《自然》36672-75。序列表(1)總信息(i)申請人(A)名稱耶達研究與發(fā)展有限公司(B)街道P.O.B Box 95(C)城市Rehovot(E)國家Israel(F)郵編76100(G)電話972-8-9470617(H)傳真972-8-9470739(A)姓名Irun R.COHEN(B)街道H Hankin Street(C)城市Rehovot(E)國家Israel(F)郵編76354(A)姓名Dana ELIAS(B)街道57 Derech Yavne(C)城市Rehovot(E)國家Israel(F)郵編78344(A)姓名Rivka ABULAFIA(B)街道31/11 Weizmann Street(C)城市Yahud(E)國家Israel(F)郵編56000(A)姓名Jana BOCKOVA c/o Ms.Joan Fraser，NYS/Pediatrics，SUNY Health Sciences Center(B)街道11th Floor，Room 040(C)城市Stony Brook(D)洲 N.Y.
(E)國家USA(F)郵編11794(ii)發(fā)明名稱用于治療糖尿病的由人熱激蛋白60衍生的新型肽類、其組合物、制法及試劑盒(iii)序列數(shù)目6(iV)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(Vi)在先申請資料(A)申請?zhí)朓L 114407(B)申請日1995年6月30日(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度573氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(Xi)序列描述SEQ ID NO1Met Leu Arg Leu Pro Thr Val Phe Arg Gln Met Arg Pro Val Ser Arg1 5 10 15Val Leu Ala Pro His Leu Thr Arg Ala Tyr Ala Lys Asp Val Lys Phe20 25 30Gly Ala Asp Ala Arg Ala Leu Met Leu Gln Gly Val Asp Leu Leu Ala35 40 45Asp Ala Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val Ile Ile50 55 60Glu Gln Gly Trp Gly Ser Pro Lys Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val65 70 75 80Ala Lys Ser Ile Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn Ile Gly Ala Lys85 90 95Leu Val Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu Glu Ala Gly Asp Gly100 105 110Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ser Ile Ala Lys Glu Gly Phe115 120 125Glu Lys Ile Ser Lys Gly Ala Asn Pro Val Glu Ile Arg Arg Gly Val130 135 140Met Leu Ala Val Asp Ala Val Ile Ala Glu Leu Lys Lys Gln Ser Lys145 150 155 160Pro Val Thr Thr Pro Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala165 170 175Asn Gly Asp Lys Glu Ile Gly Asn Ile Ile Ser Asp Ala Met Lys Lys180 185 190Val Gly Arg Lys Gly Val Ile Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu Asn195 200 205Asp Glu Leu Glu Ile Ile Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr Ile210215 220Ser Pro Tyr Phe Ile Asn Thr Ser Lys Gly Gln Lys Cys Glu Phe Gln225 230 235 240Asp Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys Ile Ser Ser Ile Gln Ser245 250 255Ile Val Pro Ala Leu Glu Ile Ala Asn Ala His Arg Lys Pro Leu Val260 265 270Ile Ile Ala Glu Asp Val Asp Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Leu275 280 285Asn Arg Leu Lys Val Gly Leu Gln Val Val Ala Val Lys Ala Pro Gly290 295 300Phe Gly Asp Asn Arg Lys Asn Gln Leu Lys Asp Met Ala Ile Ala Thr305 310 315 320Gly Gly Ala Val Phe Gly Glu Glu Gly Leu Thr Leu Asn Leu Glu Asp325 330 335Val Gln Pro His Asp Leu Gly Lys Val Gly Glu Val Ile Val Thr Lys340 345 350Asp Asp Ala Met Leu Leu Lys Gly Lys Gly Asp Lys Ala Gln Ile Glu355 360 365Lys Arg Ile Gln Glu Ile Ile Glu Gln Leu Asp Val Thr Thr Ser Glu370 375 380Tyr Glu Lys Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asp Gly385 390 395 400Val Ala Val Leu Lys Val Gly Gly Thr Ser Asp Val Glu Val Asn Glu405 410 415Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Val420 425 430Glu Glu Gly Ile Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile435 440 445Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp Gln Lys Ile Gly450 455 460Ile Glu Ile Ile Lys Arg Thr Leu Lys Ile Pro Ala Met Thr Ile Ala465 470 475 480Lys Asn Ala Gly Val Glu Gly Ser Leu Ile Val Glu Lys Ile Met Gln485 490 495Ser Ser Ser Glu Val Gly Tyr Asp Ala Met Ala Gly Asp Phe Val Asn500 505 510Met Val Glu Lys Gly Ile Ile Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala515 520 525Leu Leu Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala Glu Val530 535540Val Val Thr Glu Ile Pro Lys Glu Glu Lys Asp Pro Gly Met Gly Ala545 550 555 560Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Phe565 570(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度24氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val Ile Pro Ala Leu Asp1 5 10 15Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO3Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala Asn Gly Asp Lys Asp1 5 10 15Ile Gly Asn Ile20(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度17氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Lys Val Ala Leu Glu1 5 10 15Ala(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度20氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO5Ser Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Ile Lys Ala Arg Met Met Glu1 5 10 15Tyr Gly Tnr Thr20(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度18氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(XI)序列描述SEQ ID NO6Pro Gly Met Gly Ala Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly1 5 10 15Met Phe
權(quán)利要求
1.選自表1所示的肽類的一種肽，其鹽類及其功能衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的肽，本文稱作P12。
3.如權(quán)利要求1所述的肽，本文稱作P32。
4.如權(quán)利要求1所述的肽在診斷胰島素依賴性糖尿病(以下叫做IDDM)中的應(yīng)用。
5.一種用于診斷病人患有或初發(fā)IDDM的方法，包含用權(quán)利要求1所述的肽作為抗原檢驗所說病人的血液或尿中與人hsp60發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體或T細胞的存在。
6.如權(quán)利要求5所述的一種方法，包含檢驗所說患者中與hsp60發(fā)生免疫反應(yīng)的抗hsp60抗體或T細胞的存在，其中指示與hsp60發(fā)生免疫反應(yīng)的抗hsp60抗體或T細胞存在的陽性結(jié)果，表示患有或開始患有IDDM。
7.如權(quán)利要求5或6所述的一種方法，其中對所說的患者檢測抗hsp60抗體的存在。
8.如權(quán)利要求7所述的一種方法，其中該檢測方法包括一種放射性免疫檢測。
9.如權(quán)利要求7所述的一種方法，其中該檢測方法包含一種ELISA試驗。
10.一種用于按照權(quán)利要求5至9任何一項的方法，通過檢測抗hsp60抗體的存在來診斷IDDM的試劑盒，包含(i)一種抗原，它為權(quán)利要求1中序列的肽；和(ii)一種標記抗體，它能夠識別待測的所說抗hsp60抗體的恒定區(qū)域。
11.如權(quán)利要求10所述的一種試劑盒，其中所說的抗原是如權(quán)利要求2所述的肽。
12.如權(quán)利要求10所述的一種試劑盒，其中所說的抗原是如權(quán)利要求3所述的肽。
13.如權(quán)利要求10至12中任何一項所述的一種試劑盒，其中所說的抗原是固定在固(體)相上。
14.如權(quán)利要求10至13中任何一項所述的一種試劑盒，還包括在診斷IDDM中使用試劑盒的教導(dǎo)指示。
15.如權(quán)利要求10至14中任何一項所述的一種試劑盒，其中該標記物是選自由放射性同位素類，酶類，發(fā)色團類及熒光團類所組成的一組。
16.如權(quán)利要求5至6所述的一種方法，其中所說的患者是被檢測其是否存在能與hsp60發(fā)生免疫反應(yīng)的T細胞。
17.如權(quán)利要求16所述的一種方法，其中該檢測方法包含一種T細胞增殖檢驗，后者包括以下各步驟(i)由得自所說患者的血樣中制備含T細胞的單核細胞級分；(ii)從權(quán)利要求1所述肽中選擇一種抗原加入到所說的單核細胞級分中；(iii)在所說抗原存在下溫育所說的細胞級分，經(jīng)過適當?shù)臅r期和在適當?shù)囊恍l件下；(iv)在所說溫育期終之前適當時間將一種標記的核苷酸加入到(iii)的溫育細胞培養(yǎng)物中，以備所說的標記核苷酸摻入到增殖T細胞的DNA中；以及(v)通過分析所說T細胞中標記核苷酸摻入的量來測定增殖T細胞的量。
18.一種用于按照權(quán)利要求5，6及17中任何一項所述的方法通過檢測與hsp60反應(yīng)的T細胞的存在來診斷IDDM的試劑盒，包含(i)一種選自權(quán)利要求1所述肽的抗原；(ii)一種標記的核苷酸；以及(iii)一種用于培養(yǎng)淋巴細胞的適當?shù)呐囵B(yǎng)基。
19.如權(quán)利要求18所述的試劑盒，還包含在診斷IDDM中使用試劑盒的教導(dǎo)指示。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該檢測方法包含一T細胞細胞因子應(yīng)答試驗，后者包含如下一些步驟(i)從得自所說患者的血樣中制備含T細胞的單核細胞級分；(ii)將從權(quán)利要求1所述肽中選擇的抗原加入到所說的單核細胞級分中；(iii)在所說抗原存在下溫育所說的細胞級分經(jīng)過適當時間和在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下；以及(iv)測定由應(yīng)答淋巴細胞分泌到培養(yǎng)基中的細胞因子的存在。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該細胞因子是1FN-r，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，TNFα或TGFβ。
22.一種用于按照權(quán)利要求5，6，20及21中任何一項所述的方法，通過檢驗?zāi)芘chsp60進行免疫反應(yīng)的T細胞的存在來診斷IDDM的試劑盒，包含(i)一選自權(quán)利要求1所述肽的抗原；(ii)一用于培養(yǎng)淋巴細胞的適當?shù)呐囵B(yǎng)基；以及(iii)一檢測試劑盒，用于測定由應(yīng)答淋巴細胞分泌到培養(yǎng)基中的細胞因子的存在。
23.如權(quán)利要求22所述的一種試劑盒，進一步包括在診斷IDDM時使用試劑盒的教導(dǎo)指示。
24.如權(quán)利要求16所述的一種方法，其中將一種選自權(quán)利要求1所述的肽的抗原皮下注入到患者體內(nèi)，并觀察可檢測的皮膚反應(yīng)發(fā)生。
25.一種用于預(yù)防和治療IDDM的制劑包含(a)T細胞，它已對一種與權(quán)利要求1所述的肽有免疫學交叉反應(yīng)性蛋白或肽產(chǎn)生出特異性，該細胞已由在所說肽存在下溫育而被活化(b)所說的T細胞已經(jīng)被照射過或以其它方法被減毒；(c)所說的T細胞已經(jīng)受過流體靜力學壓力的壓力處理、化學交聯(lián)劑的處理和/或用細胞骨架交聯(lián)劑處理；(d)一些(a)、(b)或(c)的碎片或從其上脫落的表面蛋白質(zhì)；或者(e)一種肽，它基本上是由對所說蛋白有特異性的(a)的受體的可變區(qū)域組成，或者其鹽、功能衍生物、前體或活性部分。
26.如權(quán)利要求25所述的制劑，其中(a)的所說的T細胞是人T細胞，及所說的T細胞的特異性已通過與所說肽在體外接觸而產(chǎn)生。
27.如權(quán)利要求25或26所述的制劑，其中所說的T細胞已經(jīng)在體外產(chǎn)生了對權(quán)利要求1所述的肽的特異性。
28.一種醫(yī)藥組合物，包含一種如權(quán)利要求1所述的肽及一種藥物學上可接受的載體。
29.如權(quán)利要求28所述的一種醫(yī)藥組合物，用于預(yù)防和治療IDDM。
30.如權(quán)利要求28或29所述的醫(yī)藥組合物，其中所說的肽是權(quán)利要求2所述的肽。
31.如權(quán)利要求28或29所述的醫(yī)藥組合物，其中所說的肽是權(quán)利要求3所述的肽。
32.如權(quán)利要求1至3中任何一項所述的肽在制備用于治療IDDM的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明披露了一些新型肽類,為人60KDa熱激蛋白(hsp60)的一些表位(抗原決定簇),可用于診斷和治療胰島依賴性糖尿病(IDDM)。還披露了含這些肽的醫(yī)藥組合物,和用于診斷IDDM的試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK1193889SQ96196403
公開日1998年9月23日 申請日期1996年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月30日
發(fā)明者伊倫·R·科恩, 戴娜·埃利亞斯, 里夫卡·阿布拉菲亞, 亞娜·博茨科娃 申請人:耶達研究與發(fā)展有限公司